Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
V.A. |
Пока мучаюсь с ПЦР длинных фрагментов, транслокация c-myc/Ig H. реакция вроде проходит, четко видны бенды контрольного гена (c-myc), а вот с транслокацией ничего не выходит: много неспецифических бендов, так что не понять где нужный. Подскажите что делать. (Праймеры брали из статьи) |
Noom Постоянный участник |
|
genseq Постоянный участник |
Дайте ссылку или последовательности. |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(V.A. @ 05.05.2011 15:30) Здравствуйте! Собираемся наладить в лаборатории диагностику МРД при лимфоме Беркитта методом ПЦР. Может кто-то уже разработал методику и немного в этом разбирается. Прошу откликнуться. Пока мучаюсь с ПЦР длинных фрагментов, транслокация ц-мыц/Иг Х. реакция вроде проходит, четко видны бенды контрольного гена (ц-мыц), а вот с транслокацией ничего не выходит: много неспецифических бендов, так что не понять где нужный. Подскажите что делать. (Праймеры брали из статьи) замучутесь все "транслокации беркутов мерють" эта транслокация не единственная у беркутов и урядли поможет при диагностике |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
|
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(V.A. @ 05.05.2011 16:30) Здравствуйте! Собираемся наладить в лаборатории диагностику МРД при лимфоме Беркитта методом ПЦР. Может кто-то уже разработал методику и немного в этом разбирается. Прошу откликнуться. Пока мучаюсь с ПЦР длинных фрагментов, транслокация c-myc/Ig H. реакция вроде проходит, четко видны бенды контрольного гена (c-myc), а вот с транслокацией ничего не выходит: много неспецифических бендов, так что не понять где нужный. Подскажите что делать. (Праймеры брали из статьи) Не очень понятно в чем будет заключаться "диагностика МРД при лимфоме Беркитта методом ПЦР"? Поясните про "Методику". плз. |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(-Ъ- @ 09.05.2011 22:32) Не очень понятно в чем будет заключаться "диагностика МРД при лимфоме Беркитта методом ПЦР"? Поясните про "Методику". плз. |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
Genome-wide analysis reveals novel molecular features of mouse recombination hotspots. Smagulova F, Gregoretti IV, Brick K, Khil P, Camerini-Otero RD, Petukhova GV. Source 1] Uniformed Services University of the Health Sciences, Bethesda, Maryland 20814, USA [2]. Abstract Meiotic recombination predominantly occurs at discrete genomic loci called recombination hotspots, but the features defining these areas are still largely unknown (reviewed in refs 1-5). To allow a comprehensive analysis of hotspot-associated DNA and chromatin characteristics, we developed a direct molecular approach for mapping meiotic DNA double-strand breaks that initiate recombination. Here we present the genome-wide distribution of recombination initiation sites in the mouse genome. Hotspot centres are mapped with approximately 200-nucleotide precision, which allows analysis of the fine structural details of the preferred recombination sites. We determine that hotspots share a centrally distributed consensus motif, possess a nucleotide skew that changes polarity at the centres of hotspots and have an intrinsic preference to be occupied by a nucleosome. Furthermore, we find that the vast majority of recombination initiation sites in mouse males are associated with testis-specific trimethylation of lysine 4 on histone H3 that is distinct from histone H3 lysine 4 trimethylation marks associated with transcription. The recombination map presented here has been derived from a homogeneous mouse population with a defined genetic background and therefore lends itself to extensive future experimental exploration. We note that the mapping technique developed here does not depend on the availability of genetic markers and hence can be easily adapted to other species with complex genomes. Our findings uncover several fundamental features of mammalian recombination hotspots and underline the power of the new recombination map for future studies of genetic recombination, genome stability and evolution. |
V.A. |
Разрабатываем дианостику МРД у больных ЛБ пока с t(8;14). В статье у них все хорошо получается, пыталась делать все по статье, но ПЦР вообще не идет. Пытаюсь подобрать другие условия. Увеличила температуру отжига до 75 С и время элонгации до 10 мин, вроде неспецифика ушла, но исчез и один из контрольных генов. |
genseq Постоянный участник |
|
RJ Dio Постоянный участник |
Кстати, отжиг на 75гр- нонсенс, если сама полимераза работает на 72! Выше 68 вообще нет смысла задирать, а формула стандартная перестает работать. Пробуйте иные структуры олигов
|
genseq Постоянный участник |
(V.A. @ 11.05.2011 09:48) Ссылка на статью Разрабатываем дианостику МРД у больных ЛБ пока с t(8;14). В статье у них все хорошо получается, пыталась делать все по статье, но ПЦР вообще не идет. Пытаюсь подобрать другие условия. Увеличила температуру отжига до 75 С и время элонгации до 10 мин, вроде неспецифика ушла, но исчез и один из контрольных генов. Вот ещё пара ссылок. Правда, не на праймеры: Сообщение было отредактировано genseq - 11.05.2011 18:52 Файл/ы:
