Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
polosataya Участник Санкт-Петербург |
поделитесь, пожалуйста, опытом сколько может сохраняться РНК, если ткань гомогенизировать в буфере с гуанидином (по Хомчински)? РНК нужна для ОТ-ПЦР P.S.: про RNA Later я в курсе
|
petr Постоянный участник |
|
Statin Постоянный участник |
|
Guest IP-штамп: frfy/PJuS5FO2 гость |
|
Statin Постоянный участник |
(polosataya @ 16.06.2012 13:46) Уважаемые коллеги! поделитесь, пожалуйста, опытом сколько может сохраняться РНК, если ткань гомогенизировать в буфере с гуанидином (по Хомчински)? РНК нужна для ОТ-ПЦР P.S.: про RNA Later я в курсе Цветочек случайно добавил, RNALater, если вы в курсе, нужен не для сохранения выделенной РНК, а для сохранения РНК в ткани до ее выделения. Сохраняете ткань. Поэтому, как правильно заметил предыдущий оратор, вопрос и прозвучал как "Что делать дядьке в Киеве, если в огороде растет бузина". Для сохранения РНК важно не то, в каком буфере вы будете гомогенизировать, а то как хранилась ткань до выделения. Если в ткани РНКу вы уже похерили, то никакой "Хомчински" или др. вам не помогут. Хранение РНК стандарт: -80, расвор с ингибитором, или под спиртом, перевозить можно под изопропанолом, даже при комнатной температуре, но не долго. В лиофилизированном виде не пробовал, но говорят можно, правда лучше, наверно, использовать какие-нибудь спец фильтры (не знаю). |
Serg900 Участник |
|
RNK Постоянный участник СССР |
Замораживание гематогена на -20...-80С, в принципе, позволяет сохранить РНК на долго. Вы сами можете посмотреть, что с РНК после такого хранения. Разные ткани ведут себя по разному. RNALater, тоже не панацея. Опять, важна какая ткань и как она пропитывается насыщенным раствором сульфатом аммония. |
polosataya Участник Санкт-Петербург |
(Statin @ 17.06.2012 04:46) Цветочек случайно добавил, RNALater, если вы в курсе, нужен не для сохранения выделенной РНК, а для сохранения РНК в ткани до ее выделения. Сохраняете ткань. Поэтому, как правильно заметил предыдущий оратор, вопрос и прозвучал как "Что делать дядьке в Киеве, если в огороде растет бузина". Для сохранения РНК важно не то, в каком буфере вы будете гомогенизировать, а то как хранилась ткань до выделения. Если в ткани РНКу вы уже похерили, то никакой "Хомчински" или др. вам не помогут. Хранение РНК стандарт: -80, расвор с ингибитором, или под спиртом, перевозить можно под изопропанолом, даже при комнатной температуре, но не долго. В лиофилизированном виде не пробовал, но говорят можно, правда лучше, наверно, использовать какие-нибудь спец фильтры (не знаю). спасибо за ответ ткань до погружения в тризол будет из свежего насекомого. человек, который будет мне ее передавать максимум сто может, так это порезать ма-а-алекнького насекомца ножницами и сделать гомогенат как показала практика, сульфат аммония и rna later проникают внутрь плохо. соответственно и с РНК беда поэтому и возник вопрос, нельзя ли сунуть в тризол до выделения |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
А при повседневной работе - в холодильнике (4-8 оС), но в присутствии избытка ингибитора РНК-аз. 0,5-1,0 ед. на мкл. В течении нескольких недель с РНК никаких проблем . Ингибитор работает до замораживания и в неспиртовой среде. пы.сы: полезно иногда проводить поиск в форуме по теме... |
Guest IP-штамп: frfy/PJuS5FO2 гость |
|
RNK Постоянный участник СССР |
РНК растворяют при +55...+65 С, в течение 20-30 минут в 1хТЕ и без всяких ингибиторов РНКаз. Можно полностью инактивировать РНКазы в растворе 10мМ DTT при растворении РНК при +55 С. РНК хорошо сохраняется в осадке после осаждения из раствора LiCl (равный объем 10М LiCl к раствору РНК в 1хТЕ). Обычно, весь ажиотаж, о нестабильности РНК берёт своё начало давно, когда всего боялись и неаккуратно работали. Никаких РНК ингибиторов и прочего не нужно, даже при синтезе кДНК. Работать с РНК как с ДНК. Пробирки чистые, и кончики тоже, всё остальное - надуманно. РНК будет разрушаться в ткани, которую держат в растворе с гуанидином, но это не связано с активностью РНКаз. Даже на -20 С, РНК постепенно разрушается в лиз-растворе. Если нет возможности выделить сразу РНК, то ткань лучше измельчить с в растворе с 4М гуанидинтиоционатом, и быстро доставить куда вам нужно. Но РНК будет постепенно деградировать. Сообщение было отредактировано RNK - 18.06.2012 18:48 |
Guest IP-штамп: fr0OYJiGAYajU гость |
мне нужен метод сохранения ткани, не через сульфат аммония. чтобы можно было извлечь РНК через месяц |
Guest IP-штамп: fr0OYJiGAYajU гость |
(Guest @ 18.06.2012 15:47) ну конечно. ее нет. повалилась а если сразу выделить и не хранить в RNA later - то есть вопрос, в чем хранить кусок ткани? |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
А можно еще во что-нибудь пожиже и на самое дно |
polosataya Участник Санкт-Петербург |
|
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость |
РНК растворяют при +55...+65 С, в течение 20-30 минут в 1хТЕ и без всяких ингибиторов РНКаз. УРЯЯЯААА!!! А как узнать, что она достаточно чистая, что бы все эти утверждения были справедливы. --РНК будет разрушаться в ткани, которую держат в растворе с гуанидином, но это не связано с активностью РНКаз. Ну откройте же скорее нам секрет - с чем же это связано? --господа! не нужна мне выделенная РНК! вернее, нужна, конечно, но как с ней работать и хранить я прекрасно знаю мне нужен метод сохранения ткани, не через сульфат аммония. чтобы можно было извлечь РНК через месяц Вариант первый: сушить лиофильно можно, и не лиофильно(просто в вакууме над скажем Р2О5), ибо потом вы все равно все тризолом убьете. Потом запаять стеклянную ампулу. Или опять же, как ниже описано, хранить с осушителем. Вариант второй: Несколько проводок в абсолютном спирте(сушка магнием или натрием), до так сказать полного обезвоживания. Потом под спиртом хранить в герметичной таре, если запаять в стекле(осторожно нужно умение это делать иначе сгорите нафиг), то можно и так. А если в каком-нибудь фалконе или эппендорфе с винтом, то лучше положить в другую герметичную тару и засыпать силикагелем(прокаленном градусах при 120-140) Морозить при этом ничего не надо. Нет воды - нет гидролиза. |
polosataya Участник Санкт-Петербург |
Вариант второй: Несколько проводок в абсолютном спирте(сушка магнием или натрием), до так сказать полного обезвоживания. Потом под спиртом хранить в герметичной таре, если запаять в стекле(осторожно нужно умение это делать иначе сгорите нафиг), то можно и так. А если в каком-нибудь фалконе или эппендорфе с винтом, то лучше положить в другую герметичную тару и засыпать силикагелем(прокаленном градусах при 120-140) Морозить при этом ничего не надо. Нет воды - нет гидролиза. [/quote] спасибо все это замечательно, но в почти полевых условиях никак нереализуемо... |
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость |
Еще как реализуемо. Если хотите, могу помочь я в Питере. |
Guest IP-штамп: fraNxKs8b8Uok гость |
|
Guest IP-штамп: fr4awbu0V5I72 гость |
|
Guest IP-штамп: fr4awbu0V5I72 гость |
|
polosataya Участник Санкт-Петербург |
|
Guest IP-штамп: fr4awbu0V5I72 гость |
|
guest: ммм IP-штамп: frQlBxj4iQSg. гость |
|
Guest IP-штамп: frfpdvAFnvqsE гость |
|
Wola Участник Москва |
(RNK @ 18.06.2012 18:48) Скажите, пожалуйста, а как именно DTT инактивирует РНКазы? Без шуток, очень интересно. |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(Wola @ 20.06.2012 09:31) Я думаю, что RNK намного умнее чем Вы думаете (инактивировал РНК-азы добавляя ДТТ ). Ессно, он имел ввиду, что Ингибиторы РНК-аз эффективно работают исключительно в среде ДТТ, стандартно 10 мМ, который выступаут в роли протектора, притом что самой Ревертазе наплевать на ДТТ - реакция идет замечательно и без него. Так что любопытство Ваше неуместно. |
polosataya Участник Санкт-Петербург |
(Guest @ 20.06.2012 01:24) Ага. Попробуйте в лабе несколько вариантов и сравните. Иначе не имеет смысл насекомых мучить. Этап называется отработкой методик и может занимать месяцы и при вариациях биоматериала даже годы. Это опыт, собственный, который просто так не приобретается и порой на словах не передается. Нельзя полностью имитировать все условия, должно быть некое чувство, которому так просто не научить. Вот так. ИМХО, у Вас даже ДНК нет. По моему скромному и малоопытному мнению. вы ошибаетесь, с ДНК как раз все в порядке. а РНК валится. а методики отрабатываются, и даже оптимизируются. а исходный вопрос был о том, был ли у кого положительный опыт |
RNK Постоянный участник СССР |
(Wola @ 20.06.2012 09:31) почитайте этот патент: для инактивации РНКаз необходимо -S-S- связи перевести в -SH HS- с помощью DTT при нагревании от 37 до 65 градусов. Достаточно 10-20 мМ DTT в растворе с РНК, прогреть до 55 градусов, и все РНКазы инактивируются. (polosataya @ 16.06.2012 13:46) Уважаемые коллеги! поделитесь, пожалуйста, опытом сколько может сохраняться РНК, если ткань гомогенизировать в буфере с гуанидином (по Хомчински)? РНК нужна для ОТ-ПЦР может вам попробовать живыми насекомые доставить с поля. Лиофилизация ткани и заливка насекомых тризолом не поможет сохранить РНК. |
polosataya Участник Санкт-Петербург |
|
Guest IP-штамп: frfpdvAFnvqsE гость |
|
RNK Постоянный участник СССР |
Надо насекомое раздавить в 4М гуанидинтиоционате, и измельчить насколько это возможно. В этом случае, ткань будут пропитываться солью. Надо пробовать. Может стоит попробовать заспиртовать насекомое. Как это делают при подготовки к срезам (укус и пропанол).
|
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(RNK @ 20.06.2012 11:43) почитайте этот патент: для инактивации РНКаз необходимо -S-S- связи перевести в -SH HS- с помощью DTT при нагревании от 37 до 65 градусов. Достаточно 10-20 мМ DTT в растворе с РНК, прогреть до 55 градусов, и все РНКазы инактивируются. может вам попробовать живыми насекомые доставить с поля. Лиофилизация ткани и заливка насекомых тризолом не поможет сохранить РНК. С ДТТ этот фокус по патенту у меня в свое время не прошел. Видимо не все РНК-зы этому подвержены. Но с ингибитором+ДТТ - по несколько месяцев в холодильнике с РНК ничего не случилось... |
Guest IP-штамп: frfpdvAFnvqsE гость |
|
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(polosataya @ 20.06.2012 11:15) странно - народ из парафиновых архивных трупофф рнку достает |
Guest IP-штамп: frFlqPbQrZ39g гость |
|
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
|
Guest IP-штамп: frvTCK1iODP5s гость |
|
guest: pppp IP-штамп: frJ29JTBlItMA гость |
|
Guest IP-штамп: frJ29JTBlItMA гость |
|
Guest IP-штамп: frJ29JTBlItMA гость |
|
Guest IP-штамп: frJ29JTBlItMA гость |
|
Guest IP-штамп: frJ29JTBlItMA гость |
|
guest: pppp IP-штамп: frJ29JTBlItMA гость |
|
guest: pppp IP-штамп: frJ29JTBlItMA гость |
|
guest: pppp IP-штамп: frJ29JTBlItMA гость |
|
guest: pppp IP-штамп: frJ29JTBlItMA гость |
|
guest: pppp IP-штамп: frJ29JTBlItMA гость |
|
guest: pppp IP-штамп: frJ29JTBlItMA гость |
|
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |