Rambler's Top100
Лёгкая версия форума* Виртуальная клавиатура  English  
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы
Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Междисциплинарный биологический онлайн-журналZbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ


Темы за 24 часа  [ Вход* | Регистрация* ]  
   



Форум: 
 

Щёлкните, чтобы внести в Избранные Темы* Достройка 1 цеп. ДНК до 2-цеп -- Помогите, кто чем может --
ИнтерЛабСервис - передовые технологии молекулярной диагностики
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.


 
Добавить сообщение в темуСоздать новую темуСоздать голосование
Участник оффлайн! Chertiaka




 прочитанное сообщение 02.11.2016 17:18     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #1 множественное цитирование

Добрый день, коллеги.

В ходе моей работы возник следующий вопрос, а возможно ли каким-либо образом, имея на руках раствор с фрагментами одноцепочечной ДНК достроить их до 2х цепочечных варианта? Иначе говоря, достроить комплиментарную цепочку для каждого фрагмента? Желательно, без дополнительных мутаций и пр.
Возможно, есть какие-либо киты для подобного?

Буду рада любой помощи.
Участник оффлайн! ship
Постоянный участник
Moscow



 прочитанное сообщение 02.11.2016 18:00     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #2 множественное цитирование

последовательность известна? длина какая? что это вообще за ДНК?
а еще лучше скажите какая цель работы?

проще заказать синтез комлиментарных олигов.
можно поставить ПЦР и заново сделать все фрагменты.
Участник оффлайн! MMM
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 02.11.2016 18:06     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #3 множественное цитирование

При наличии затравки в виде комплементарного короткого праймера вторую цепь будет достраивать фрагмент Кленова и Taq-полимеразв(это такие ферменты)
Участник оффлайн! Chertiaka




 прочитанное сообщение 02.11.2016 18:08     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #4 множественное цитирование

В том-то и дело, что известна только длина. =( Последовательность точная - неизвестна.

Дело в том, что были заказаны праймеры для ПЦР, которые оказались не рабочими. Причем, несколько раз. Хотим выяснить, хотя бы для себя, это ошибка в самих праймерах (возможно не то синтезировали, или с мутациями) или в процессе самом - хотя раньше все работало.

Сами олиги, получается, не более 30 нуклеотидов длиной. И не комплиментарные друг другу.
Участник оффлайн! ship
Постоянный участник
Moscow



 прочитанное сообщение 02.11.2016 18:45     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #5 множественное цитирование

как вы определяли что праймеры не рабочие?
что еще поменялось по сравнению с "раньше все работало"?

закажите олиги в другом месте, например. у кого эти заказывали? если Синтол - то могут быть с ошибками. но два раза подряд - это вряд ли.

но я вам даю 100% гарантию - что косяк в вашей работе, а не в праймерах.
Участник онлайн! genseq
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 02.11.2016 19:10     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #6 множественное цитирование

А праймерные последовательности проверяли? Если не задумываясь взяли из статьи или из баз данных, то можно нарваться на полную безграмотность разработчиков или даже на откровенную подлянку.
Участник оффлайн! Flyamer
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 02.11.2016 20:21     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #7 множественное цитирование

Можно навесить поли-А терминальной трансферазой (https://www.neb.com/products/m0315-terminal-transferase), а потом поли-Т праймером сделать вторую цепь.
Участник оффлайн! Chertiaka




 прочитанное сообщение 03.11.2016 10:28     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #8 множественное цитирование

ship, именно в Синтоле и заказывали. По последовательностям изначально все в порядке, как и по протоколу ПЦР - другие праймеры отжигаются успешно по тому же протоколу. Попробуем перезаказать, спасибо.

genseq, проверяли. =/ В том и основная проблема. Ощущение, что доп мутации внесли в праймер, так что те свернулись шпилькой или еще как. А доказать это никак не можем. =/

Flyamer, а это выход! Спасибо! Постараемся найти заявленную трансферазу и поставить достройку второй цепи! =) Думаю, это реальный выход.
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 03.11.2016 11:06     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #9 множественное цитирование

Несколько раз перечитал - ничего не понял, в чем проблема!
пересинтез... да хоть сто раз, не поможет no.gif . И при чем тут Синтол (что-то не так - сразу косой! smile.gif ). Самый простой синтез, никакой экзотики. На 100% уверен с праймерами все в порядке.
Не морочьте людям голову и объясните сначала что это за "раствор с фрагментами одноцепочечной ДНК"... frown.gif Что к чему "комплиментарно"? И для чего все это? Клонировать собираетесь?
Участник оффлайн! dk
Постоянный участник
Россия



 прочитанное сообщение 03.11.2016 12:24     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #10 множественное цитирование

Извините, но тоже не понял суть работы. Вы предполагаете "ошибки синтеза" - но чтоб 2 раза да так наврали в последовательностях... Честно сказать, с трудом представляю - как надо налажать при синтезе олигов, чтоб они "свернулись шпилькой или ещё как".
Ну ладно - Вы хотите достроить компл.цепь для праймера. Хорошо, а дальше-то что? Клонировать в вектор и на сиквенс? ИМХО, очень уж заморочно, чтоб проверить верно ли синтезирован праймер. По времени и цене проще заказать олиги в другой компании, например в Еврогене, чтоб ещё раз всё проверить.
И ещё, я так и не понял - праймеры именно с этой последовательностью именно у Вас раньше нормально работали - а теперь нет? Или Вы ориентируетесь только на литературу?
Участник оффлайн! ship
Постоянный участник
Moscow



 прочитанное сообщение 03.11.2016 13:01     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #11 множественное цитирование

(Chertiaka @ 03.11.2016 08:28)
Ссылка на исходное сообщение  ship, именно в Синтоле и заказывали. По последовательностям изначально все в порядке, как и по протоколу ПЦР - другие праймеры отжигаются успешно по тому же протоколу. Попробуем перезаказать, спасибо.

то что другие праймеры отжигаются и работают не означает, что эти праймеры тоже должны работать.
для начала перепроверьте все. найдите положительный контроль например.
вообще как тут уже написали непонятно что вы вообще делаете и зачем вам праймеры.
исходя из этого и будет понятно насколько сильно надо заморачиватся.

что касается Синтола- за 4 месяца три раза накосячили в праймерах (в середине праймера нет буквы, что потом мной было выявлено по сиквенсу ПЦР продуктов). сейчас такой же косяк у коллег выявился, нет 2х букв в середине праймера). Ко всему этому- отсутствие вменяемого общения и сервиса.
Мы благополучно ушли в Евроген, и вспоминаем о Синтоле как о страшном сне. К тому же в Еврогене дешевле.
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 03.11.2016 16:50     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #12 множественное цитирование

(ship @ 03.11.2016 14:01)
Ссылка на исходное сообщение 
что касается Синтола- за 4 месяца три раза накосячили в праймерах (в середине праймера нет буквы, что потом мной было выявлено по сиквенсу ПЦР продуктов). сейчас такой же косяк у коллег выявился, нет 2х букв в середине праймера). Ко всему этому-  отсутствие вменяемого общения и сервиса.
Мы благополучно ушли в Евроген, и вспоминаем о Синтоле как о страшном сне. К тому же в Еврогене дешевле.

Как такое возможно при современных способах передачи инфы confused.gif . Неужели вручную набирается последовательность для подачи на синтез. no.gif
Трудно верится...
Участник оффлайн! ship
Постоянный участник
Moscow



 прочитанное сообщение 03.11.2016 17:17     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #13 множественное цитирование

(-Ъ- @ 03.11.2016 14:50)
Ссылка на исходное сообщение  Как такое возможно при современных способах передачи инфы confused.gif . Неужели вручную набирается последовательность для подачи на синтез. no.gif
Трудно верится...

мне кажется дело не в информации, а в синтезе, потому что в паспорте олига последовательность правильная.

*




Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.
Имя:

 преобразовывать смайлики · показать смайлики
Назначение кнопок:

   Поблагодарить автора сообщения — поблагодарить автора
   Удалить сообщение — удалить
   Редактировать сообщение — редактировать
   Поместить сообщение в колонку новостей — поместить в колонку новостей
   Цитировать — цитировать сообщение
   не входит в цитирование/входит в цитирование — цитировать несколько
   Отметить СПАМ-сообщение — обозначить спам
   Сообщение для модератора — связь с модератором
   Участник онлайн!/Участник оффлайн! — автор онлайн/оффлайн
   Фотография — фотография автора

   - остальные обозначения -
 
   *
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема »
Быстрый ответДобавить сообщение в темуСоздать новую тему

Rambler   molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов              

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Ваш форум  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама  ·  Дата и время: 18.02.20 18:59
Bridged By IpbWiki: Integration Of Invision Power Board and MediaWiki © GlobalSoft