|
genseq Постоянный участник |
Обнаружил статью с анализом распределения точек разрыва в гене myc: Судя по картинке, большинство используемых Вами праймеров захватывают много лишнего (829; 1611; 2410; 3250; 4458; 4885; 8151). Для большинства транслокаций можно подобрать 2...3 праймера, которые при любом раскладе будут давать ампликоны длиной меньше 1...2 т.п.о.. P.S.: спасибо Tom1 за оперативность. Он прислал статью почти сразу после моего запроса на Full text. Сообщение было отредактировано genseq - 11.05.2011 21:04 Файл/ы:
|
RJ Dio Постоянный участник |
|
RJ Dio Постоянный участник |
|
-Ъ- Постоянный участник Москва |
|
genseq Постоянный участник |
Информация к размышлению: При лимфомах рецидивы болезни после химиотерапии необходимо отслеживать на самых ранних стадиях, т.е. обнаруживать одиночные мутантные клетки на фоне большого количества нормальных. Это и есть MRD (minimal residual disease). Онкогенные мутации чрезвычайно разнообразны и за всеми не уследить, но при особо злобной лимфоме Беркитта довольно часто их маркёрами могут служить транслокации, повреждающие ген myc в результате обмена плечей 8 и 14 хромосом - t(8;14). Основной причиной транслокаций являются ошибки системы рекомбинации, обеспечивающей многообразие вариабельных участков тяжёлых цепей иммуноглобулиной. Чаще всего такая рекомбинация происходит в четырёх компактных локуса (условно - 01, 02, 03 и JH), но при незаконной рекомбинации "половинки" эти локусов могут стыковаться с другими хромосомами довольно произвольно. Если стыковка повреждает myc или какой-либо другой важный ген, и если одна из аллелей уже повреждена (имеется генетическая предрасположенность к онкологическим заболеваниям), то это может привести к развитию лимфомы. Наиболее прогрессивный подход - секвенирование участка стыковки хромосом и подбор для каждого пациента индивидуальной пары праймеров. Менее прогрессивный, но более дешёвый - использование набора стандартных праймеров, у которых есть шанс захватить участок стыковки хромосом. Чем длиннее ампликоны, тем выше шансы, поэтому желательно использовать Long Distance PCR. Но добиться высокой специфичности LD PCR при высокой концентрации геномной ДНК очень сложно. Возможное решение - уменьшить длину ампликонов и повысить специфичность праймеров. Это немного уменьшит шансы захвата точки рекомбинации хромосом, но лучше так, чем никак. Но можно и без жертв, если проверять больше ампликонов, но меньшей длины. Если есть желание поиграться с не литературными праймерами, то могу подобрать. |
RJ Dio Постоянный участник |
|
genseq Постоянный участник |
DNA file: MYC.SEQ [10996] >gi|11493193|emb|X00364.2| Homo sapiens MYC gene for c-myc proto-oncogene and OPTIMAL ANNEALING TEMP.: 61.9° Product length: 1003 bp; 59.0% GC Tm(prod.-less stable primer): 21.0° Primers Tm difference: 0.5° Upper:1983 (26) ->------- Lower:2962 (24) -------<- 3'-ends dG: U=-6.7 L=-6.4 ╔═══════╤════════╤════════╤════════╤══════╗ ║ Oligo │ Tm [°C]│ nmol/OD│ µg/OD'│ Mr ║ ╠═══════╪════════╪════════╪════════╪══════╣ ║ Upper │ 62.4│ 4.13│ 32.9│ 7961║ ║ Lower │ 61.9│ 3.85│ 29.2│ 7598║ ╚═════════════════════════════════════════╝ OPTIMAL ANNEALING TEMP.: 61.5° Product length: 1557 bp; 57.0% GC Tm(prod.-less stable primer): 20.0° Primers Tm difference: 0.5° Upper:1983 (26) ->------- Lower:3515 (25) -------<- 3'-ends dG: U=-6.7 L=-6.1 ╔═══════╤════════╤════════╤════════╤══════╗ ║ Oligo │ Tm [°C]│ nmol/OD│ µg/OD'│ Mr ║ ╠═══════╪════════╪════════╪════════╪══════╣ ║ Upper │ 62.4│ 4.13│ 32.9│ 7961║ ║ Lower │ 61.9│ 4.30│ 32.5│ 7565║ ╚═════════════════════════════════════════╝ > UPPER PRIMER: Positive strand of MYC.SEQ, pos. 1983: TCCGCCTGCGATGATTTATACTCACA > LOWER PRIMER: Negative strand of MYC.SEQ, pos. 2962: AGCGCAGGAATGGGAGAAAAGACA > LOWER PRIMER: Negative strand of MYC.SEQ, pos. 3515: GCCTACCCAACACCACGTCCTAACA Сообщение было отредактировано genseq - 14.05.2011 07:50 |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(RJ Dio @ 12.05.2011 11:05) да уж, праймеры дизайнить- не форезницы лепить! Все могем, едренть, как Леонардо наш, не побоюсь этого слова, Да Винчи- и велосипед с вертолетом изобретать. и картины писать, и наукой заниматься и еще бездну всего-всего. И секвенить, и диагностикумы делать, и задачки сложные тонким перышком в тетрадь. Это ведь наверняка далеко не все- и грибочки мариновать, и рыбку поудить, и в форуме помодерировать. А стихи, во- стихи не пишите? Помогу с изданием нетленки Ты скоро автограф у Генсека будешь просить, так чта... |
nigoal123 IP-штамп: frY/5Vmfd77P. гость |
your social media channels |
thomaslist Участник |
|
Mala636 Постоянный участник Lahore, Punjab, Pakistan |
|
Ufa1688 Постоянный участник |
|
guest: 123vega IP-штамп: frXqkB4MpP2jQ гость |
|
Ufa1688 Постоянный участник |
|
Ufa1688 Постоянный участник |
|
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |