Все форумы > Фирмы > версия для печати
Web-адрес темы: http://molbiol.ru/forums/index.php?s=41a14819b1fef51f7d50914fa4188102&act=ST&f=33&t=516909

SkyGen «предст.»

SkyGen 16.10.2012 10:25
15.92к - Торгово-сервисная компания SkyGen (СкайДжин) - это команда профессионалов, которая поставила перед собой цель сделать доступными реагенты, оборудование и сервис для научных лабораторий в России и странах СНГ.

Под доступностью мы понимаем цены близкие или равные европейским, собственный склад реактивов и оборудования, доставку за 1-3 дня в любой крупный город России. Иными словами, мы делаем все возможное, чтобы поставить Вам качественную продукцию, недорого и быстро. Мы начали с New England Biolabs и у нас получилось!

Мы верим в то, что чтобы быть близким к Вам, недостаточно просто выставлять счета и осуществлять доставку. «Логистических» и «каталожных» компаний много и все они известны.

Нам же важно глубоко разобраться в теме и быть поддержкой для Вас. Для этого мы публикуем новости, обзоры и высоко ценим любые замечания и критику. Каждый продукт мы «пропускаем» через себя. Анализируем плюсы и минусы, представляем, как и где он будет работать, консультируемся с Вами. И, как результат, создаем методички, семинары и презентации.

Мы стараемся угнаться за Вами в научном познании мира, мы стараемся учиться и расти вместе с Вами. Даже уйдя из науки, мы все равно остались в душе искателями и открывателями. Пусть наша работа будет полезна Вам - и в этом мы видим свою реализацию.

Мы являемся официальными дистрибьюторами New England Biolabs, QIAGEN, Agilent Technologies, Oxford Nanopore Technologies, 10x Genomics, Macherey-Nagel, NIMAGEN, IDT, Thermo Scientific, SIGMA-ALDRICH, ChemGenes, Bio Molecular Systems, Gilson.

У нас есть сервисная служба. Мы осуществляем обслуживание, калибровку и поверку дозаторов, лабораторных весов и ПЦР-амплификаторов различных производителей, а также занимаемся организацией валидации оборудования IQ/OQ.
/ Фирмы,  #516909  /
115093, г. Москва, ул. Люсиновская, д. 36, стр. 1
Тел.: +7 495 215-02-22
Факс: +7 495 215-02-22
E-mail: info@skygen.com
Веб-адрес: http://www.skygen.com ( http://www.skygen.com )
Специализация: ПЦР и Реал-тайм ПЦР машины, Спектрофотометры, Спектрометры, Сиквенаторы, Обор. для Капиллярного электрофореза, Автоматические пипетки, Диспенсеры, Центрифуги, Холодильники, Морозильники, Оборудование для хранения, Обор. для Очистки воды, Мебель, Инкубаторы для Бактерий и Клеток, Шейкеры, Гомогенизаторы, Источники ультразвука, Мельницы, Роботы, Автоматическое оборудование, Хим. реактивы, Ферменты и Киты для мол. биологии, Киты для клонирования, Мутагенеза, приготовления Библиотек, Маркеры (ДНК, РНК, белки), Очистка нуклеиновых кислот, Вектора и штаммы для экспрессии белков, Пластик, Пробирки, Пипетки, Олигонуклеотиды, Механическая мастерская
География деятельности: Россия, Белоруссия, Другое в Азии




SkyGen 17.10.2012 17:24
Прикреплённое изображениереклама ( http://molbiol.ru/wiki/Zbio:%D0%A0%D0%B5%D0%BA%D0%BB%D0%B0%D0%BC%D0%B0_%D0%BD%D0%B0_molbiol.ru#.D0.B3.D0.BB.D0.B0.D0.B2.D0.BD.D0.B0.D1.8F_.D1.81.D1.82.D1.80.D0.B0.D0.BD.D0.B8.D1.86.D0.B0 )
C сентября мы (компания SkyGen) являемся эксклюзивным дистрибьютором реактивов NEB в России и СНГ.

Сейчас мы формируем второй октябрьский заказ!
Мы рассчитываем его разместить до 29 октября 2012, в Москву заказ придет сразу после ноябрьских праздников.

Звоните!

+7 (495) 215-02-22
info@skygen.com

ICQ 616631519
Skype skygen-llc



guest: Доктор 17.10.2012 21:57
//...заказ придет сразу после ноябрьских праздников. //

Усраться можно... Быстро-то как!!!!
Ща всё брошу и кинусь учинять срочный заказ.
Слушьте, сокамерники по профессии, а какого долбоёба из нынешнего "православного Правительства" надо проклинать за то, что все поставки оборудования и реактивов в Россию стоят в два раза дороже, чем в Германию и в три раза - чем в Китай? Как зовут этого мудака, персонально?
Какой правительственный дебил устроил это марамойство - ждать поставки сущей лабораторной мелочи... 90 дней? Какой из любителей "стабильности" учинил нам эту засаду?
Поднимите мне веки! )))



SkyGen 18.10.2012 15:16
Увы, это так. Поставка реагентов за 24 часа из Европы логистически возможна (DHL), но сделать это экономно и в белую, заплатив все пошлины и налоги, почти невозможно.
Поэтому мы формируем склад, чтобы охватить 80% всех самых основных реагентов NEB. Этот заказ как раз и направлен, чтобы заполнить наши морозильники основными реагентами.
И тогда доставка за 24-48 часов в любой крупный город России будет возможна!



Atropos 25.10.2012 14:58
А как же СибЭнзим?



Guest 28.10.2012 15:11
Ochen strano, chto novaay company v Russia xochet startovat s prodazi reagentov i laboratornogo plastika, ne imeya dorogogo oborudovaniya. Reaktivi ot NEB budut bezumno dorogimi i konkurirovat s Fermentasom, Invitrogen ot Helicona budet ochen slozno. Na reagentax mnogo deneg ne zarabotat, a esli platitit sotrudnikam menimalnie zarplati, togda ni o kakoj dostavke za 48 chasov govorit nelzay. Nikto iz sotrudnikov kachestvenno rabotat ne zaxochet. V lubom sluchae, welcome to the Russian market and good luck !!!



SkyGen 29.10.2012 19:33
Atropos
А как же СибЭнзим?


CибЭнзим имеет давнюю историю взаимодействия с NEB, но, как Вы знаете, сам выпускает конкурирующую продукцию. Перед СкайДжин же стоит задача именно в продвижении всей линейки реактивов, и именно поэтому мы являемся официальными представителями NEB.

Мы сейчас создаем склад продукции, организуем обучающие семинары, обеспечиваем информационную и техническую поддержку наших клиентов и связь с сотрудниками NEB.



SkyGen 29.10.2012 19:39
Guest
Ochen strano, chto novaay company v Russia xochet startovat s prodazi reagentov i laboratornogo plastika, ne imeya dorogogo oborudovaniya. Reaktivi ot NEB budut bezumno dorogimi i konkurirovat s Fermentasom, Invitrogen ot Helicona budet ochen slozno. Na reagentax mnogo deneg ne zarabotat, a esli platitit sotrudnikam menimalnie zarplati, togda ni o kakoj dostavke za 48 chasov govorit nelzay. Nikto iz sotrudnikov kachestvenno rabotat ne zaxochet. V lubom sluchae, welcome to the Russian market and good luck !!!


Вы правы, на одних реагентах NEB сложно заработать, учитывая, что цены установлены на уровне европейских. Сейчас, купить реактив что в Германии, что в России – почти одна цена. Реактивы у нас всего на 5% выше европейских цен (т.е. по сути ровно на сумму таможенной пошлины) и пока никто из клиентов не жаловался на безумные цены. ))

Но кто сказал, что мы ограничиваемся только NEB?

К нам идет раскапывающая станция для ПЦР, скоро начнем выводить другое оборудование для реал-тайм ПЦР .
Всё впереди, но начали продвижение с реактивов, пластика и "мелкого" общелабораторного оборудования. Если что-то нужно из нашего списка (см. сайт) - вэлком.

По поводу зарплат Ваши опасения напрасны - зарплаты более чем рыночные. Сейчас мы набираем штат. Нам нужны:
- сервисный инженер
- специалист отдела продаж (активные продажи "в полях")
- руководитель отдела логистики
- водитель-экспедитор

Присылайте свои резюме на info@skygen.com.



The Dude 30.10.2012 10:06
"водитель-экспедитор", вот на этом то форуме их и стоит искать! какие категории прав должен иметь работник? На Камаз пойдут?



SkyGen 30.10.2012 13:39
The Dude
"водитель-экспедитор", вот на этом то форуме их и стоит искать! какие категории прав должен иметь работник? На Камаз пойдут?


Чувак, права на Камаз, к сожалению, не годятся. Нам бы категорию B ))



The dude 30.10.2012 14:14
smile.gif Быть может, настанут и такие золотые времена, когда антитела к нам будут возить в Камазных объемахsmile.gif



SkyGen 30.10.2012 15:03
Все в Ваших руках!



SkyGen 06.11.2012 19:33
Прикреплённое изображениеРаздаем каталоги NEB 2012, а это 384 страницы увлекательного чтения !!!

Оставьте заявку ( http://www.skygen.com/2012/11/02/%D1%80%D0%B0%D0%B7%D0%B4%D0%B0%D0%B5%D0%BC-%D0%BA%D0%B0%D1%82%D0%B0%D0%BB%D0%BE%D0%B3%D0%B8-neb-2011-2012/ ), и мы привезем каталог в Вашу лабораторию.

В каталоге представлено полное описанием по группам продукции: эндонуклеазы рестрикции, полимеразы, реактивы для амплификации, ДНК-модифицирующие ферменты, реактивы для клонирования, реагенты для секвенирования следующего поколения, маркеры и стандарты (ДНК, РНК, белки), реагенты для работы с РНК, реактивы для экспрессии и очистки белков, компетентные клетки, реактивы для гликобиологии и эпигенетики, реагенты для клеточного анализа и визуализации.

