molbiol.ru -> Тестсистема для ВИЧ как кит для ПЦР других генетических объектов.

> Все форумы > Тематические форумы > Молекулярная и клеточная биология

Zbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ

Правила FAQ* Поиск* Участники* Календарь* Избранные темы* Форум Форумов*

Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ]

Форум:

* Тестсистема для ВИЧ как кит для ПЦР других генетических объектов. -- Помощь с разбором рецепта лайфхака. --

Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.

KCN
Постоянный участник
Київ. Україна понад усе! / DELETED

19.12.2018 14:21

URL #1

Добрый день, уважаемые коллеги!

Как-то общался с человеком, амплифицировавшим очень крупный белковый непроцессированный транскрипт (я так понял - режется на белки капсида и разного рода сигнальные и ферменты) РНК содержащего вируса сельскохозяйственного растения.
Полученную кДНК вставил в вектор и отдал на сиквенс.
Собственно, данный вирус и был им открыт.

Но так как это было еще когда я был студентом, то голова моя дырявая, занятая больше девочками чем наукой, напрочь забыла растение и название вируса, ну и имя первооткрывателя.

Помню только то, что использовал этот человек тест систему на ВИЧ, добавив в нее свою пару праймеров, и немного изменив алгоритм амплификации и реверс-транскрипции. Логично, что поскольку растения ВИЧ не болеют, то праймеры из тестсистемы просто остались балластом в растворе.

Вопросы такие:
1. Какую тестсистему можно для использовать в подобных целях?
2. Действительно ли это выгоднее, особенно если есть доступ в медицинскую лабораторию и к просроченным тестситсемам, которых не жалко, но они еще могут работать?
3. Что там за полимераза такая и реверстренскриптаза, и как вообще это должно работать, особенно если надо заклонировать белок например, 80-90 кДа с мРНК?
4. Стоит ли овчинка выделки?

semi
Постоянный участник
Москва

20.12.2018 09:13

URL #2

Вы как-то слишком неаккуратны с терминологией.

KCN
Постоянный участник
Київ. Україна понад усе! / DELETED

20.12.2018 11:15

URL #3

Возможно, тогда Вы сможете откорректировать мои ошибки и пролить свет на решение задачи с клонированием с использованием реактивов от коммерческой тестсистемы ?

-Ъ-
Постоянный участник
Москва

20.12.2018 11:28

URL #4

(KCN @ 19.12.2018 15:21)

Вопросы такие:
1. Какую тестсистему можно для использовать в подобных целях?
2. Действительно ли это выгоднее, особенно если есть доступ в медицинскую лабораторию и к просроченным тестситсемам, которых не жалко, но они еще могут работать?
3. Что там за полимераза такая и реверстренскриптаза, и как вообще это должно работать, особенно если надо заклонировать белок например, 80-90 кДа с мРНК?
4. Стоит ли овчинка выделки?

Вы нуждаетесь в финансовой помощи, то бишь нужны не просроченные ПЦР и ОТ киты? В разумных пределах...

Но

"если надо заклонировать белок, например, 80-90 кДа с мРНК" - это вопрос не форуму.

KCN
Постоянный участник
Київ. Україна понад усе! / DELETED

20.12.2018 12:18

URL #5

После защиты кандидатской я сменил профиль деятельности и больше ничего не клонирую - работаю хроматографистом на HPLC. Клонирует коллега в "дружественном" отделе нашего НИИ, пока справляется с теми китами, что мы ему купили под наши проекты.

Да, у меня есть возможность брать просроченные тестсистемы, Насколько я понял, вирусолог "очумелец" осилил ОЧЕНЬ большой и длинный белок. Но как и на чем - вот вопрос?

Vadim Sharov
Постоянный участник
Россия

20.12.2018 13:39

URL #6

Коллега "осилил" не белок, а транскрипт.
"реверс-транскрипция" в старые времена так назывался процесс обратной транскрипции.

"В молекулярной биологии метод полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (англ. reverse transcription polymerase chain reaction) принято обозначать как ОТ-ПЦР (англ. RT-PCR)". из вики Тесты. которые Вам нужны: тесты RT-PCR. Не путать с ПЦР реального времени. Впрочем, насколько я помню ревертаза и как ДНК зависимая ДНК-полимераза работает. С ошибками.
В общем любой тест с обратной транскриптазой для РНК вирусов.
типа
https://www.invitro.ru/analizes/for-doctors/545/27951/

KCN
Постоянный участник
Київ. Україна понад усе! / DELETED

20.12.2018 16:31

URL #7

(Vadim Sharov @ 20.12.2018 14:39)

Вадим, благодарю!
Действительно, я не корректно выразился по поводу реверс транскрипции и белка, думал что по контексту само собой будет понятно, что коллега получил кДНК. Но оказалось что уровень телепатических способностей форумчан ниже среднего.

