Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
Blaid Постоянный участник |
Cобственно интересующий вопрос в заголовке темы: можно ли самому сделать маркер молекулярных масс для белкового фореза в ПААГ (в первую очередь интересует форез по Лэммли с SDS). Подозреваю что можно, но вот как - не знаю. В наличии: в наличии есть препараты белков (преимущественно ферментов) от фирмы Reanal; но они очень старые (конец 70-ых - начало 80-ых годов), преимущественно в виде крист. суспензий в сульфате аммония (но есть и порошки); все герметично упаковано, но хранилось без соблюдения температурного режима; чистота - х.ч. и о.с.ч (этикетки с красными и желтыми полосами); ну, в общем это такие ампулы различной емкости из коричневого стекла в пластмассовых черных футлярах трубчатой формы (кто-то наверняка сталкивался). Есть как мономеры, таки олигомеры разичной "мерности" (в основном ди- и тетрамеры). Можно ли из этого '"добра" сделать протеиновый маркер? Я сам "мыслю" это дело так: 1) осаждение суспензий центрифугированием 2) растворение белков в в Sample Buffer (SDS Reducing Buffer:0,5 Tris*HCl; glycerol; 10% SDS; 0,5 % Bromophenol Blue) при нагревании (95-100 гр) или в 2x Treatment Buffer (0,125 M Tris*HCl; 4% SDS; 20% glycerol; 0,2 M DTT; 0,02% Bromophenol Blue, pH 6.8) 3) объединение в общую смесь В какой концентрации делать каждый белок? Какую концентрацию белков выдерживать в общем миксе"? Как быть с белками, которые плохо или вообще не растворимы в Sample Buffer и/или 2х Treatment buffer? И можно ли так вообще сделать маркер? В общем буду рад любой полезной информации. Спасибо! Сообщение было отредактировано Blaid - 03.06.2013 20:44 |
guest: ммм IP-штамп: frQlBxj4iQSg. гость |
|
R.J. Dio Постоянный участник |
|
distemper Постоянный участник |
(R.J. Dio @ 03.06.2013 21:55) ну я делаю сам маркер, можете закидывать тухлыми яйцами. если я делаю белки на заказ, у меня куча конструктов накопилась, отдаю заказчику милиграмм-два товара, остальное на маркер пускаю, ну не сливать же в раковину |
vb Постоянный участник |
(Blaid @ 03.06.2013 18:40) я бы делал примерно 0,1-0,5 г/л. в зависимости от метода окрашивания и вообще ваших навыков. (Blaid @ 03.06.2013 18:40) 1-10 г/л (Blaid @ 03.06.2013 18:40) Как быть с белками, которые плохо или вообще не растворимы в Sample Buffer и/или 2х Treatment buffer? И можно ли так вообще сделать маркер? ну это экзотика какая-то. не знаю. если плохорастворимые, сколько растворится - столько растворится, остальное открутить, чтоб не болталось. с совсем нерастворимыми мы не сталкивались. а вообще, почему нет, если добра такого навалом? делайте. только насчет сохранности в высоленном виде в течение 30 лет у меня сомнения. но это вы на форезе увидите. |
птаха Постоянный участник |
сначала нужно каждый белок поставить на отдельной дорожке, подозреваю, что и при этом на дорожке будет не одна полоска, а бог знает сколько. если все белки заранее поперемешать получится такая рэндом чача, что гораздо проще будет в качестве стандарта использовать сыворотку крови. >> SDS Reducing Buffer этот редуцирующий буфер в Вашей прописи не такой уж и редуцирующий как видно из его названия - посмотрите внимательно на состав |
птаха Постоянный участник |
эту ампулу вы разводите до 50 мл водой, прибавляете 50 мл разрушающего буфера, аликвотите по 10 мкл. получаете маркеры для 10 000 электрофорезов. цена одного маркера, расчитанная по белку получается 0,7 копейки/1шт При пробоподготовке ИГ распадется на цепи полностью и частично и у Вас получится вполне симпатичный стандарт Сообщение было отредактировано птаха - 04.06.2013 06:45 Картинки: IgG_Proteins.jpg — (33.51к)
|
ernesta88 Постоянный участник москва |
сибэнзим продает маркеры 2700 р - дешевле чем 2-е-3 бутылки вина например, прямо за наличные продают в офисе чем париться со старьем |
vb Постоянный участник |
(ernesta88 @ 04.06.2013 07:52) 2700 р - дешевле чем 2-е-3 бутылки вина например, прямо за наличные продают в офисе чем париться со старьем смотря какая ситуация. если студенты-аспиранты, то че б не попариться? даже на пользу пойдет. имхо. |
Blaid Постоянный участник |
"При пробоподготовке ИГ распадется на цепи полностью и частично и у Вас получится вполне симпатичный стандарт" А пробоподготовка какая должна быть? И еще: приведенная Вами картина расщепления иммуноглобулина всегда стандартная (воспроизводится из раза в раз) или варьирует в зависимости от пробоподготовки (скажем, прокипятил при 95 гр и 4 мин - получилось одно, при 94 гр и 5 мин - другое). А что не так с редуцирующим буфером? Бета-меркаптоэтанол еще нужен? Конечно, вполне может быть, что это от того, что препарат сильно "лежалый", но алкогольдегидрогеназа в редуцирующем буфере (который я приводил выше) практически не растворяется (сколько ни кипятил). Работаю в тех условиях, какие есть (имею в виду обеспеченность реактивами-реагентами). Был бы фирменный маркер (или возможность его получить) - им бы и пользовался. А так приходится пытаться делать маркер самому. |
Horse-radish Участник |
|
vb Постоянный участник |
|
genseq Постоянный участник |
|
Алексей Соколов Постоянный участник Санкт-Петербург |
Electrophoresis. 2002 Sep;23(19):3262-5. Generation of multicolored, prestained molecular weight markers for gel electrophoresis. Compton MM, Lapp SA, Pedemonte R. Сообщение было отредактировано Алексей Соколов - 04.06.2013 15:36
|
R.J. Dio Постоянный участник |
|
genseq Постоянный участник |
(Алексей Соколов @ 04.06.2013 13:35) Можете закидывать и меня тухлыми яйцами, но мне было просто интересно сделать престейнд маркер самому. Было много сухих реаналовских и сервавских белков - фосфорилаза b, трансферрин, БСА, овальбумин, трипсиноген, рибонуклеаза, апротинин. Хранились черти как то в холодной комнате, то в ней же, но без холода. Купил реактивные ремазоловые красители (синий и красный, стоят копейки), в щелочной среде в SDS смешал через один белок то в синим, то с красным по уменьшению молекулярного веса, потом добавил лизина для блокировки и смесь белков почистил гель-фильтрацией на тойопеарле в денатурирующем элюенте, потом смешал только фракции максимумов пиков. Получился приличный самодельный маркер. Для статейных картинок пользуюсь ферментасовским маркером, а для рядовых переносов - самодельным. Оригинальную статью про изготовление маркеров можно достать здесь - Electrophoresis. 2002 Sep;23(19):3262-5. Generation of multicolored, prestained molecular weight markers for gel electrophoresis. Compton MM, Lapp SA, Pedemonte R. Спасибо за ссылку. Попробую использовать такие маркеры для электрофореза ДНК. Файл/ы:
|
R.J. Dio Постоянный участник |
|
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |