 * |   |
|
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда |  Zbio-wikiNG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: |
|
Правила
* Дрожжевые кодоны -- и экспрессия в животных клетках --
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.
   |
 imersУчастник Москва  |
 08.05.2005 22:33
 Мне нужно прокэспрессировать (и не просто так, а наработать побольше) в животных клетках 2 цепи IgG и получить на выходе в среде работающие антитела. Все хорошо получалось, но вот сейчас мне поступили новые вектора, где последовательности проклонированных цепей антител были оптимизированы под экспрессию в дрожжах, т.е., вроде бы, содержат "дрожжеспецифичные" кодоны. Сиквенса ДНК у меня, к сожалению, нет - проанализировать частоту необычных кодонов не могу. Вопрос: наличие в последовательности ДНК редких для животных клеток кодонов может сказаться на эффективности экспрессии белка? И если да - то насколько серьезно? Может ли по этой причине выход продукта упасть в несколько раз, или всего лишь на 20-50%? Влияет ли также и частота встречаемости таких кодонов в последовательности? Клетки - 293t и CHO, метод введения ДНК - трансфекция с липофектамином, ДНК очищена в градиенте цезия. В "положительном контроле" (с др. векторами) продукция АТ нормальная. Заранее весьма признательна за помощь! |
|
guest-n Участник |
10.05.2005 22:04
(imers @ 08.05.2005 23:33)  Все хорошо получалось, но вот сейчас мне поступили новые вектора, где последовательности проклонированных цепей антител были оптимизированы под экспрессию в дрожжах, т.е., вроде бы, содержат "дрожжеспецифичные" кодоны. А сами "новые вектора" - векторы для животных клеток или дрожжевых, например, Pichia pastoris? Регулируемый промотор, репликатор?
|
|
imers Участник Москва |
11.05.2005 01:28
Но интересно все-таки теоретически: влияют "редкие" кодоны на эффективность экспрессии, или нет, и если да - то как сильно? Может, кто-нибудь сталкивался или где-то натыкался в публикациях? Мне почему-то кажется, что сильно тормозить не должно - во всяком случае, не должно приводить к снижению выхода в 5 раз. Каюсь, поторопилась задать вопрос, не дожидаясь повторных результатов. Сообщение было отредактировано imers - 14.05.2005 18:34 |
|
imers Участник Москва |
14.05.2005 18:32
Переделала. Проверила плазмиды, используемые для трансфеции, и их концентрацию на форезе (нерезанные - суперскрученные, как и должны быть, а концентрацию смотрела по "линейке" после рестрикции). Клетки вели себя хорошо. Микоплазм на клетках нет - проверено ПЦР 32 цикла с выделенной по-честному ДНК. Выход антител в этот раз получше, но все равно много меньше обычного. Выяснила про вектор: промотор CMV, а редкие для Homo sapiens кодоны во вставке составляют ~4% (анализировали, не мудрствуя лукаво, в форме для поиска редких кодонов на этом сайте). Так и не знаю - имеет ли это значение, но процент редких кодонов весьма невелик. Прогнала несколько CDSов нормальных человечьих генов - там редкие кодоны вообще не встретились. В общем, понимай, как знаешь 
|
|
guest-n Участник |
14.05.2005 20:47
Вы собираетесь ставить мутагенез? Но у Вас нет последовательности. Собираетесь отказаться от наработки? "Казенных" способов решения я не знаю... 4% - это просто цифра. Если у Вас в последовательности два редких кодона подряд, то они и останавливают трансляцию. Классический пример для коли - это два ССС-кодона, два пролина в эукар. последовательности. Кодоны есть подробно в Казуза Ресотч Инститют http://www.kazusa.or.jp/eng/index.html Kazusa DNA Research Institute http://www.kazusa.or.jp/codon/index.html Но чем это Вам поможет. Я сам ни разу не выращивал, но консультировал практических людей, столкнувшихся с подобными проблемами. Проблемы на искусственных последовательностях, используемых не в тех хозяевах были. В том числе и сходном с вашим случае. Если у Вас будет последовательность, лучше не очень длинная, могу посмотреть. У вас мини антитела или полные?
|
|
imers Участник Москва |
14.05.2005 21:29
Мини-антитела - это когда из одной цепи? То, что в онкологии популярно? В этом смысле - наши полноразмерные, состоят из двух цепей, и вариабельный, и видоспецифичный Fc-концы присутствуют. Просто теперь, зная, что продукция в этом случае будет снижена, я не буду мучиться и искать ошибку в ведении культуры и постановке трансфекции, и изводить дорогие реактивы на ее оптимизацию (при том, что на других векторах все работает), а буду просто ставить бОльшие объемы клеток, чтобы получить тот же выход по продукту. Ну, и на будущее попрошу избегать таких последовательностей. Так что Вы мне очень помогли, еще раз спасибо! Сообщение было отредактировано imers - 14.05.2005 21:32 |
|
Guest IP-штамп: frNVjPT6S76SU гость |
17.05.2005 18:24
(imers @ 14.05.2005 21:29) Мини-антитела - это когда из одной цепи? То, что в онкологии популярно? Да, я имел ввиду именно "одноцепочечные" миниантитела. (imers @ 14.05.2005 21:29) Так что Вы мне очень помогли, еще раз спасибо! Ну, Вы сами во всем разобрались. Так что принимаю "спасибо" только за моральную поддержку. Удачи Вам. |
|
Tony M. IP-штамп: frrljE6ew/GVk гость |
 25.08.2020 06:34
|
|
restrict |
28.08.2020 11:51
-------------------- Это зависит от класса кодонов - синонимы или не синонимы. Если не синонимы, т.н. СИОМы (гибриды СИнонимов и ОМонимов), то можете экспрессировать не тот белок. Подробно об этом в БЕСЕДЕ, в теме ПЕРЕКОДИРОВКИ КОДОНОВ. |
|
restrict |
28.08.2020 11:55
|
|
watchesbiz Постоянный участник |
12.10.2021 17:30
? |
|
watchesonline89 Постоянный участник |
25.12.2022 09:09
|
| « Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |
 |
· Викимарт - все интернет-магазины в одном месте · Доска объявлений Board.com.ua ·
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---
Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Powered by Invision Power Board(Trial) v2.0.0 © 2024 IPS, Inc.