Данные методики qPCR и reverse transcription polymerase chain reaction я знаю и в свое время неоднократно ставил на коммерческих наборах. Нет нужды останавливаться на этом, в том числе на TRIZOL, SYBR GREEN и прочих ингредиентах той и другой методики.

Меня зацепило то, что для особо длинных транскриптов используют не стандартные ревертазы, а для их амплификации в препаративном ПЦР (с последующим разгоном в агарозе и элюцией оттуда) - не несколько полимераз с разными характеристиками или особо "долгоработающие".
Вопрос в том, ПОЧЕМУ тестсистема на ВИЧ дала отличный результат? ЧТО это была за тестсисема и КАКИЕ это были компоненты?
Я не вспомню, вы не угадаете, но можно хоть предположить? Может кто-то хорошо знает такие тестсистемы из форумчан?

Мне довелось работать на наборах Amplisens, в диагностической лаборатории. Но только на гепатиты и герпесы, CMV, и т.д. НЕ ВИЧ.

P.S.:
ПЦР в реальном времени лучше обозначать qPCR, поскольку аббревиатуру RT-PCR можно трактовать как reverse transcription polymerase chain reaction и как real time polymerase chain reaction.

Сообщение было отредактировано KCN - 20.12.2018 21:10

vb
Постоянный участник

20.12.2018 19:11

URL #8

Смотря что вы хотите дальше делать с результатами.
если поиграться со студентами, то можно, наверное. Только говорить им все равно нужно правильную легенду, а не как делали в реальности.
если публиковаться, то нельзя.
если использовать для разработки коммерчесеого продукта, то нельзя.
как вы представляете себе материалы и методы или раздел досье: мы взяли просроченную тест систему, предназначенную совсем для другого, в которой хз какие ферменты, буквы и прочее? Я както смутно себе это представляю.

KCN
Постоянный участник
Київ. Україна понад усе! / DELETED

20.12.2018 21:20

URL #9

vb, это чисто научное любопытство. Работал с ПЦР только с коммерческими китами, что на диссертацию что в клинической лаборатории. Никогда ничего не оптимизировал и не подбирал сам, за исключением подбора праймеров и программы на циклере. Что касается обратной транскрипции, рекомендуемая программа (если делать в циклре) была прописана в руководстве к киту.

Не считаю себя гуру в области ПЦР, поскольку использовал метод исключительно утилитарно и не заглядывая "под капот". Именно по этому и задал вопрос - в надежде что более осведомленные люди смогут раскрыть секрет лайфхака.

Может кто-то подскажет , какие ревертазы (для получения кДНК), полимеразы (для амплификации ДНК в препаративном ПЦР) надо брать для получения длинной кДНК с не прошедшей прессинг и сплайсинг пре-мРНК (которая может кодировать 81-90кДа белок - без учета интронов и последовательностей, кодирующих удаляемые протеазой участки) с целью заклонировать интересующий фрагмент?
Если не использовать просроченную тестсистему.

Согласен, что для публикации случай с просроченной тестсистемой - не вариант.

Сообщение было отредактировано KCN - 21.12.2018 14:08

KCN
Постоянный участник
Київ. Україна понад усе! / DELETED

21.12.2018 13:57

URL #10

Еще раз извиняюсь за некорректную формулировку задачи, во время написания постов я отвлекался на посторонние вопросы.

Что было сделано:
Некий ученый, используя ревертазу из тестсистемы для ВИЧ и сторонние праймеры получил кДНК с области генома растительного РНК содержащего вируса растения.
Данная область содержала ген/гены вирусного белка предшественника, который при помощи вирусной протеазы расщеплялся на ряд зрелых капсидных и регуляторных белков.
Полученную кДНК этот ученый амплифицировал при помощи полимеразы из этой же тестсисемы, но со сторонними праймерами, в которые на 5'-концы были введены необходимые сайты рестрикции.
Полученный в результате ПЦР набор ДНК был разделен в агарозном геле, вырезан, элюирован, клонирован в плазмиду.
Плазмидой со вставкой трансформировали E.coli, нарастили культуру, выделили необходимое количество плазмиды и отправили на сиквенс.
Полученный сиквенс был проанализирован, выявлены открытые рамки считывания, сайты протеолиза, произведено сравнение с базами данных, например, GenBank.
Выявлено, что вирус является новым.

