molbiol.ru -> Выделение РНК из пробирок PAXgene c помощью TRIsola

> Все форумы > Тематические форумы > Молекулярная и клеточная биология

Zbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ

Правила FAQ* Поиск* Участники* Календарь* Избранные темы* Форум Форумов*

Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ]

Форум:

* Выделение РНК из пробирок PAXgene c помощью TRIsola -- проблемы с выходом --

Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.

Star
Постоянный участник
Санкт-Петербург

01.02.2008 15:53

URL #1

У меня проблема с выходом РНК при выделении ее из лейкоцоцитарной фракции (осадка клеток), полученной ипри откручивании PAXgenовской пробирки.
Подозреваю, что лейкоциты в этом случае чем-то стабилизированы, что изменяет их свойства. В результате добавления тризола ("Sigma") лизиса не происходит, клетки плавают ошметками в пробирке, а при разделении фаз уходят в осадок (не интерфазу). Т.к. лизиса не произошло выход РНК нулевой. Пробовал растереть клеки тефлоновым гомогенизатором в тризоле, но это тоже не помогло.
По идее выделение должно идти на колонках киаген, в котрых происходит механичсеское разрушение на специальной терке, но этот способ выделения слишком дорог.
Прошу помочь решить эту задачу? Что делать? Может быть я чего-то не учел.
Заранее благодарен за советы.

Star
Постоянный участник
Санкт-Петербург

01.02.2008 16:02

URL #2

Важное дополнение - клетки отмывалтсь 1 раз в PBS, описанном на молбиоле.
Tri Reagent SIGMA ыл следующий T9424 (http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search/ProductDetail/SIGMA/T9424), т.е не для крови, но этот вроде бы подходит для работы с суспензией клеток.

Сообщение было отредактировано Star - 01.02.2008 16:08

Ъ
IP-штамп: frNwv0U1khjS.
гость

01.02.2008 16:02

URL #3

При откручивании пробирки PaxGen садятся не клетки, а НК.
http://molbiol.ru/forums/index.php?showtop...83725&hl=Тризол

Star
Постоянный участник
Санкт-Петербург

01.02.2008 16:10

URL #4

(Ъ @ 01.02.2008 16:02)

При откручивании пробирки PaxGen садятся не клетки, а НК.
http://molbiol.ru/forums/index.php?showtop...83725&hl=Тризол

Ага, читаю этот топик.
НО подскажиет - что же я не так делаю.
М.б не стоит ресуспендировать в PBS - теряется НК? Или тризол не подходит и надо использовать специальный тризол для крови (хотя вроде бы эоитроцитов то в PAXgene нет).

ООООчень прошу помочь мне разобраться.

Нужно открутить PAXgene и ресуспендировать осадок в тризоле. Меня в этом случае смутило то, что он не растворяется, а плавает хлопьями.

Сообщение было отредактировано Star - 01.02.2008 16:15

Ъ
IP-штамп: frNwv0U1khjS.
гость

01.02.2008 16:22

URL #5

Осталось внимательно почитать патент про PaxGen из того топика. Я сам в глаза не видел этот Pax, но, кажется, не так страшен черт ...

Star
Постоянный участник
Санкт-Петербург

01.02.2008 16:32

URL #6

(Ъ @ 01.02.2008 16:22)

Сам осадок очень плохо в тризоле растворяется, на вид он какой-то не нуклеиновый и напоминает клетки.
В PBS тоже не до конца ресуспендируется. М.б делать так: ресуспендировать в 100 мкл PBS и залить 1 мл тризола?
Как думаете, подскажиет, никогда не работал с таким объектом.

Ъ
IP-штамп: frNwv0U1khjS.
гость

01.02.2008 18:13

URL #7

(Star @ 01.02.2008 15:02)

Мне кажется Ваша ошибка тут (раньше не обратил внимание):
Важное дополнение - клетки отмывалтсь 1 раз в PBS, описанном на молбиоле.

А надо осадок суспендировать в ПБС (или в ТЕ), свободном от РНК-аз, затем заливать Тризолом. Далее по протоколу...

Star
Постоянный участник
Санкт-Петербург

01.02.2008 18:19

URL #8

Спасибо,Ъ!
Попробую сделать так, надеюсь, что получится, а то секир-башка.

Star
Постоянный участник
Санкт-Петербург

01.02.2008 20:27

URL #9

Хм!
Попробовал - ресуспендировал в 100 мкл ПБС, залил 1 мл тризола. ВЫделял в пересчете 1.25 мл крови - выход практически нулевой и после раздела фаз осадок.
Хрень какая-то. Чудеса... Что делать

Demyanov
Постоянный участник
Санкт-Петербург

01.02.2008 21:22

URL #10

У меня есть остатки фирменного набора PAXgene blood RNA Kit. Как раз заточенный под эти пробирки для сбора крови. Правда у него срок хранения закончился примерно год назад. Могу дать попробовать. Пиши.

Star
Постоянный участник
Санкт-Петербург

02.02.2008 00:02

URL #11

Есть ли рабоче-крестьянская альтернатива?

MBO

02.02.2008 12:27

URL #12

Тризол в упрощенном виде - смесь/раствор GTC и фенола, которая переходит в состояние эмульсии после добавления хлороформа, при этом более гидрофобная dsДНК в условиях кислого рН пререходит в капельки фенола, гидрофильная РНК остается в водном растворе, а белки - на границе раздела фаз вода-фенол и частично в феноле.
В GTC клетки (белки) растворяются хорошо, а в феноле при недостаточном лизисе образуются аггрегаты фрагментов клеток/денатуророванных белков, из которых РНК выделить проблематично(фенол - дубящее вещество). Т.е. сначала лизис клетки и образование гимогенной системы, а затем уж образование эмульсии с фазовыми переходами макромолекул по своим местам, в сосответствии с гидрофильностью.
Видимо у Вас по каким-то причинам не происходит лизис клеток и преждевременно образуюся нерастворимые белково-фенольные аггрегаты.
Надо разнести процесс экстракции на две стадии: сначала лизировать клетки в кислом 3-4М GTC, после чего добавить фенол, опять хорошенько гомогенизировать, после чего добавить хлороформ и получить эмульсию, и далеее ее центрифугировать по протоколу.
Успехов.

