molbiol.ru -> помогите с советом

> Все форумы > Тематические форумы > Молекулярная и клеточная биология

Zbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ

Правила FAQ* Поиск* Участники* Календарь* Избранные темы* Форум Форумов*

Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ]

Форум:

* помогите с советом

Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.

Vlad24

04.09.2003 14:53

URL #1

Вот недавно занесло меня в молекулярную биологию. Я больше биохимией занимался. Начал с RT-PCR. Возникла проблема с интерпретацией данных. В качестве наус-киппинга использовал праймеры на ген глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (в-актин в моей системе не может быть использован). Получилось, что интенсивности полос в контроле и опытных точках отличаются. То есть получается, что это не совсем удачный хаус-киппинг или я не прав? Правомерно ли будет сравнивать экспрессию целевого гена, если я буду нормировать на такой хаус-киппинг? Мне предлагали спецы изменить объемы кДНК, используемой для ПЦР. Скажем, взять 2 мкл в контроле, 1.5 мкл опытной точке и т.д. Тогда получатся бэнды одной интенсивности в случае хаус-киппинга. А если нет, то нужно варьировать объем вносимой кДНК. Мне кажется, что это совершенно неправильно. Посоветуйте, пожалуйста, что делать в таком случае?

Gobochka
Постоянный участник

04.09.2003 15:50

URL #2

если есть отличия в интенсивности Х-К, то можно поменять его на 18S или GPDH, например. но если вы пцр начали недавно делать, то скорее всего проблема не в Х-К genes, а в не одинаковом изначальном кол-ве RNA в ваших samples. на вашем месте я бы сделала ещё раз РТ-ПЦР. на вашей картинке вы видите результат амплификации, по ней очень трудно установить на сколько нужно уменьшить колво ДНА. и все эти 1.5 мкл- это гадание на кофейной гуще. в любом случае вы должны добиться чтобы Х-К гене во всех samples выглядел одинаково.

04.09.2003 16:34

URL #3

С нормированием - всегда проблемы. Во-первых, измерили ли Вы концентрацию исходных РНК, чтобы точно знать, что в RT Вы внесли одинаковые количества. Во вторых, не надо думать, что "хаузкипинги" всегда одинаково экспрессируются. См. например
J Soc Gynecol Investig 1997 Nov-Dec;4(6):284-92
Pregnancy induces an increase in the expression of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase in uterine artery endothelial cells.
Cale JM, Millican DS, Itoh H, Magness RR, Bird IM

Разумный совет был - нормировать по рибосомальным РНК.

Vlad24

04.09.2003 16:41

URL #4

Gobochka, спасибо за ответ!
Концентрацию РНК определил спектрофотометрически, затем для RT стадии взял одинаковое количество РНК во всех условиях.

Vlad24

04.09.2003 16:46

URL #5

Концентрацию РНК измерил.
Об экспрессии хаузкипингов я думал. актин сразу отверг, поскольку для моей сиситемы он точно не походит. GPDH похоже тоже менятся.
Если хаузкиппинги эксприссируются неодинаково, то как быть. Искать другие?

Vlad24

04.09.2003 16:46

URL #6

Концентрацию РНК измерил.
Об экспрессии хаузкипингов я думал. актин сразу отверг, поскольку для моей сиситемы он точно не походит. GPDH похоже тоже менятся.
Если хаузкиппинги экспрессируются неодинаково, то как быть?Искать другие?

Gobochka
Постоянный участник

04.09.2003 16:49

URL #7

попытайтесь ещё раз измерить RNA, бывает, что он плохо растворяется. сделайте хорошую пипетацию вашему RNA и ещё раз измерьте, и ещё раз сделайте РТ-ПЦР.

Gobochka
Постоянный участник

04.09.2003 16:54

URL #8

да, нужно искать другие.

или сделать real-time пцр с разными Х-К, но если у вас никто из соседей не делает, то слишком дорого будет эта затея. даже знаете что, можно и без Х-К real time делать, просто определить действительно ли все samples одинаковые, если вам разрешат , конечно. попросите присоединиться, если место на плате остаётся.

Gobochka
Постоянный участник

04.09.2003 17:18

URL #9

ещё один маленький тип, мы берём 2мкг на РТ-ПЦР, но вначале мы из стока готовим другой стоковый р-р с концентрацией RNA 0.5 мкг/мкл (из него потом берём примерно 4 мкл, это понятно), так вот этот р-р (0.5мкл) мы ещё раз проверям на спектрофотометре и из этой конц. расчитываем сколько брать на РТ-ПЦР.

Vlad24

05.09.2003 14:13

URL #10

Спасибо! Я как раз так и определял концентрацию РНК для надежности. Даже еще проверил на другом спектрофотометре. Все совпало. Сегодня попробую все повторить. Причем для проверки отдал свою кДНК приятелю. У него получилось, что ХК меняется. Как и у меня. Еще взял праймеры на рибосомальный протеин L30.С ним получилось получше. Хотя мне кажется, что есть отличия.

Replica Omega Watches
IP-штамп: frKBFDtbK.RO6
гость

12.05.2023 10:51

URL #11

products Replica Hamilton Watches have avantgarde Replica Shirt design , which can Replica Roger Dubuis Swiss Watches make Replica Crossbody Bags you look Replica Baume Mercier Watches stylish and modern in any occasion.Numerous Replica Blancpain Swiss Watches returned Replica Chaumet Watches customers Replica Porsche Design Watches possess a passion to enjoy probably replica ysl womens bag the replica givenchy sneakers replica louis vuitton wallets most product good carbide inserts because Replica Zenith Swiss Watches of Replica Jackets their super quality but Replica Dior Bags Replica Longines Swiss Watches lowest price.

Sdmt Insert
IP-штамп: frcAAOGkyOCtc
гость

28.06.2023 12:00

URL #12

products threading insert are cute. We CNMM Inserts are high feed milling insert glad parting tool inserts to give VNMG Cermet Inserts you http://worthy.blog.jp/ the opportunity to Buy product best carbide inserts cemented carbide inserts for a very accessible price.We only sell first-class product that are deep hole drilling inserts carefully sourced from surface milling inserts manufacturers that must comply CCGT Inserts with our stringent quality control standards.

Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.

Имя:

Отправка сообщений использует JavaScript операции. В вашем броузере не
установлено/отключено выполнение JavaScript программ. Используйте Netscape Navigator
или Internet Explorer (не ранее 3 версии); убедитесь, что выполнение JavaScript
программ разрешено в настройках вашего броузера.