Что хочу сделать:
Имеется ткань человека с длинными не прошедшими сплайсинг и процессинг пре-мРНК некого белка, в зрелом состоянии после альтернативного протеолиза 81-90 кДа.
Хочется получить полную кДНК с не прошедшей процессинг и сплайсинг пре-мРНК данного белка для сиквенса аналогичным образом.
Чтобы сравнить с тем, что получается в результате процессинга и сплайсинга, а так же с аминокислотной последовательностью зрелого белка, прошедшего фолдинг, модификацию и ограниченный протеолиз с удалением определенных фрагментов, выяснить чем кодируются данные фрагменты.

Важно получить информацию о последовательности так же интронов в пре-мРНК по кДНК и о последовательности кДНК, которая должна соответствовать удаляемым протеолизом участкам. А так же сигналам, по которым идет нормальный и альтернативный сплайсинг, и сайтам (альтернативным сайтам?) ограниченного протеолиза.
Есть подозрение, что у данного белка идет не только альтернативный сплайсинг, но и несколько вариантов дозревания с различным типом протеолиза, что влияет на его антигенность и функции.

Некоторые фрагменты данной кДНК будут селективно амплифицированы и клонированы в вектора для экспрессии, с последующей очисткой продукта, иммунизацией мышей, получения гибридом и моноклональных антител против фрагментов данного белка.

Сообщение было отредактировано KCN - 21.12.2018 14:24

KCN
Постоянный участник
Київ. Україна понад усе! / DELETED

21.12.2018 20:11

URL #11

Ведь процессинг пре-мРНК происходит в ядре и далеко не сразу появляется полиА-хвост, на который идет один из праймеров oligo-dT . Но если руководствоваться википедией, то сплайсинг идёт после полиаденилированя.

Варианты:
1. или получать все варианты кДНК для зрелых мРНК.
2. экстрагировать пре-мРНК из ядра (шаманить над TRIZOL модифицируя метод, получая пре-мРНК из фракции ядер поле дифференциального центрифугирования?)
а затем, подобрать один праймер, отличный от oligo-dT.
3. Сопоставлять с геном по геномной ДНК из UCSC Genome Browser / NCBI ?

Ведь по сути весь выхлоп - детекция сплайс-изоформ белка, специфических для определенных патологических физиологических состояний, при помощи ИФА в биологическом материале.

Сообщение было отредактировано KCN - 21.12.2018 21:28

Vadim Sharov
Постоянный участник
Россия

21.12.2018 23:40

URL #12

Задача того что сделано "одним дядькой" (простите я перевел Ваше "некий исследователь") и Ваша теоретическая задача имеют мало общего.
Исследователь взял транскрипт безинтронной вирусной матрицы. Большой кусок ревертаза синтезировала? Ошибок много? И что? Так он вырезал самый большой кусок из геля. Аборты не считал. При таком эксперименте ему хватит и процента эффективности. Клонирование в Е. коли дает вообще один конструкт для сиквенса. Потом биоинформатика. Взял ревертазу из тестов на ВИЧ. Так как доступна.

Процессинг посттранскрипционный и посттрансляционный явления разные. Как Вы правильно заметили происходит в разных компартментах клетки.

Интрон это нетранслируемая по ОПРЕДЕЛЕНИЮ часть гена. Когда есть альтернативный сплайсинг, это уже экзон. Вы хотите найти в интронах сигналы для альтернативного протеолиза? Очень смелая идея. Но на мой взгляд, маловероятная. От слова "весьма".

Альтернативный протеолиз работает с готовым белком: результатом трансляции экзонов. Протелитические ферменты режут пептиды, в процессинге мРНК вырезаются нуклеотидные интроны.

Аминокислоты и нуклеотиды разные биохимически вещества, Вам как биохимику это должно быть известно.

Могут ли быть в интронах последовательности, соответствующие сайтам гидролиза протеазами? А почему бы нет. Но, какое это имеет отношение к протеолизы, раз интрон принципиально не транслируется? Вы скорее всего знаете, что "трансляция" это "перевод" 3 нуклеотидных букв мРНК в 1 аминокислоту белка.

Если Вы верите в нематериальный перенос сайта протеолиза из интрона в готовый белок: это действительно к Горяеву.

Главное: у Вас есть "секретный человеческий белок" (для нас "секретный"), но Вы точно знаете его молекулярный вес и факт альтернативного протеолиза. Что для многократно прочитанного человеческого генома нет в базах последовательности гена (с интронами и экзонами)? Какой смысл мучать ревертазу? Клонируйте полный ген и тупо секвенируете. Определить какая цепочка ДНК сенс, а какая антисенс не представляет труда.

Замечу, что молекулярная биология всегда считалась частью биохимии.

Vadim Sharov
Постоянный участник
Россия

22.12.2018 00:39

URL #13

Ведь по сути весь выхлоп - детекция сплайс-изоформ белка, специфических для определенных патологических физиологических состояний, при помощи ИФА в биологическом материале.

У Вас, простите, каша. Изоформы белка могут быть из-за нарушения посттранскрипционного сплайсинга мРНК (интрон стал экзоном). Это бывает. Еще раз интрон перестал быть интроном и выступает как альтернативный экзон. Тогда надо ловить патологическую мРНК. Последовательность нормального белка известна? Скорее всего известна и патологический продукт.

Если это ошибка протеолиза, то ломаете сайт протеолиза, получаете кучу большого продукта и на основе эпитопов отъеденной части делаете ИФА набор.

Замечу, что в Вашей истории "некий мужик" находил вирус по сиквенсу. У Вас ИФА, то есть нормальный белочек в 90кДа. Вы уверены, что это чудо не гликозилировано?

Другими словами Ваша задача может решаться проще.

KCN
Постоянный участник
Київ. Україна понад усе! / DELETED

22.12.2018 11:28

URL #14

Да, Вадим, см. пункт 5 ниже. Задача действительно решается проще.

Мне бы самому хотелось разобраться с научным вопросом нарушения/изменения сплайсинга и протеолиза, а возможно и гликозилирования при созревании данного белка. Возможно, как побочный продукт, я что-то подобное сделаю.
Но цель, на которую выделены средства - банальный ИФА, это биотехнология, детка!

1. По литературным даным, для получения последовательностей, соответствующих интронам,
в случае с сплайс-изоформами белков, используют геномную ДНК. Если сиквенс неизвестен, геномную ДНК картируют, используя кДНК полученные со зрелых мРНК.
https://academic.oup.com/nar/article/32/17/5096/1334127
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15452276
https://www.cell.com/cell/pdf/0092-8674(83)90537-8.pdf

2. Потенциальная возможность клонировать пре-мРНК все же существует, так как в процессе созревания мРНК полиаденилирование предшествует сплайсингу. А значит oligo-dT будет с чем взаимодействовать.
https://www.khanacademy.org/science/biology...mrna-processing
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4451228/

3.Ингода на пре-мРНК все же получается синтезировать кДНК. Возможно, выход кДНК на пре-мРНК усилится, если провести дифферинциальное центрифугирование,
и использовать фракции ядер и цитоплазмы как источники РНК отдельно.
https://www.researchgate.net/post/Why_can_I...ences_from_cDNA
https://www.researchgate.net/post/Does_qRT-...ontains_introns

4. Поскольку сиквенс гена известен, рандомные гексамеры и oligo-dT вообще можно заменить на любые подходящие forward и reverse.
Теоретически, ограничений к этому нет, просто вместо кДНК-библиотеки со зрелых мРНК будет получатся только одна последовательность кДНК с первичного транскрипта.

5. Можно вообще не использовать ревертазу и не делать кДНК, а так же обойтись без PCR.
Я описывал в англоязычной статье и тезисах биоинформатический подход для вычисления перспективной антигенной последовательности и синтеза соответствующего ей гена, но тут его приводить не буду в целях сохранения анонимности.

Сообщение было отредактировано KCN - 05.02.2019 18:32

KCN
Постоянный участник
Київ. Україна понад усе! / DELETED

22.12.2018 13:23

URL #15

А еще, Вадим, интроны могут не удаляться из зрелой мРНК, даже попадать в ORF основного белка, более того, альтернативный сплайсинг может давать два рабочих белка с разными рамками считывания.
Так же, интроны могут содержать стоп-кодон, при попадении в рамку они могут приводить к преждевременной терминации синтеза белка.
http://www.jbc.org/content/271/45/28617.full.pdf
http://www.genetics.org/content/genetics/204/3/1239.full.pdf
(удержание интронов выше при раковых заболеваниях)
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18054115
А иногда интрон оказывается экзоном, молчащим при одних физологических условиях, но активным при других
http://www.jbc.org/content/268/1/686.full.pdf
Ну а вирусы - это вообще отдельный мир
http://wires.wiley.com/WileyCDA/WiresArtic...d-WRNA1470.html
https://jvi.asm.org/content/73/2/1195

Если интроны могут быть включены в зрелую мРНК, содержать альтернативные стоп кодоны и свои сигналы для сплайсинга, почему они не могут содержать сайты для протеолиза?

Сообщение было отредактировано KCN - 22.12.2018 13:33

Vadim Sharov
Постоянный участник
Россия

22.12.2018 14:02

URL #16

Еще раз: если последовательность может быть частью ORF, это по определению экзон. Иногда не реализуемый. Аминокислотная последовательность, кодируемая альтернативным экзоном может иметь сайт протеолиза. Зрелая мРНК не может иметь сайт для сплайсига, она уже зрелая, то есть по определению, результат сплайсинга.

Я обращаю внимание на терминологию, потому что она важна. Альтернативный экзон не требует применения ревертазы ВИЧ, так как иногда реализуется в белке. Ревертаза стоило бы применять лишь для выявления никогда не реализуемого в пептидной цепи интрона.

KCN
Постоянный участник
Київ. Україна понад усе! / DELETED

22.12.2018 14:21

URL #17

Т.е. , если мы узнали, что интрон на самом деле что-то кодирует, то он сразу автоматически становится экзоном?

Вот пример альтернативного экзона AltT2 у гексокиназы 1
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19536174
https://www.researchgate.net/figure/Upstrea...d_fig3_26301125
Он действительно альтернативный и не реализуемый, в большинстве случаев, но о нем таки известно, что он экзон. Экзон может тоже очень долго считаться таким, что ничего не кодирует.

Предлагаете их так различать:
Если последовательность содержит сайты для сплайсинга (автокаталитические участки, тип интронов 1 или 2), прочие сигналы интрона - то это интрон.
Если было выявлено, что последовательность кодирует что-то осмысленное при определенных физиологических условиях, - то это экзон.
???

Vadim Sharov
Постоянный участник
Россия

22.12.2018 14:37

URL #18

(KCN @ 22.12.2018 12:21)

Т.е. , если мы узнали, что интрон на самом деле что-то кодирует, то он сразу автоматически становится экзоном?

Не автоматически, а лишь при условии реализации в полипептидной цепи. То есть экзон - часть ДНК, которая кодирует часть реального белка.

в большинстве случаев, но о нем таки известно, что он экзон. Экзон может тоже очень долго считаться таким, что ничего не кодирует

Скажем так, после нахождения белка, который содержит последовательность, кодируемую определенной последовательностью ДНК, она перестала называться интроном и стала называться экзоном. Вы сами нашли приер в подтверждение моего определения понятия "экзон". Как видите, не я персонально, предлагаю так разделять экзоны и интроны.

KCN
Постоянный участник
Київ. Україна понад усе! / DELETED

22.12.2018 14:45

URL #19

Тогда да, и я тоже согласен с таким определением экзона и интрона.

Скорее всего, буду действовать по алгоритму изложенному в п.5, удачный опыт применения и публикации подобного подхода, благо, уже есть.

Если попутно удастся получить какие-то кДНК - будем искать новые, еще не открытые экзоны, как в
http://www.jbc.org/content/268/1/686.full.pdf

Сообщение было отредактировано KCN - 05.02.2019 18:34

Nett
Постоянный участник

24.12.2018 11:54

URL #20

>какие ревертазы,
Серии Superscript, например

>полимеразы (для амплификации ДНК в препаративном ПЦР) надо брать для получения
типа Phusion

KCN
Постоянный участник
Київ. Україна понад усе! / DELETED

24.12.2018 16:10

URL #21

Ок, будем-с знать, спасибо!

watchesbiz
Постоянный участник

12.11.2021 18:36

URL #22

https://www.uptrennd.com/post-detail/hints-...-watch~ODY3MDU2
https://anotepad.com/note/read/mqg8p5jm
https://www.crokes.com/replicarolexwatches/profile/
https://ko-fi.com/post/Watches-Shopping-Gui...-Watc-E1E13PZV9
https://www.merchantcircle.com/blogs/replic...x-Watch/1966540
https://www.nairaland.com/6427528/watches-s...de-finding-fake
https://www.vingle.net/posts/3587193
https://fortunetelleroracle.com/sport/replica-watches-280478
https://www.goodreads.com/story/show/132736...ake-rolex-watch
https://www.diigo.com/item/note/85twz/phwr?...2395edb2dac07ea
https://github.com/ReplicawatchesUK/Replica...ake-Rolex-Watch
https://www.reddit.com/user/Bestreplicawatc...ke_rolex_watch/
https://slashdot.org/submission/13306958/wa...ake-rolex-watch
https://www.wattpad.com/1030107359-replica-...guide-finding-a
https://www.instructables.com/member/Fakero...licPreview=true

Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.

Имя:

Отправка сообщений использует JavaScript операции. В вашем броузере не
установлено/отключено выполнение JavaScript программ. Используйте Netscape Navigator
или Internet Explorer (не ранее 3 версии); убедитесь, что выполнение JavaScript
программ разрешено в настройках вашего броузера.