Star
Постоянный участник
Санкт-Петербург

02.02.2008 13:43

URL #13

(MBO @ 02.02.2008 12:27)

Прововал по Хомчински выделять - ГТЦ 4М, а далее фенол, но получилось примерно тоже самое, если работать фирменным тризолом.

Ъ
IP-штамп: frWBxqPTDNeUI
гость

02.02.2008 22:20

URL #14

(Star @ 01.02.2008 23:02)

Есть ли рабоче-крестьянская альтернатива?

Альтернатива - селективный лизизис эритроцитов в 150 mM NH4CI (хлорид аммония). Суспендировать осадок клеток в этом же растворе (в 100 мкл), а далее Тризолом по протоколу... Имейте ввиду, все процедуры нужно проводить максимально быстро, на свежевзятой крови, а лизис и ЦФ (до 2000 g) проводить на холоду - PAXgene используется, как понимаете, для транспортировки образцов крови на дальние расстояния, переводя НК в относительно защищенное от деградации состояние.

Ъ
IP-штамп: frWBxqPTDNeUI
гость

02.02.2008 22:31

URL #15

(Ъ @ 01.02.2008 17:13)

В PAXgene происходит лизис клеток, а НК переходят в гетерогенное состояние (осаждение). Принцип элементарный: осаждение Цетавлоном (CATRIMOX 14). Из патента:
Catrimox-14 - Tetradecyltrimethyl Ammonium Oxalate Buffered with Tartaric Acid at pH 3.7

Ъ
IP-штамп: frWBxqPTDNeUI
гость

02.02.2008 22:34

URL #16

Если Вы владеете методом Хомчинского, попробуйте сначала суспензию после PAXgene растворить в Растворе D, а потом добавлять фенол насыщенный водой.

Star
Постоянный участник
Санкт-Петербург

02.02.2008 23:28

URL #17

(Ъ @ 02.02.2008 22:34)

Если Вы владеете методом Хомчинского, попробуйте сначала суспензию после ПАХгене растворить в Растворе Д, а потом добавлять фенол насыщенный водой.

пробовал работать по хомчинскому, но вообще ничего не выделилось. Хотиа виделял первый раз и м.б. где-то напутал.
Может быть дело в забуферивании фенола. делал так: разогретый фенол смешал 1/10 по обьему с водой (хттп://молбиол.ру/солутион/03_02.хтмлъа32)
при этом следует признать, что в Д солюшн осадок из ПАХгене плохо растворялся.

В обсуждениях родилась такая мысль - м.б. ресуспендировать осадок в СДС с протеиназой К, затем для верности залить ТритонХ100 - чтобы этот осадок хорошенько денатурировать. Есть подозрения также, что осадок может состоять плюс к НК и из ядер.
А далее в тризол?
Как думаете.
Выскажитесь также и по Хомчински.
Спасибо.

Сообщение было отредактировано Star - 02.02.2008 23:40

Ъ
IP-штамп: frWBxqPTDNeUI
гость

02.02.2008 23:53

URL #18

СДС ни в коем случае - выпадут хлопья. В Тризоле не случайно используется саркозил, ионный детергент не выпадающий в осадок при высокой концентрации соли. Тритон, это лишнее, саркозил в 100 раз сильнее...

Star
Постоянный участник
Санкт-Петербург

03.02.2008 00:12

URL #19

А какже разодрать этот осадок? Может быть ресуспендировать в 100 мкл солюшн Д, а далее увести в тризол?
М.б вместе с изопропанолом добавить также LiCl

f1dark
Постоянный участник
Lahore, Punjab, Pakistan

30.09.2022 14:42

URL #20

Ufa1688
Постоянный участник

06.10.2022 16:30

URL #21

The DPRK is watching ufabet เข้า สู่ระบบ the US posing a serious threat ufa1688auto to the stability of the situation ufabet on the Korean peninsula ufa1688 and in its vicinity by redeploying UFA1688 the carrier task force in the ราคาบอล waters off the Korean สล็อตออนไลน์ peninsula,” read a statement from ลิงค์รับทรัพย์ the North Korean Foreign Ministry แฮนดิแคป posted on the state-run Korean บอลสเต็บ Central News Agency.

Ufa1688
Постоянный участник

14.03.2023 09:55

URL #22

Nunes da Silva’s app aff1688 experience with the police nigoal123 may point to a wider issue 123goal Metropolitan Police data shows ปั่นสล็อต that between 2010 and 2021เกมสล็อต only two police officers out of a total สูตรสล็อต of 573 accused were charged ทาง เข้า ufabet with rape or sexual ufabet vip assault after a public ทาง เข้า ufabet มือ ถือ complaint was brought แฮนดิแคป คือ against them.

Abu Road Escorts
IP-штамп: frQrtJ1xVpdzY
гость

16.03.2023 07:25

URL #23

Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.

Имя:

Отправка сообщений использует JavaScript операции. В вашем броузере не
установлено/отключено выполнение JavaScript программ. Используйте Netscape Navigator
или Internet Explorer (не ранее 3 версии); убедитесь, что выполнение JavaScript
программ разрешено в настройках вашего броузера.