не уверен насчет развала, часто так выглядит РНК. При этом ДНК вполне может выть, и много, ее просто не видно, весь этидий всосала РНК. Либо погоните подольше, либо РНКазу добавьте. посмотрите. что будет

  Я не думаю что произошел развал.Возмите ваш плавник тщательно разотрите и лизируйте новым SDS и сразу внесите на форез.Я думаю вас ждет приятный результат))

  а почему племянничек-то?

  у вас тут дофига РНК, которая берёт на себя весь этидий. Можете попробовать уже после прогона гель проинкубировать с этидием. Но если РНК уж совсем-совсем дофига, то оно и общую картину миграции будет искажать. В общем, с выделением у вас косяк - РНКазу-то добавляли вообще?

  Не будет. Пцрьте на здоровие.

  разрушается-то она (РНК) конечно, разрушается, но подумайте, сколько ее там, и до каких фрагментов разрушается? Вот она разрушенная в кол-ве 1 тонна и имеется у Вас в образце. РНКазить надо непременно. Иначе Вы ПЦР не поставите, и не потому, что не пойдет, а потому, что неизвестно сколько ДНК Вы берете на старт, по форезу ничего сказать нельзя. Чистите препарат, тогда все вопросы отпадут сами собой

  
-В каждую пробу солевой буфер(Вода, 1М TrisHCl, 0,5M EDTA,NaCl) +  протеиназа К (10 мг/мл) + 20% SDS + РНК-аза А.

  Вообще, что за привычка - форезить ДНК?
Вам 5 тыс. пар поднять надо? Или доктор прописал?

  Вообще, что за привычка - форезить ДНК?
Вам 5 тыс. пар поднять надо? Или доктор прописал?

  А почему бы и нет?

  посмотрите внимательно на картинку. Все в порядке, в смысле, с ДНК. Где РНК поменьше- там ДНК вроде как побольше. Дело как раз в том, что этидий выелся РНКой, на ДНК не хватает. Убрать РНК (просто добавить ДНКаза free РНКазу А) и сразу счастье будет

  На какой стадии выделения лучше добавлять и в каком количестве? Для выделения ДНК мы используем следующий протокол:
1.Гомогенезируем в 260 µl буфера (25mM ЭДТА, 75mM NaCl, 10mM Tris [pH 7,5]), добавляем 30µl 10% SDS и 10-15 µl раствора протеиназы К (20µg/µl).
2.К лизату добавляем 2/3 объёма  6 M насыщенного раствора NaCl.
3. Преципитацию ДНК проводим 96-% этанолом, затем "отмываем" 70-%-м этанолом 2 раза.Высушиваем.
4. Растворяем ДНК в 100µl ddH2O.

  На этой стадии:
"4. Растворяем ДНК в 100µl ddH2O."

добавить РНКазу А в вашу ДНК;
растворять лучше в 1хТЕ, а не в ddH2O, и растворять ДНК в растворе с РНКазой А.
Количество РНКазы А, "на глаз". Предположительно, 1 нг РНКазы А на 1 мл раствора.

  Спасибо! Обязательно попробуем! А переосаждать потом ДНК не надо будет снова?

  Как хотите, можно и не переосаждать, если ваш ПЦР не ингибируется большим количеством РНК.

Но если переосаждать, то можно с равным объемом изопропанола, и соль добавьте, например до 0.3 М ацетата натрия.

  А в РНКазе не может быть примесей ДНКазы, которая тогда все съест? Если долго хранить, даже очень небольшие ее количества все погубят.

  А как узнать ингибируется ли или нет наша ПЦР большим количеством РНК? И, если ингибируется, то именно ли  РНК, а ни чем то другим?

  Высокая концентрация нуклеиновых кислот ингибирует ДНК полимеразу.
На ваших гелях: РНК у вас много, а ДНК может быть и не так уж много.
Я бы переосадил ДНК, особенно, если ПЦР вы будете делать много раз и ДНК вам будет нужна и в будущем.

Вообще-то, у вас не очень продвинутый метод выделения ДНК.
Можно выделять СТАВ буфером ДНК из растений и животных тканей и сразу добавлять РНКазу А, чтобы РНКаза А поела РНК до осаждений ДНК.

Можно выделять ДНК в присутствии гуанидинтиоционата и протеиназы К.

ДНКазы ингибируются присутствием ЭДТА в растворе ТЕ, и условиями хранения.

  Благодарю за ценные советы. А в чем СТАВ-метод продвинутее солевой экстракции?

  Но, производители, вроде бы, гарантируют отсутствие ДНКаз? Что хранить и что погубят - поясните?

  А как бы вы прокомментировали это фото - результат выделения геномной ДНК? Есть ли здесь ДНК (ну кроме, 6 образца конечно )?
Мышечная ткань рыб (за искл. №6 - это млекопитающее) хранилась в замороженном виде (-20С). ДНК выделяли путем солевой экстракции.
Форез в 1% агарозе, бром.этидий, 5 мкл образца. Старт 40В (20 мин), потом 80В (40 мин).

  Спасибо за комментарий. А на каком этапе выделения лучше использовать РНКазу? И какую лучше?

Вот, кстати, фото фореза геномной ДНК при тех же самых условиях, но только для выделения использовались образцы, фиксированные в этаноле. Заслуживают внимания 5,6 и 7 образцы. Там и ДНК есть, и РНК (даже, вроде бы, в виде полос?).

  1нг/мл  маловато будет. 10-100мкг/мл
ДНКазу в РНКазе легко убить простым выдерживанием раствора РНКазы 20' на кипящей водяной бане. РНКазу нельзя использовать с SDS.

после РНКазы используем протеиназу К, которая и должна поесть РНКазу и инактивиррованную ДНКазу и вообще все белки, включая самую себя.

  А от протеиназы К как избавляться? Кипятить 10-20 мин и окончательно доконать ДНК.  
Протеназа К саму себя не любит есть - это природа так распорядилась.

  По мне, у вас там нет никакой РНК, а только порванная ДНК... Из протухшей "мышечной ткани" рыбы (до морозильника рыба где-то обязательно валяется ) РНК сложно выделить... А ПЦРить короткие фрагменты с этими образцами можно при условии, что нет ингибирования в реакции. Допотопный метод в неочумелых руках требует дочистки НК на колонках... Просто берете и тупо очищаете и ставите ПЦР. А остатки РНК, если они есть, наоборот будут облагораживать реакцию.

  Если добавить CaCl2 то протеиназа К не будет себя "кушать", но без кальция будет, но не сразу.

http://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%9F%D1%80%...0%D0%B7%D0%B0_K

  Попробуйте поставить ПЦР  с матрицей "как есть". Сделать 10кратное разведение проб, на крайняк.