В дополнение в каталоге есть секция "Technical reference" с таблицами, протоколами, наиболее часто возникающими вопросами и проблемами.



SkyGen 11.11.2012 21:41
Возможность получать Российским научным лабораториям реагенты по ЕВРОПЕЙСКИМ (!) ценам с доставкой за 24-48 часов – вполне реально, если подойти к этому вопросу ответственно.

Цены на NEB СкайДжин установил близкие к Европейским (разница всего в 5% на реагенты до -20С).

Мы работаем с DHL, которая доставляет за 24 часа из Москвы в любой крупный город России. Термоконтейнеры с хладагентами тоже вполне доступная вещь. Они закуплены и ждут своего «часа».

Всё готово. Самый главный вопрос для нас: «что всегда держать на складе?».

В начале следующей недели (12-15 ноября 2012) мы получаем очередную партию NEB, которая должна сформировать 70-80% ассортимента склада. Для этого мы проанализировали TOP100 продаваемых ферментов в Европе, посмотрели, что хотят Российские лаборатории и составили список. Наверняка мы что-то упустили, а где-то были слишком оптимистичны.

Поэтому и нужна ваша помощь! Будем очень благодарны за любую обратную связь по реагентам NEB. Чем чаще всего пользуется Ваша лаборатория?

И ещё просьба. Какие другие реагенты/ферменты Вы хотели бы видеть в России по нормальным ценам? Готов начать переговоры с производителями.

Гуреев Дмитрий Владимирович
Генеральный директор ООО «СкайДжин»




SkyGen 11.11.2012 21:52
реклама ( http://molbiol.ru/wiki/Zbio:%D0%A0%D0%B5%D0%BA%D0%BB%D0%B0%D0%BC%D0%B0_%D0%BD%D0%B0_molbiol.ru#.D0.B3.D0.BB.D0.B0.D0.B2.D0.BD.D0.B0.D1.8F_.D1.81.D1.82.D1.80.D0.B0.D0.BD.D0.B8.D1.86.D0.B0 )

Прикреплённое изображениеПрикреплённое изображениеСерия реактивов NEBNext® для секвенирования следующего поколения

Предлагаем вашему вниманию серию реактивов NEBNext® производства NewEngland BioLabs для создания библиотек ДНК и РНК для секвенирования следующего поколения (NGS).

Наборы и мастер-миксы реактивов этой серии разработаны с учетом специфики имеющихся на сегодняшний день платформ для NGS: Roche 454; ABSOLiD, lluminaGAII и AB IonTorrent. Все наборы и мастер-миксы прошли функциональную валидацию – приготовление библиотек геномной ДНК или ChIP-Seq-ДНК с последующим секвенированием на соответствующих платформах.

NEBпредлагает также уникальный фермент NEBNext® дцДНК-фрагментазу, позволяющий получать фрагменты ДНК размером от 100 до 800 п.н. в зависимости от времени проведения реакции. Фрагментация матрицы с помощью NEBNext® дцДНК-фрагментазы позволяет получать фрагменты ДНК с более высоким практическим выходом нежели при использовании механической фрагментации с применением соникаторов и небулизаторов.

На рисунке показано распределение относительного размера фрагментов ДНК E.coli, полученных обработкой образца ДНК дцДНК-фрагментазой (синяя кривая) и пневматическим небулизатором (зеленая кривая), визуализированное с помощью анализатора Bioanalyzer 2100.

Образец, обрабатываемый дцДНК-фрагментазой, инкубировали в течение 30 минут при 37°C в 1X буфере для фрагментазы с БСА (100 мкг/мкл) при соотношении 0.05 мкг ДНК на 1 мкл дцДНК-фрагментазы. Образец, фрагментированный с помощью небулайзера, был подвергнут распылению в 50% глицерине в течение 6 минут при давлении 35 psi (2.41 Бар).
Прикреплённое изображение



Файл/ы:

Скачать файл SkyGen_pricelist_NEB_NEBNext_2012.11.11.pdf
Размер:: 336.33к
кол-во скачиваний: 3930




Guest 14.11.2012 22:30
smile.gif фрагментаза от неб зафигачила все мои 500бп вставки в 200 - ну и нафига нужна мне эта радость



vtosha 14.11.2012 22:44
NGS-ные наборы для пробоподготовки НЕБовские очень удобны, лучше, чем Иллюминовские. Более полные, более компактные, с разноцветными крышечками для каждой операции, указан полный состав буферов, олигов и прочих компонентов. Для малой РНК, например, по-любому нужно отдельную НЕБовскую лигазу закупать, в Иллюминовский набор она не входит. И вообще, у НЕБа отдельные модули для каждой операции можно купить, что несомненный плюс.
Ещё понравились модули для работы с РНК, модуль для синтеза второй цепи очень бодренько расходиться стал, когда чипы стали делать. Шарики для выделения поли-А-РНК постоянно используются.
Фрагментаза сейчас - самый дешёвый вариант фрагментирования, хотя, конечно, надо на каждой новой ДНК её заново опробовать, да и при хитросложной ДНК могут быть всякие подводные камни.
Впрочем, не знаю, имеет ли смысл держать это всё на складе постоянно. Всё-таки не такие потоки NGSа в этой стране, чтобы это было выгодно.



Guest 14.11.2012 22:47
(vtosha @ 14.11.2012 22:44)
Ссылка на исходное сообщение  НГС-ные наборы для пробоподготовки НЕБовские очень удобны, лучше, чем Иллюминовские. Более полные, более компактные, с разноцветными крышечками для каждой операции, указан полный состав буферов, олигов и прочих компонентов. Для малой РНК, например, по-любому нужно отдельную НЕБовскую лигазу закупать, в Иллюминовский набор она не входит.  И вообще, у НЕБа отдельные модули для каждой операции можно купить, что несомненный плюс. 
Ещё понравились модули для работы с РНК, модуль для синтеза второй цепи очень бодренько расходиться стал, когда чипы стали делать. 
Фрагментаза сейчас - самый дешёвый вариант фрагментирования, хотя, конечно, надо на каждой новой ДНК её заново опробовать, да и при хитросложной ДНК могут быть всякие подводные камни.
Впрочем, не знаю, имеет ли смысл держать это всё на складе постоянно. Всё-таки не такие потоки НГСа в этой стране, чтобы это было выгодно.


ерунда - все можно сделать самому не хуже НЕБа - если конечно ручки растут из того места smile.gif



Guest 14.11.2012 22:50
(vtosha @ 14.11.2012 22:44)
Ссылка на исходное сообщение  НГС-ные наборы для пробоподготовки НЕБовские очень удобны, лучше, чем Иллюминовские. Более полные, более компактные, с разноцветными крышечками для каждой операции, указан полный состав буферов, олигов и прочих компонентов. Для малой РНК, например, по-любому нужно отдельную НЕБовскую лигазу закупать, в Иллюминовский набор она не входит.  И вообще, у НЕБа отдельные модули для каждой операции можно купить, что несомненный плюс. 
Ещё понравились модули для работы с РНК, модуль для синтеза второй цепи очень бодренько расходиться стал, когда чипы стали делать. Шарики для выделения поли-А-РНК постоянно используются. 
Фрагментаза сейчас - самый дешёвый вариант фрагментирования, хотя, конечно, надо на каждой новой ДНК её заново опробовать, да и при хитросложной ДНК могут быть всякие подводные камни.
Впрочем, не знаю, имеет ли смысл держать это всё на складе постоянно. Всё-таки не такие потоки НГСа в этой стране, чтобы это было выгодно.


обычным зоникатором я получаю в 100 раз лучше хфрахметазы smile.gif
200 бп - в линию , а не в шмер



SkyGen 15.11.2012 12:58
(vtosha @ 14.11.2012 23:44)
Ссылка на исходное сообщениеВпрочем, не знаю, имеет ли смысл держать это всё на складе постоянно. Всё-таки не такие потоки NGSа в этой стране, чтобы это было выгодно.


Как раз сейчас мы и "прощупываем" размер рынка по NGS. На самом деле запросов довольно много.
Будем признательны, если расскажете, какими реактивами чаще всего пользуются в вашей лаборатории.



SkyGen 15.11.2012 13:09
(guest: Натали @ 15.11.2012 01:59)
Ссылка на исходное сообщение Скажите,  почему, к примеру, среди прочих немногих  продуктов у вас на сайте представлен прайс на пластик - один в один Axygen? Им торгует Интерлабсервис.

Тем не менее, у вас же на сайте написано :"С сентября 2012 мы представляем в России таких производителей как New England Biolabs (США), Sorenson BioScience (США), Dornier-LTF (Германия). "

При этом других прайсов на пластик у вас нет.


Натали, мы действительно представляем пластик производства Sorenson BioScience. Большой морской контейнер в пути и, к сожалению, идет довольно длительное время.

Но поскольку текущие запросы нужно удовлетворять, временно мы реализуем пластик Axygen, поскольку ассортимент наиболее близок к Sorenson BioScience.
На следующей неделе мы надеемся, что переедем на новый сайт. К нему мы подготовили брошюру уже по продукции Sorenson (она во вложении).



Файл/ы:

Скачать файл SkyGen_broshure_Sorenson_048.pdf
Размер:: 1.56мб
кол-во скачиваний: 8966




vtosha 15.11.2012 16:09
Про НЕБ уже рассказала.
Киагеновские и Амбионовские наборы для выделения ДНК и РНК. Инвитрогеновские суперскрипты - ценнейшая вещь. Аджилентовские реагенты для биоанализатора.
Для реал-тайма что-то заказывать за рубежом нет смысла - наши и так всё замечательно делают.



SkyGen 20.11.2012 16:57
(vtosha @ 15.11.2012 17:09)
Ссылка на исходное сообщение  Про НЕБ уже рассказала.
Киагеновские и Амбионовские наборы для выделения ДНК и РНК. Инвитрогеновские суперскрипты - ценнейшая вещь. Аджилентовские реагенты для биоанализатора.
Для реал-тайма что-то заказывать за рубежом нет смысла - наши и так всё замечательно делают.


Поняла, спасибо большое!



mlog 22.11.2012 00:21
У вас действительно всё перечисленное тут: http://www.skygen.com/app/download/6869041...df?t=1351529455 ( http://www.skygen.com/app/download/6869041284/SkyGen+%D0%BF%D1%80%D0%B0%D0%B9%D1%81-%D0%BB%D0%B8%D1%81%D1%82+NEB+2012.10.29.pdf?t=1351529455 )
есть на складе в Москве? Вы не шутите? eek.gif



mlog 22.11.2012 00:50
(SkyGen @ 20.11.2012 17:57)
Ссылка на исходное сообщение  Поняла, спасибо большое!

очень сильно плюсую насчёт наборов для Agilent - их нынешний дистрибьютер просто совсем никуда не годится. По пол-года ждать приходится! mad.gif



vtosha 22.11.2012 11:50
Про то, что находящееся в прайс-листе есть на складе, я думаю, это литературное преувеличение, всё-таки. Там написано "цены со склада в Москве", а не "цены на то, что есть на складе в Москве":).



SkyGen 22.11.2012 12:22
(mlog @ 22.11.2012 01:21)
Ссылка на исходное сообщение  У вас действительно всё перечисленное тут: http://www.skygen.com/app/download/6869041...df?t=1351529455 ( http://www.skygen.com/app/download/6869041284/SkyGen+%D0%BF%D1%80%D0%B0%D0%B9%D1%81-%D0%BB%D0%B8%D1%81%D1%82+NEB+2012.10.29.pdf?t=1351529455 )
есть на складе в Москве? Вы не шутите?  eek.gif

Пока, конечно, не все.

Сейчас мы завезли самые стандартные позиции - эндонуклеазы рестрикции, ферменты для ПЦР и т.д.

Но мы все время расширяем ассортимент, надеемся, что уже в следующем году сможем удовлетворить большинство Ваших запросов со склада. Но для этого нам нужна обратная связь от Вас - чем чаще всего пользуетесь?



SkyGen 22.11.2012 12:41
(vtosha @ 22.11.2012 12:50)
Ссылка на исходное сообщение  Про то, что находящееся в прайс-листе есть на  складе, я думаю, это литературное преувеличение, всё-таки.  Там написано "цены со склада в Москве", а не "цены на то, что есть на складе в Москве":).


"цены со склада в Москве" - это значит, что цены не включают в себя транспортные расходы при доставке из Москвы в другой город )))



SkyGen 22.11.2012 20:46
реклама ( http://molbiol.ru/wiki/Zbio:%D0%A0%D0%B5%D0%BA%D0%BB%D0%B0%D0%BC%D0%B0_%D0%BD%D0%B0_molbiol.ru#.D0.B3.D0.BB.D0.B0.D0.B2.D0.BD.D0.B0.D1.8F_.D1.81.D1.82.D1.80.D0.B0.D0.BD.D0.B8.D1.86.D0.B0 )

Прикреплённое изображение28 ноября мы размещаем очередной заказ на продукцию NEB, чтобы импорт прошел до 10-го декабря и не возникло никаких задержек на таможне в связи с концом года.

Убедительная просьба для всех "зреющих" - дайте знать о себе!
Сейчас есть хорошая возможность получить реактив до конца года.

Мы принимаем оплату наличными!

На сегодняшний день в Москве уже есть склад самых популярных ферментов. Полный список приведен в приложенном файле.



Файл/ы:

Скачать файл SkyGen_NEB_stock_2012.11.22.pdf
Размер:: 368.32к
кол-во скачиваний: 3261




mlog 18.12.2012 15:14
Сегодня получила реагенты по заказу, сделанному в начале декабря. Причём без предоплаты. По российским меркам скорость просто беспрецедентная. Всем конкурентам советую брать пример!



comp3v 18.12.2012 22:16
да, тоже могу подтвердить - доставили быстро, и стойко выдержали все закидоны нашего #$@нутого отдела снабжения.



vtosha 18.12.2012 23:37
Нам завтра обещали, с того же времени заказа. Посмотрим, как с нашей бухгалтерией справятся...



SkyGen 19.12.2012 09:12
mlog, comp3v,

спасибо, мы очень старались ))
Удачных Вам экспериментов!



SkyGen 16.01.2013 13:16
реклама ( http://molbiol.ru/wiki/Zbio:%D0%A0%D0%B5%D0%BA%D0%BB%D0%B0%D0%BC%D0%B0_%D0%BD%D0%B0_molbiol.ru#.D0.B3.D0.BB.D0.B0.D0.B2.D0.BD.D0.B0.D1.8F_.D1.81.D1.82.D1.80.D0.B0.D0.BD.D0.B8.D1.86.D0.B0 )
Прикреплённое изображениеСегодня стартовал долгожданный новый web-сайт NEB - https://www.neb.com/ ( https://www.neb.com/ )
Новые онлайн-инструменты, расширенный поиск и многое другое...

Кроме того, есть изменения и в продуктовом портфолио компании.

Актуальный прайс-лист на 2013 год Вы можете скачать на нашем сайте:
http://www.skygen.com/proizvoditeli/new_england_biolabs/ ( http://www.skygen.com/proizvoditeli/new_england_biolabs/ )
Прикреплённое изображение



SkyGen 22.01.2013 12:14
Дорогие клиенты!

Новый год начался с больших перемен в нашей скромной компании.

Во-первых, обновился ли прайс-лист на продукцию NEB, более 100 товаров снято с производства, есть новые реактивы. Полный прайс-лист Вы можете скачать на нашем сайте:
http://www.skygen.com/proizvoditeli/new_england_biolabs/ ( http://www.skygen.com/proizvoditeli/new_england_biolabs/ )

На прошлой неделе стартовал долгожданный новый web-сайт NEB – https://www.neb.com/ ( https://www.neb.com/ ) – новые онлайн-инструменты, расширенный поиск и многое другое...

Во-вторых, к нам, наконец, приплыл контейнер с лабораторным пластиком. Наконечники, микропробирки и планшеты производства Sorenson BioScience (США) теперь всегда в наличии:
http://www.skygen.com/proizvoditeli/sorenson_bioscience/ ( http://www.skygen.com/proizvoditeli/sorenson_bioscience/ )

С этого года мы также представляем дозаторы Gilson:
http://www.skygen.com/proizvoditeli/gilson/ ( http://www.skygen.com/proizvoditeli/gilson/ )

Также, начала работу наша сервисная служба – по обслуживанию, калибровке и поверке дозаторов и лабораторных весов любых производителей:
http://www.skygen.com/servis/ ( http://www.skygen.com/servis/ )

Наши специалисты и лично я с удовольствием ответим на все Ваши вопросы!

P.S. как Вы могли заметить, мы тоже переехали на новый сайт! Здесь всегда можно найти самую актуальную информацию.



SkyGen 04.02.2013 16:23
реклама ( http://molbiol.ru/wiki/Zbio:%D0%A0%D0%B5%D0%BA%D0%BB%D0%B0%D0%BC%D0%B0_%D0%BD%D0%B0_molbiol.ru#.D0.B3.D0.BB.D0.B0.D0.B2.D0.BD.D0.B0.D1.8F_.D1.81.D1.82.D1.80.D0.B0.D0.BD.D0.B8.D1.86.D0.B0 )
Прикреплённое изображениеБесплатные ферменты от NEB!!!

Уважаемые клиенты!
В феврале проходила совместная акция SkyGen и New England Biolabs.

Полагаем, что о высоком качестве ферментов NEB слышало множество лабораторий. В феврале была возможность на собственной практике убедиться в этом. Совершенно бесплатно.

Для отправки заявки достаточно было заполнить небольшую анкету и любые 2 фермента из 26 доставлялись в Вашу лабораторию.

В акции приняло участие множество лабораторий по всей России!
Мы очень рады знакомству с Вами.

Теперь акция закончилась, но Вы всегда можете заказать у нас по обычной цене любой интересующий фермент NEB из нашего прайса ( http://skygen.tmweb.ru/proizvoditeli/new_england_biolabs/ ).



SkyGen 01.03.2013 12:36
реклама ( http://molbiol.ru/wiki/Zbio:%D0%A0%D0%B5%D0%BA%D0%BB%D0%B0%D0%BC%D0%B0_%D0%BD%D0%B0_molbiol.ru#.D0.B3.D0.BB.D0.B0.D0.B2.D0.BD.D0.B0.D1.8F_.D1.81.D1.82.D1.80.D0.B0.D0.BD.D0.B8.D1.86.D0.B0 )

Увеличиваем до 20% скидку по дисконтной карте на весь лабораторный пластик Sorenson BioScience (США)


В честь наступления весны мы решили сделать подарок всем держателям дисконтных карт SkyGen. С 1 марта по 31 мая 2013 скидка по карте увеличивается c 5% до 20% весь пластик Sorenson Bioscience (США) со склада.

Вы можете купить один штатив с наконечниками или целую транспортную коробку с пробирками. За наличный расчет или по договору с отсрочкой платежа. Скидка в 20% будет действовать на любое количество заказов, оформленных до 31 мая 2013 и с предполагаемой датой отгрузки не позднее 15 июня 2013.

Мы верим, что возможность приобрести высококачественный штатовский пластик по очень низким ценам и быстрой поставкой станет прекрасным дополнением к весеннему настроению.
Прикреплённое изображение
У вас нет дисконтной карты?

Если нет, то до 30 апреля 2013 действует упрощенная система получения. Вам достаточно в период с 1 марта по 30 апреля 2013 выполнить одно из двух условий:

- сдать не менее 2-х дозаторов на калибровку и обслуживание,
- сделать заказ на дозаторы Gilson или лабораторный пластик на сумму от 15 000 руб.

Подробную информацию о пластике Sorenson BioScience Вы можете найти на нашем сайте ( http://www.skygen.com/produktsiya/osnovnye_razdely/laboratornyy_plastik/ ).



Файл/ы:

Скачать файл Sorenson_pricelist.pdf
Размер:: 4.63мб
кол-во скачиваний: 5410




udalov maksim 12.03.2013 14:57
здравстствуйте!

после 30 апреля можно будет карту оформить?
купили бы сейчас, да деньги грантовские придут ещё оочень не скоро (



SkyGen 12.03.2013 18:29
Добрый день, Максим!

Спасибо за вопрос.

На данный момент мы зафиксировали упрощенную схему до 30 апреля 2013.
Не обязательно покупать пластик, можно просто сдать 2 дозатора на калибровку. Это процедура в любом случае нужная и цена очень небольшая (около 500 руб. за комплекс работ по одному дозатору).

Вопрос с оплатой можно решить через договор с отсрочкой платежа.
Большой отсрочкой, чтобы хватило до прихода гранта. Это один путь.

Есть и второй путь. Карточка выдаётся тем клиентам, с которыми мы реализовываем какие-либо совместные проекты: они порекомендовали лаборатории, раскрыли какую-нибудь интересную нам тему, научный обзор по нашей тематике или дали полезную информацию. Здесь нет чётких правил.

Можете написать в личку свои координаты?



SkyGen 12.03.2013 19:09
Уважаемые коллеги!

Мы периодически слышим от Вас запросы на сервисные комплекты для дозаторов Gilson. Прокладки, уплотнительные кольца, держатели. Мы задумались, чтобы привезти такие комплекты.

Цены пока мы не определили, но получается около 350 руб. за прокладку с уплотнительным кольцом и 1700 за набор из держателя наконечника, 3 прокладок с уплотнительными кольцами.

Что Вы думаете по этой теме?
Нужны ли Вам такие ремонтные наборы?
Если да, то купили бы?
Готовы ли сделать ни к чему юридически не обязывающий предзаказ?

Будем рады услышать любое мнение.

Спасибо.



SkyGen 19.03.2013 19:58
Коллеги!

25 марта к нам уходит очередная поставка NEB. Поэтому если Вы сомневались - сейчас самое время сообщить нам о своем желании приобрести ферменты.

Поскольку на дворе начало года, готовы обсудить продажу за наличные, отсрочку/рассрочку.

Ферменты будут у нас на складе в первых числах апреля!

Из-за майских праздников следующая поставка будет только в середине мая.



SkyGen 03.04.2013 11:54
реклама ( http://molbiol.ru/wiki/Zbio:%D0%A0%D0%B5%D0%BA%D0%BB%D0%B0%D0%BC%D0%B0_%D0%BD%D0%B0_molbiol.ru#.D0.B3.D0.BB.D0.B0.D0.B2.D0.BD.D0.B0.D1.8F_.D1.81.D1.82.D1.80.D0.B0.D0.BD.D0.B8.D1.86.D0.B0 )

Прикреплённое изображениеУважаемые клиенты!

На нашем сайте заработал интернет-магазин ( http://www.skygen.com/produktsiya/ )!!!

Уже сейчас Вы можете посмотреть текущие цены на ферменты NEB ( http://www.skygen.com/proizvoditeli/new_england_biolabs/catalog/ ), дозаторы Gilson ( http://www.skygen.com/proizvoditeli/gilson/catalog/ ), пластик Sorenson BioScience ( http://www.skygen.com/proizvoditeli/sorenson_bioscience/ ), общелабораторное оборудование BioSan ( http://www.skygen.com/proizvoditeli/biosan/ ), отложить нужную продукцию в корзину и отправить нам заказ в электронном виде. В разделе New England Biolabs Вы также сможете увидеть, какие ферменты есть на складе и быстро получить дополнительную информацию с сайта производителя. В ближайшее время мы откроем функционал по остаткам товаров по другим производителям, будем наполнять каталог актуальной технической информацией и фотографиями.

Первым 20 клиентам, которые оформят заказ через сайт, мы подарим дисконтную карту. До 30 мая 2013 по этой карте Вы получите скидку в 20% на весь пластик Sorenson. Карта будет выдана вместе с товаром. Также мы разыграем 3 дисконтных карты среди самых активных «критиков» нашего сайта, которые дадут конструктивные пожелания по улучшению функционала, найдут ошибки и укажут на неточности.

Мы хотим сделать сайт удобным, а без Ваших отзывов это будет сложно!



tatayou 03.04.2013 14:49
Здравствуйте, хотела бы высказать пожелание, по поводу сайта. На мой взгляд, было бы удобно, если бы рядом с названием рестриктаз был указан их сайт рестрикции и/или прототип. Тк для получения этой информации необходимо жать на каждую рестриктазу, что занимает очень много времени. Вот, например, в печатном каталоге Ферментас есть такая таблица, что сильно облегчает поиск.
Скажите, как можно получить печатный каталог NEB?



comp3v 03.04.2013 15:30
(tatayou @ 03.04.2013 15:49)
Ссылка на исходное сообщение  Здравствуйте, хотела бы высказать пожелание, по поводу сайта. На мой взгляд, было бы удобно, если бы рядом с названием рестриктаз был указан их сайт рестрикции и/или прототип. Тк для получения этой информации необходимо жать на каждую рестриктазу, что занимает очень много времени.
а по-моему, мало смысла загружать страницу заказа такой информацией: обычно исследователь заранее определяется, какой фермент ему нужен. Можно разве что дать ссылки на специализирвоанные ресурсы типа REBase - поиск по последовательности ( http://rebase.neb.com/cgi-bin/seqspelist?r ), неошизомеры ( http://rebase.neb.com/cgi-bin/neolist ), и т.п.



Guest 14.04.2013 19:08
(SkyGen @ 03.04.2013 11:54)
Ссылка на исходное сообщение  реклама ( http://molbiol.ru/wiki/Zbio:%D0%A0%D0%B5%D0%BA%D0%BB%D0%B0%D0%BC%D0%B0_%D0%BD%D0%B0_molbiol.ru#.D0.B3.D0.BB.D0.B0.D0.B2.D0.BD.D0.B0.D1.8F_.D1.81.D1.82.D1.80.D0.B0.D0.BD.D0.B8.D1.86.D0.B0 )

Прикреплённое изображениеУважаемые клиенты!

На нашем сайте заработал интернет-магазин ( http://www.skygen.com/produktsiya/ )!!!

Уже сейчас Вы можете посмотреть текущие цены на ферменты НЕБ ( http://www.skygen.com/proizvoditeli/new_england_biolabs/catalog/ ), дозаторы Гилсон ( http://www.skygen.com/proizvoditeli/gilson/catalog/ ), пластик Соренсон БиоСциенце ( http://www.skygen.com/proizvoditeli/sorenson_bioscience/ ), общелабораторное оборудование БиоСан ( http://www.skygen.com/proizvoditeli/biosan/ ), отложить нужную продукцию в корзину и отправить нам заказ в электронном виде. В разделе Нещ Енгланд Биолабс Вы также сможете увидеть, какие ферменты есть на складе и быстро получить дополнительную информацию с сайта производителя. В ближайшее время мы откроем функционал по остаткам товаров по другим производителям, будем наполнять каталог актуальной технической информацией и фотографиями.

Первым 20 клиентам, которые оформят заказ через сайт, мы подарим дисконтную карту. До 30 мая 2013 по этой карте Вы получите скидку в 20% на весь пластик Соренсон. Карта будет выдана вместе с товаром. Также мы разыграем 3 дисконтных карты среди самых активных «критиков» нашего сайта, которые дадут конструктивные пожелания по улучшению функционала, найдут ошибки и укажут на неточности.

Мы хотим сделать сайт удобным, а без Ваших отзывов это будет сложно!


я в германии и вашу фирму в первый раз вижу - в чем крутяк ?



SkyGen 18.04.2013 20:38
реклама ( http://molbiol.ru/wiki/Zbio:%D0%A0%D0%B5%D0%BA%D0%BB%D0%B0%D0%BC%D0%B0_%D0%BD%D0%B0_molbiol.ru#.D0.B3.D0.BB.D0.B0.D0.B2.D0.BD.D0.B0.D1.8F_.D1.81.D1.82.D1.80.D0.B0.D0.BD.D0.B8.D1.86.D0.B0 )

Прикреплённое изображение Прикреплённое изображение
Соберите подснежники!


Наступила весна и появились подснежники, первые цветы весны. Они появились и у нас на сайте ( http://www.skygen.com/produktsiya/ ).

Если Вы найдете в нашем интернет-каталоге товар с подснежником, то знайте, что на него действует специальная цена при оформлении заказа через сайт. Скидка (от 10% до 20%) и сам товар с подснежниками постоянно меняются! Количество товара ограничено.

Акция действует, пока не растает снег в лесу. Спешите!

А еще мы сделали удобный поиск по наконечникам в нашем каталоге ( http://www.skygen.com/catalog/laboratornyy_plastik/sorenson/?arrCatalogListFilter_pf%5BNALICHIE_FILTRA%5D=&arrCatalogListFilter_pf%5BSTERILNOST%5D=&arrCatalogListFilter_pf%5BTIP_NAKONECHNIKA%5D=&arrCatalogListFilter_pf%5BTIP_UPAKOVKI%5D=&arrCatalogListFilter_pf%5BTSVET%5D=&arrCatalogListFilter_pf%5BMAKSIMALNYY_OBEM_MKL%5D=&set_filter=%CF%EE%E4%EE%E1%F0%E0%F2%FC+%EF%EE+%EF%E0%F0%E0%EC%E5%F2%F0%E0%EC&set_filter=Y ). Теперь достаточно выбрать параметры наконечника и сайт сам покажет нужный Вам пластик.



SkyGen 07.06.2013 17:51
Приглашаем посетить стенд NEB на FEBS в Санкт-Петербурге

Прикреплённое изображениеС 6 по 11 июля 2013 года в Санкт-Петербургe пройдет ежегодный Конгресс Федерации европейских биохимических обществ (FEBS).

Стенд New England Biolabs располагается на 1 этаже, стенд №127.

В рамках форума будет проведено 40 тематических симпозиумов, по ключевым проблемам современной общей и медицинской биохимии, биофизике, протеомике, геномике, биоинформатике, молекулярной биологии, биотехнологии, иммунологии, биологии стволовых клеток, клеточной биологии и др.

На конгресс в Санкт-Петербурге соберутся 12 нобелевских лауреатов, среди которых Ричард Робертс, главный научный сотрудник NEB. 10 июля он будет читать лекцию "Бактериальные метиломы"

По сложившейся традиции, перед основной частью Конгресса FEBS, с 3 по 6 июля, в Российской академии наук и Санкт-Петербургском государственном университете в 13-ый раз состоится Форум молодых ученых.

Подробную информацию о FEBS можно посмотреть на сайте: www.febs-2013.org ( http://www.febs-2013.org ).



Guest 19.06.2013 22:17
Интересный ожидается конгресс



SkyGen 20.06.2013 13:26
реклама ( http://molbiol.ru/wiki/Zbio:%D0%A0%D0%B5%D0%BA%D0%BB%D0%B0%D0%BC%D0%B0_%D0%BD%D0%B0_molbiol.ru#.D0.B3.D0.BB.D0.B0.D0.B2.D0.BD.D0.B0.D1.8F_.D1.81.D1.82.D1.80.D0.B0.D0.BD.D0.B8.D1.86.D0.B0 )

Обновление линейки эндонуклеаз рестрикции компании New England Biolabs

Прикреплённое изображениеПочти 40 лет назад компания New England Biolabs первая в мире поставила производство ферментов рестрикции на коммерческую основу и с тех пор не сдает лидерских позиций, постоянно совершенствуя свою продукцию. Так и в начале 2013 года компания внедрила целый ряд нововведений, касающихся эндонуклеаз рестрикции.

Во-первых, произошли изменения состава буферных систем, которые применяются совместно с эндонуклеазами рестрикции.

В состав всех буферов теперь входит бычий сывороточный альбумин (БСА), который стабилизирует некоторые ферменты рестрикции и предотвращает их адгезию на поверхности реакционных пробирок и наконечников дозаторов.

Вследствие этого БСА теперь не входит в комплекты поставки ферментов в отдельных пробирках, и нет нужды добавлять его в реакционную смесь. Это сокращает время, необходимое для постановки реакций. При необходимости БСА можно приобрести отдельно. В 2013 году компания NEB начала выпускать улучшенную версию БСА – БСА высокой степени очистки ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/endonukleazy_restriktsii/neb-bufery/bychiy_syvorotochnyy_albumin_bsa_vysokoy_stepeni_ochistki/?sphrase_id=782#item22952 ).

Из состава буферов был изъят ДТТ. Многочисленные исследования показали, что наличие ДТТ в составе реакционной смеси не влияет на активность рестриктаз.

Вследствие изменения состава произошла также смена наименований буферов. Теперь буферая система состоит из: NEB-буфера 1.1 ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/endonukleazy_restriktsii/neb-bufery/neb-bufer_11/?brand= ), NEB-буфера 2.1 ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/endonukleazy_restriktsii/neb-bufery/neb-bufer_21/?brand= ), NEB-буфера 3.1 ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/endonukleazy_restriktsii/neb-bufery/neb-bufer_31/?brand= ) и NEB-буфера CutSmart ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/endonukleazy_restriktsii/neb-bufery/neb-bufer_cutsmart/?brand= ).

Изменение состава буферов позволило увеличить число ферментов (>200), которые наиболее активны в одном буфере - буфере CutSmart. Это очень удобно при проведении реакции двойной рестрикции. Необходимо отметить, что многие ферменты, модифицирующие ДНК и используемые в клонировании, также активны в буфере CutSmart.

Цветовая кодировка буферов сохранилась. В случае необходимости старые буферы можно приобрести отдельно – они остаются в продаже.

Во-вторых, для многих ферментов концентрация увеличена до 10 000 е.а./мл. Увеличение концентрации фермента приводит к уменьшению в реакционной смеси концентрации глицерина, который может влиять на активность рестриктазы.

Увеличилось количество поставки (в е.а.) для рестриктаз SapI ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/endonukleazy_restriktsii/standartnye_restriktazy/sapi/?brand= ), EciI ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/endonukleazy_restriktsii/standartnye_restriktazy/ecii/?brand= ), BceAI ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/endonukleazy_restriktsii/standartnye_restriktazy/bceai/?brand= ), CviAII ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/endonukleazy_restriktsii/standartnye_restriktazy/cviaii/?brand= ), BmrI ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/endonukleazy_restriktsii/standartnye_restriktazy/bmri/?brand= ).

В-третьих, произошло ужесточение требований к понятию «Time-Saver рестриктаза». Если раньше Time-Saver рестриктазами назывались все те ферменты, которые расщепляли субстратную ДНК в течение 5-15 минут при соблюдении рекомендуемых условий реакции, то теперь добавилось еще одно условие - фермент не должен проявлять неспецифическую активность при длительной инкубации.

В связи с этим количество Time-Saver рестриктаз, поставляемых компанией NEB, немного сократилось (>180), но NEB не прекращает генно-инженерные работы по разработке ферментов со сниженной неспецифической активностью.

В-четвертых, была модернизирована карточка продукта, вкладываемая в каждый комплект поставки. Теперь она содержит только ту информацию, которая необходима для постановки реакции рестрикции.

Прикреплённое изображениеПрикреплённое изображение

С дополнительной информацией, включая спецификацию и сертификат качества, вы можете ознакомиться, просканировав представленный на карточке QR-код или посетив соответствующую Web-страницу на сайте компании NEB.

Наконец, было произведено обновление онлайн-программы Double Digest Finder ( https://www.neb.com/tools-and-resources/interactive-tools/double-digest-finder ) с учетом выше перечисленных изменений.

Актуальные цены Вы всегда можете посмотреть в интернет-каталоге на сайте SkyGen:
http://www.skygen.com/catalog/biohimichesk...zy_restriktsii/ ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/endonukleazy_restriktsii/ )

Для многих рестриктаз уже готовы описания на русском языке!



SkyGen 28.06.2013 15:31
реклама ( http://molbiol.ru/wiki/Zbio:%D0%A0%D0%B5%D0%BA%D0%BB%D0%B0%D0%BC%D0%B0_%D0%BD%D0%B0_molbiol.ru#.D0.B3.D0.BB.D0.B0.D0.B2.D0.BD.D0.B0.D1.8F_.D1.81.D1.82.D1.80.D0.B0.D0.BD.D0.B8.D1.86.D0.B0 )

Даем скидку на ферменты NEB в обмен на старые пробирки от ферментов других производителей
Прикреплённое изображение

С 1 июля SkyGen запускает акцию: даем 10% скидку на ферменты NEB в обмен на старые пробирки от ферментов других производителей.

За одну сданную пробирку дается скидка на одну упаковку аналогичного фермента NEB. Акция не распространяется на наборы и киты.

Акция действует до 1 сентября!

Полный список товаров, попадающих под акцию, Вы можете уточнить у Вашего менеджера по телефону +7 (495) 215-02-22, info@skygen.com.
user posted image ( http://www.skygen.com )



SkyGen 05.08.2013 12:31
реклама ( http://molbiol.ru/wiki/Zbio:%D0%A0%D0%B5%D0%BA%D0%BB%D0%B0%D0%BC%D0%B0_%D0%BD%D0%B0_molbiol.ru#.D0.B3.D0.BB.D0.B0.D0.B2.D0.BD.D0.B0.D1.8F_.D1.81.D1.82.D1.80.D0.B0.D0.BD.D0.B8.D1.86.D0.B0 )

Прикреплённое изображениеSkyGen дарит iPod или ручку Parker при покупке лабораторного пластика

Некоторые из Вас уже успели оценить штатовский пластик Sorenson, а теперь есть возможность получить еще и личный подарок при очередном заказе!

При покупке наконечников, пробирок и/или плашек Sorenson BioScience на сумму от 25 000 рублей и заполнении небольшой анкеты с отзывом Вы получите в подарок (на ваш выбор):

iPod Shuffle
user posted image
или ручку Parker
user posted image

Подробности смотрите на нашем сайте ( http://www.skygen.com/novosti/darim_ipod_ili_ruchku_parker_pri_pokupke_laboratornogo_plastika/ )!



SkyGen 15.09.2013 19:28
реклама ( http://molbiol.ru/wiki/Zbio:%D0%A0%D0%B5%D0%BA%D0%BB%D0%B0%D0%BC%D0%B0_%D0%BD%D0%B0_molbiol.ru#.D0.B3.D0.BB.D0.B0.D0.B2.D0.BD.D0.B0.D1.8F_.D1.81.D1.82.D1.80.D0.B0.D0.BD.D0.B8.D1.86.D0.B0 )

Акция СкайДжин: бесплатный синтез 2-х олигонуклеотидов от IDT (Integrated DNA Technologies, США)


user posted image

Мы рады сообщить, что в сентябре СкайДжин стал официальным дистрибьютором крупнейшего мирового производителя олигов IDT (Integrated DNA Technologies). Многие из вас пользовались их он-лайн инструментами (www.idtna.com ( http://www.idtdna.com )), а теперь есть возможность заказывать их продукцию.

В честь дня рождения СкайДжин мы дарим Вам возможность абсолютно бесплатно заказать синтез двух не модифицированных олигонуклеотидов до 60 bp (25 нмоль)! Для этого необходимо до 22 сентября разместить на нашем сайте заявку ( http://www.skygen.com/produktsiya/reaktivy/idtfree.php ) и уже 23-24 сентября 2013 они будут синтезированы и отправлены в Россию, а затем доставлены в Вашу лабораторию.

Почему IDT?

Выбирая IDT Вы выбираете качество. КАЖДЫЙ олигонуклеотид проходит проверку на масс-спектрометре. Абсолютно каждый! Более того, результаты теста можно скачать он-лайн для каждого олига.

Еще одно преимущество - IDT может синтезировать широчайший спектр модифицированных олигов , длинных олигов (до 200 пар), индексные праймеры для NGS и т.д. Вот список всех возможных модификаций http://eu.idtdna.com/pages/support/technic...l-modifications ( http://eu.idtdna.com/pages/support/technical-vault/reading-room/quick-reference/all-modifications )

Скорость доставки.

Многие клиенты уже знакомы с нашей регулярной и оперативной доставкой реагентов New England Biolabs. Мы приложим все усилия, чтобы Вы получали свой заказ на продукцию IDT в максимально короткий срок. Мы поставили себе задачу - это не более 12 дней с момента синтеза.

Участвуйте в акции сами и расскажите о ней своим коллегам!

Перейти на наш сайт для заказа синтеза и уточнения деталей акции. ( http://www.skygen.com/produktsiya/reaktivy/idtfree.php )



SkyGen 23.10.2013 18:03
реклама ( http://molbiol.ru/wiki/Zbio:%D0%A0%D0%B5%D0%BA%D0%BB%D0%B0%D0%BC%D0%B0_%D0%BD%D0%B0_molbiol.ru#.D0.B3.D0.BB.D0.B0.D0.B2.D0.BD.D0.B0.D1.8F_.D1.81.D1.82.D1.80.D0.B0.D0.BD.D0.B8.D1.86.D0.B0 )

До конца года градиентный амплификатор Techne по цене обычного!


СкайДжин рад представлять легендарную марку термоциклеров Techne (Великобритания). Много лет назад этот брэнд был очень известен в России, но к сожалению, в последние годы ему уделялось мало внимания.
Рассчитываем, что мы сможем исправить эту ситуацию.

user posted imageПервым шагом на этом пути стала акция: градиентный термоциклер по цене обычного до конца 2013.

Основные особенности:

1. устройство термоблока на основе нескольких (до 8) элементов Пельтье
2. гарантия на все модели 4 года
3. большой выбор термоблоков
4. внутренняя память прибора позволяет сохранить до 1000 протоколов ПЦР
5. USB-порт для импорта/эспорта данных, обновления ПО прибора или управления прибором через ПК
6. бесплатное обновление ПО, которое можно скачать с сайта
7. возможность апгрейда неградиентных моделей термоциклеров до градиентных с помощью прошивки ПО, без замены термоблока - простое и выгодное решение при расширении задач прибора
8. возможность объединения приборов в сеть - удобное и экономичное решение при расширении объема работы

Одним из приоритетов компании Techne является доступность обновлений программного обеспечения, а также расширение возможностей прибора без смены основных узлов. Так, для постановки градиентного ПЦР персональным амплификаторам серий <sup>3</sup>PrimeX и Prime требуется лишь прошивка ПО, замена термоблока не требуется!

До конца 2013 года компания SkyGen предлагает Вам бесплатную прошивку ПО для проведения градиентного ПЦР на персональных амплификаторах 3PrimeX и полноразмерных амплификаторах Prime.

Ознакомьтесь с характеристиками амплификаторов Techne и ценами на них в информационном буклете ( http://www.skygen.com/upload/iblock/bdf/bdfacd2e41936d6d0ca3f870b2da6d3c.pdf )!



SkyGen 25.10.2013 13:04
реклама ( http://molbiol.ru/wiki/Zbio:%D0%A0%D0%B5%D0%BA%D0%BB%D0%B0%D0%BC%D0%B0_%D0%BD%D0%B0_molbiol.ru#.D0.B3.D0.BB.D0.B0.D0.B2.D0.BD.D0.B0.D1.8F_.D1.81.D1.82.D1.80.D0.B0.D0.BD.D0.B8.D1.86.D0.B0 )

Наконечники с резиновой муфтой, башни и распродажа


Новость первая.

Сложно придумать что-нибудь новое по наконечникам для дозаторов, но Sorenson BioScience это удалось.
Это наконечники OneTouch c резиновой муфтой. ( http://www.skygen.com/catalog/laboratornyy_plastik%2Fsorenson%2Fnakonechniki_dlya_dozatorov_onetouch_s_rezinovoy_muftoy/ ) Подходят для всех дозаторов, очень удобные и комфортные.

Особенно удобно при работе с многоканальными дозаторами.
user posted image

Производитель не успевает наращивать мощности производства, чтобы удовлетворить весь спрос.
Сейчас мы привезли ограниченную партию на 1000 мкл, очень скоро будет партия на 200 мкл и к февралю на 10 мкл.
Заказывайте и бронируйте сейчас!

Новость вторая

По вашим просьбам и советам мы привезли наконечники в башнях.
Встречайте башни QuickRack – высочайшее Американское качество по очень-очень доступной цене! ( http://www.skygen.com/catalog/laboratornyy_plastik/sorenson/nakonechniki_dlya_dozatorov_bez_filtra/upakovka_v_bashnyah/?brand= )

user posted image

Всего 89 копеек за наконечник. Кстати, конструкция слоя позволяет использовать наконечники со штативами других производителей!

И последняя, но не менее важная новость

Для тех лабораторий, кто предпочитает классический пластик мы решили сделать распродажу.
На ограниченную партию наконечников и пробирок мы снизили цены на 30-37%!

Для примера: 1000 шт. наконечников на 200 мкл всего 359 рублей.
Или вот другой пример: пробирки для ПЦР на 200 мкл по цене 1 251 рублей за 500 штук.

Весь пластик Made in USA (Sorenson).
Полный перечень и условия распродажи
скачиваем здесь. ( http://www.skygen.com/upload/sorenson/%D0%A0%D0%B0%D1%81%D0%BF%D1%80%D0%BE%D0%B4%D0%B0%D0%B6%D0%B0%20%D0%BF%D0%BB%D0%B0%D1%81%D1%82%D0%B8%D0%BA%D0%B0%20Sorenson%20%D0%BE%D0%BA%D1%82-%D0%BD%D0%BE%D1%8F%202013.pdf?utm_medium=email&utm_source=UniSender&utm_campaign=20593874 )




SkyGen 19.11.2013 10:57
реклама ( http://molbiol.ru/wiki/Zbio:%D0%A0%D0%B5%D0%BA%D0%BB%D0%B0%D0%BC%D0%B0_%D0%BD%D0%B0_molbiol.ru#.D0.B3.D0.BB.D0.B0.D0.B2.D0.BD.D0.B0.D1.8F_.D1.81.D1.82.D1.80.D0.B0.D0.BD.D0.B8.D1.86.D0.B0 )

Каталог NEB ( http://www.skygen.com/proizvoditeli/new_england_biolabs/catalog )
user posted image ( http://www.skygen.com/proizvoditeli/new_england_biolabs/catalog )



SkyGen 30.12.2013 15:13
Дорогие клиенты и партнёры!

Спасибо Вам за то, что были с нами весь этот год! Мы благодарны каждому сделанному заказу, каждому замечанию и каждому доброму отзыву.
Мы приложим все усилия, чтобы в наступающем году оправдать все Ваши ожидания и оказанное нам доверие.

Пусть следующий год будет для Вас полным открытий и успеха!
Здоровья, счастья и любви Вам и Вашим близким! Пусть 2014 год будет прекрасным!

С Наступающим Новым 2014 Годом!

С уважением,
генеральный директор ООО «СкайДжин»
Гуреев Дмитрий Владимирович

user posted image



SkyGen 31.01.2014 17:48
реклама ( http://molbiol.ru/wiki/Zbio:%D0%A0%D0%B5%D0%BA%D0%BB%D0%B0%D0%BC%D0%B0_%D0%BD%D0%B0_molbiol.ru#.D0.B3.D0.BB.D0.B0.D0.B2.D0.BD.D0.B0.D1.8F_.D1.81.D1.82.D1.80.D0.B0.D0.BD.D0.B8.D1.86.D0.B0 )
user posted image ( http://www.skygen.com )
Дополнительный бесплатный номер: 8 (800) 333-12-26

Дорогие клиенты и партнёры!

С 31 января 2014 Вы можете позвонить нам используя бесплатный телефонный номер 8 800 333-12-26 с любого мобильного телефона и из любого города России.

С уважением,
команда СкайДжин
www.skygen.com ( http://www.skygen.com )



papa Karlo 02.02.2014 22:12
А почему собственно не сделать особый платный номер... для консультаций... и потом делиться ими с женой того сотрудниика который вам звонил теми деньгами что набежали за звонок. причем звонки понятно дело записываются - так что все чисто и легально. Нормальная консультация... без фокусов



Guest 02.02.2014 23:46
Папа Карло, Вы либо что-то не поняли, либо рассказали нам какой-то неудачный жизненный опыт. Сожалеем. Смайликов вроде в сообщении Вашем нет, хотя они уместны. smile.gif

Номера 800 имеет особый статус - платит тот кому звонят. Вот звонят нам из Новосибирска или с мобильного телефона на Московский номер - звонки тарифицируются. Если же звонить на номер 8 800 333 12 26 - платим всегда мы, а для Вас всегда бесплатно.

Вроде всем хорошо, не так ли?



papa Karlo 03.02.2014 01:37
Вы похоже мало знаете современное искусство...

я вам супер-идею предложил..... У вас отбоя от желающих проконсультироваться ( и понятно дело что-нибудь прикупить) не будет... Оно же очевдно всеь и чро самое главное - легально - никакая налоговая не подкопается.

Возьмете меня финансовым консультантом..... расскажу все детали и ноу-хау... как все это у нас тут в Бельгии делается.

Но я практически уже все рассказал.... надо просто пошевелить мозгами немного.



SkyGen 21.02.2014 12:48
реклама ( http://molbiol.ru/wiki/Zbio:%D0%A0%D0%B5%D0%BA%D0%BB%D0%B0%D0%BC%D0%B0_%D0%BD%D0%B0_molbiol.ru#.D0.B3.D0.BB.D0.B0.D0.B2.D0.BD.D0.B0.D1.8F_.D1.81.D1.82.D1.80.D0.B0.D0.BD.D0.B8.D1.86.D0.B0 )

user posted image ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/markery_dlin_i_standarty/markery_dlin_dnk/marker_quick-load_purple_2-log_01-10_tpn_dlin_dnk/?brand= )user posted image ( http://www.skygen.com/ )Дорогие друзья!

Как Вы знаете New England Biolabs предлагает широкий спектр стандартов и маркеров молекулярного веса для контроля размера ампликонов ДНК, фрагментов РНК и белков. Стандарты и маркеры обладают чёткой интенсивностью полос и удобным шагом между ними.

Совсем недавно появился новый быстро загрузочный универсальный маркер длин фрагментов ДНК Quick-Load Purple 2-log DNA Ladder (0,1-10 kb) ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/markery_dlin_i_standarty/markery_dlin_dnk/marker_quick-load_purple_2-log_01-10_tpn_dlin_dnk/?brand= ).

Поставляется вместе с загрузочным буфером для образцов Gel Loading Dye, Purple (6X). ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/markery_dlin_i_standarty/bufery_dlya_naneseniya_na_gel/krasitel_dlya_naneseniya_na_gel_purpurnyy/?brand=&clear_cache=Y )


Преимущества:
1. готов к применению;
2. яркая полоса красителя красно-розового цвета мигрирует в геле на «привычном» уровне бромфенола;
3. в отличие от традиционных реагентов с бромфенолом дорожка красителя не оставляет дополнительной тени при документировании геля под УФ-лучами;
4. можно использовать с другими системами красителей (SYBR, GelRed);
5. подходит для полуколичественного определения содержания ДНК в образцах.

Как обычно: регулярные поставки и европейские цены.
Напишите нам, если хотите получить пробник.

info@skygen.com
+7 (495) 215-02-22
Бесплатная линия: 8 800 333 - 12 - 26



SkyGen 22.04.2014 22:18
реклама ( http://molbiol.ru/wiki/Zbio:%D0%A0%D0%B5%D0%BA%D0%BB%D0%B0%D0%BC%D0%B0_%D0%BD%D0%B0_molbiol.ru#.D0.B3.D0.BB.D0.B0.D0.B2.D0.BD.D0.B0.D1.8F_.D1.81.D1.82.D1.80.D0.B0.D0.BD.D0.B8.D1.86.D0.B0 )

user posted image ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/nimagen/brightdye_i_polimery_nanopop_dlya_abi/ )



SkyGen 13.05.2014 10:07
реклама ( http://molbiol.ru/wiki/Zbio:%D0%A0%D0%B5%D0%BA%D0%BB%D0%B0%D0%BC%D0%B0_%D0%BD%D0%B0_molbiol.ru#.D0.B3.D0.BB.D0.B0.D0.B2.D0.BD.D0.B0.D1.8F_.D1.81.D1.82.D1.80.D0.B0.D0.BD.D0.B8.D1.86.D0.B0 )

user posted image ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/nimagen/brightdye_i_polimery_nanopop_dlya_abi/ )

Пробники уже в Москве! Спешите!



SkyGen 21.05.2014 10:32
Компания SkyGen проводит акцию, по которой Вы можете приобрести ДНК-амплификаторы английской компании Techne по крайне привлекательной цене.

Преимущества амплификаторов:
· Несколько вариантов термоблоков под разные задачи и разный пластик
· Наличие функции температурного градиента
· Подогреваемая крышка (от 35 до 115°C)
· Сенсорный дисплей, интуитивно понятное управление
· Возобновление работы при сбое питания
· USB-порт для хранения и переноса программ
· Возможность обновления программного обеспечения
· Сделано в Великобритании
· 4 года гарантии

user posted image

199 000 рублей стоит амплификатор с термоблоком 48x0,2 мл, либо 30x0,5 мл.

А за 230 000 рублей Вы получите полноразмерный градиентный амплификатор, с одним из четырёх термоблоков на выбор:
96x0,2 мл, 60x0,5 мл, под 384-луночный планшет, либо комбинированный термоблок (33 лунки 0,2 мл плюс 33 лунки 0,5 мл).

Нажмите здесь, чтобы узнать более подробно об амплификаторах и акции. ( http://www.skygen.com/catalog/technecamq22014.php )

user posted image



SkyGen 03.06.2014 23:47
реклама ( http://molbiol.ru/wiki/Zbio:%D0%A0%D0%B5%D0%BA%D0%BB%D0%B0%D0%BC%D0%B0_%D0%BD%D0%B0_molbiol.ru#.D0.B3.D0.BB.D0.B0.D0.B2.D0.BD.D0.B0.D1.8F_.D1.81.D1.82.D1.80.D0.B0.D0.BD.D0.B8.D1.86.D0.B0 )

user posted image ( http://www.skygen.com/bonus )

Читайте по ссылке: как немного "продлить" грант. ( http://www.skygen.com/bonus )

Кодовое слово для получения 200 баллов (1 балл=1 рубль): МолБиол wink.gif



SkyGen 11.07.2014 16:03
реклама ( http://molbiol.ru/project/advert.html )

Новый приход реагентов для секвенаторов ABI 3100, 3130, 3500, 3730!

В ближайшие две недели мы планируем пополнить складские запасы полимеров NanoPOP 7 и BrightDye. Реагенты не только очень доступны по цене, но и будут у нас на складе в Москве.

Резервировать товар можно уже сейчас!



user posted image ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/nimagen/brightdye_i_polimery_nanopop_dlya_abi/ )



SkyGen 05.08.2014 13:02
реклама ( http://molbiol.ru/project/advert.html )

Прикреплённое изображение ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/reaktivy_dlya_modifikatsii_nk/klonirovanie_i_mutagenez/nabor_master_mix_dlya_ptsr_gibson_assembly/?sphrase_id=5970#item20008 )Метод Гибсона позволяет успешно производить сборку множества фрагментов ДНК, невзирая на длину фрагментов и степень совместимости их концов друг с другом. Вскоре после первого применения метод Гибсона был адаптирован для нужд синтетической биологии. Сегодня методика широко применяется благодаря своей простоте, возможности применения для больших конструкций ДНК, и тому, что она легко подстраивается для любой конкретной задачи.

Предлагаемый набор позволяет эффективно сшивать большое количество фрагментов ДНК с перекрывающимися концами в одной изотермальной реакционной смеси (1, 2) и может быть реализован на практике при помощи продукта компании New England Biolabs под названием Gibson Assembly Master Mix (by Synthetic Genomics, Inc) ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/reaktivy_dlya_modifikatsii_nk/klonirovanie_i_mutagenez/nabor_master_mix_dlya_ptsr_gibson_assembly/?sphrase_id=5970#item20008 ).

Реакционная смесь продукта включает в себя три различных энзиматических реактива, функционирование которых обеспечиваются единым буферным раствором:

1. 5’-экзонуклеаза удаляет основания с 5’- концов двуцепочечных фрагментов ДНК и создает одноцепочечные 3’-концы ДНК, которые гибридизуются во время постепенного охлаждения реакционной смеси, соединяя фрагменты друг с другом;
2. ДНК-полимераза закрывает пропуски внутри образовавшихся после отжига фрагментов;
3. ДНК-лигаза ковалентно сшивает фрагменты ДНК.
Прикреплённое изображение
На рисунке представлена схема, которая лежит в основе методики. После охлаждения реакционной смеси получают непрерывные двухцепочечные фрагменты ДНК, которые могут быть использованы для ПЦР, циклической амплификации или в других биологических процессах, включая прямую трансформацию. Данный метод был использован группой Гибсона и другими для сборки олигонуклеотидов длиной до нескольких сотен тысяч п.о., обладавших длиной перекрывающихся фрагментов от 15 до 80 п.о. (1-3).

Основные преимущества Gibson Assembly Master Mix:

1. хорошие результаты при сшивании длинных фрагментов ДНК, а также большого количества фрагментов разной длины;
2. возможность использования для различных последовательностей ДНК, без необходимости специального проектирования сайтов клонирования;
3. сборка фрагментов без очистки реакционной смеси после ПЦР;
4. возможность осуществить сложную сборку фрагментов в течение 1 часа;
5. использование полученных сшитых фрагментов ДНК непосредственно для трансформации, или в качестве матрицы для ПЦР и амплификации по типу катящегося кольца;
6. простая адаптация к различным манипуляциям с ДНК, включая сайт-направленный мутагенез, вставки и делеции.

Дополнительную информацию о Gibson Assembly Master Mix можно найти в комментарии к этому сообщению ( http://molbiol.ru/forums/index.php?showtopic=516909&view=findpost&p=1499134 ), а также на следующих ресурсах: http://www.syntheticgenomics.com ( http://www.syntheticgenomics.com ) и http://www.jcvi.org ( http://www.jcvi.org )

Gibson Assembly Master Mix можно ЗАКАЗАТЬ ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/reaktivy_dlya_modifikatsii_nk/klonirovanie_i_mutagenez/nabor_master_mix_dlya_ptsr_gibson_assembly/?sphrase_id=5970#item20008 )

Литература:
1.Gibson, D.G. et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases ( http://www.nature.com/nmeth/journal/v6/n5/full/nmeth.1318.html ), 2009, Nature Methods, 6, 343-345.
2.Gibson, D.G. et al. Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome ( http://www.nature.com/nmeth/journal/v7/n11/full/nmeth.1515.html ), 2010, Nature Methods, 7, 901-903.
3.Gibson, D.G. Personal communication.



SkyGen 06.08.2014 12:47
Прикреплённое изображениеGibson Assembly Master Mix ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/reaktivy_dlya_modifikatsii_nk/klonirovanie_i_mutagenez/nabor_master_mix_dlya_ptsr_gibson_assembly/?sphrase_id=5970#item20008 ) эффективно обеспечивает сборку фрагментов ДНК различной сложности, и может быть выбран исследователями при сборке двухцепочечной ДНК из большого количества частей. Так, фрагменты ДНК, полученные сшиванием 6 фрагментов с использованием набора, были использованы для трансформации. Полученные колонии были протестированы на наличие собранного фрагмента ДНК. Проводили ПЦР с использованием праймеров для амплификации всего фрагмента целиком, и наблюдали 100% правильность собранных фрагментов.

Как уже упоминалось выше, Gibson Assembly Master Mix может быть использован для сборки фрагментов непосредственно после реакции ПЦР, без колоночного очищения или экстракции хлороформом/фенолом.

Некоторые советы по использованию помогут упросить работу с Gibson Assembly Master Mix и обеспечить успешную сборку и последующую трансформацию собранного фрагмента ДНК:

1. успешная транформация с использованием полученного фрагмента ДНК напрямую зависит от компетентности использованных клеток;
2. электропорация может увеличить эффективность трансформации. Если Gibson Assembly Master Mix используется при электропорации, необходимо разбавить реакционную смесь в 3 раза и использовать 1µL смеси для трансформации;
3. очищенные ДНК, используемые для сборки, разбавляют в dH2O (MilliQ или эквивалент), ТЕ или других буферах;
4. для оптимизации сборки, доведите объем ДНК до 10 µL. Если объем раствора фрагментов ДНК больше чем 10 µL, объем реагента необходимо увеличить пропорционально;
5. при сборке непосредственно в вектор клонирования, концентрация фрагментов должна быть в 2-3 раза выше концентрации самого вектора. При клонировании в вектор, необходимо использовать в 2-3 раза больше вставки или собранного фрагмента;
6. некоторые структуры ДНК, включающие в себя инвертированные или тандемные повторы, также как некоторые рекомбинантные протеины плохо совместимы с E.Coli, что может проявляться в плохой трансформации и образовании маленьких по размеру колоний.



SkyGen 14.08.2014 14:57
Прикреплённое изображение
Сегодня мы хотим рассказать, почему новые ДНК-полимеразы от New England Biolabs заложили новые высокие стандарты безошибочности амплификации ДНК-матриц, и для каких целей такая точность имеет критическое значение. Q5 High-Fidelity ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/q5_hf_dnk-polimeraza/?sphrase_id=5992#item17577 ) и Q5 Hot Start High-Fidelity ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/q5_hot_start_hf_dnk-polimeraza/?sphrase_id=5992#item18845 ) обладают самой высокой точностью, доступной на сегодняшний день (которая более чем в 100 раз выше чем у ДНК-полимеразы Taq). Благодаря наличию в структуре полимераз уникального домена Sso7d увеличиваются процессивность, скорость, точность и надежность работы.

В России ДНК-полимераза Q5 HF уже заслужила самые высокие оценки от исследователей различных научных лабораторий: например Лаборатории сравнительной и функциональной геномики ИБХ РАН, Института цитологии и генетики СО РАН (Новосибирск), а также группы разработки новых методов исследования ВИЧ-инфекции и вирусных гепатитов ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора.

В таблице представлено сравнение основных характеристик некоторых высокоточных полимераз.
Прикреплённое изображение

Видно, что благодаря наличию домена Sso7d ДНК-полимераза Q5 High-Fidelity способна обрабатывать 1000 нуклеотидных звеньев за 10 секунд работы. Могут быть с высокой надежностью амплифицированы образцы матриц длиной до 20 тысяч пар нуклеотидов для простых, и до 10 тысяч пар нуклеотидов для сложных образцов. ДНК-полимеразу Q5 High-Fidelity возможно успешно использовать для широкого спектра образцов (как с повышенным содержанием АТ, так и с повышенным содержанием GC). В повседневной работе особенно важно, что высокий выход и минимальная степень ошибок достигаются при минимальном подборе условий.

ДНК-полимераза Q5 Hot Start High-Fidelity обладает дополнительным синтетическим аптамером, который связывается с полимеразой при помощи нековалентных взаимодействий. В результате стартовый механизм не требует денатурации на первоначальном этапе, и Q5 Hot Start High-Fidelity ДНК-полимераза, активируясь при комнатной температуре, обеспечивает нормальное проведение циклической реакции. Исчезает необходимость в высокотемпературном этапе, что сокращает время и упрощает эксперимент. Поэтому Q5 Hot Start HF - идеальный выбор для ПЦР реакции с особыми требованиями к безошибочности копирования.

Результаты использования полимераз Q5 High-Fidelity и Q5 Hot Start High-Fidelity для копирования образцов с различным содержанием GC представлены на рисунке.
Прикреплённое изображение
Рис.1. Копирование различных образцов генома человека с различным содержанием GC при помощи Q5 High-Fidelity (А) и Q5 Hot Start High-Fidelity (В) ДНК-полимераз. Реакции с использованием Q5 Hot Start High-Fidelity ДНК-полимеразы проводились при комнатной температуре. После 30 циклов амплификации продукты анализировались с использованием LabChip.

До настоящего времени, как правило, увеличение точности работы ДНК-полимераз сопровождалось ухудшением эффективности копирования на GC-богатых и других сложных ДНК-матрицах. Однако благодаря появлению Q5 ДНК-полимераз от New England Biolabs появилась возможность использовать ферменты, которые сочетают в себе высокую точность копирования и универсальность по отношению к содержанию GC.

Система буферов Q5, была оптимизирована для копирования широкого спектра образцов, вне зависимости от величины содержания GC. Для образцов, которые содержат более чем 65% GC, в реакционную смесь добавляется реагент для оптимизации взаимодействия с GC-богатыми и проблемными матрицами (Q5 High GC Enhancer).

Что такое безошибочность ДНК-полимераз и откуда берутся особенные требования к ней?
Безошибочностью работы ДНК-полимеразы называют возможность с ее помощью аккуратно копировать предложенный образец. Возможность определяется на первом этапе правильным считыванием информации и на втором этапе способностью ДНК-полимеразы выбрать подходящий нуклеозидтрифосфат и вставить его на 3'-конец праймера с образованием правильной Уотсон-Криковской пары оснований.

Вероятность вставки неправильного нуклеотида называют &laquo;степенью ошибки&raquo; Кроме того, некоторые ДНК-полимеразы обладают 3'&rarr;5' экзонуклеазной активностью. Эту активность, &laquo;проверкой чтения&raquo;, используется для удаления неправильно вставленных нуклеотидов, которые затем заменяются на правильные. Во время высокоточного ПЦР используется ДНК-полимеразы, которые совмещают в себе низкую &laquo;степень ошибки&raquo; и способность к проверке, тем самым обеспечивается надежная репликация интересуемого образца (1,2).

Высокоточные High-Fidelity ДНК-полимеразы имеют несколько уровней проверки, для того чтобы защитить от появления ошибки и ее дальнейшего распространения во время копирования ДНК:

- высокоточные ДНК-полимеразы имеют гораздо более высокое сродство к правильному нуклеотиду во время процесса полимеризации, чем к неправильному;
- если к активному сайту ДНК-полимеразы прикрепляется неправильный нуклеотид, из-за конформации образовавшегося комплекса процесс вставки замедляется, и за время задержки неправильно присоединившийся нуклеотид диссоциирует, что увеличивает вероятность прикрепления правильного нуклеотида (3,4);
- если неправильный нуклеотид был уже вставлен, проверяющая часть ДНК-полимеразы может &laquo;почувствовать&raquo; перекручивание, вызванное некомплементарностью пары оснований друг с другом. Далее 3'-конец растущей цепи ДНК перемещается к проверяющему экзонуклеазному домену, читающему в направлении 3'&rarr;5'. Тогда благодаря 3'&rarr;5' экзонуклеазной активности неправильный нуклеотид удаляется, после чего цепь передвигается обратно к полимеразному домену;

Известно, что задача повышения безошибочности работы ДНК-полимераз имеет многолетнюю историю, так, New England Biolabs начало свои исследования в этой области с открытия Ventr DNA Polymerase, выделенной из Thermococcus litoralis в 1990 г. (зарегистрированная торговая марка New England Biolabs, Inc.).

Точность ДНК-полимераз особенно важна следующих случаях:

- необходимость применение амплифицированного in vitro материала далее для клонирования/субклонирования, ПЦР, амплификации всего генома и т.д.;
- анализ SNP (точечных нуклеотидных полиморфизмов) посредством клонирования и секвенирования;
- анализ РНК с помощью ПЦР с обратной транскриптазой;
- другие типы экспериментов, вовлекающие в себя секвенирование образцов, амплифицируемых in vitro.

Конечно же, данные эксперименты могут быть проведены с использованием других типов ДНК-полимераз, но в тогда, в случае GC-богатых образцов возможно уменьшение выхода продукта, так же как неспецифичная амплификация. В случае экспериментов NGS (Next Generation Sequencing) - секвенирования следующего поколения, ошибки могут привести к исчезновению из результатов эксперимента целых последовательностей.

Литература:
1. Mattila, P., et al. (1991) Nucleic Acids Research, 19, 4967–4973. PMID: 1923765
2. Eckert, K. A., & Kunkel, T. A. (1991) Genome Research, 1, 17–24. PMID: 1842916
3. Johnson, K. A. (2010) Biochimica et Biophysica Acta, 1804, 1041–1048. PMID: 20079883
4. Joyce, C. M., & Benkovic, S. J. (2004) Biochemistry, 43, 14317–14324. PMID: 15533035

Высокоточные ДНК-полимеразы можно приобрести как в виде отдельных ферментов: Q5 High-Fidelity ДНК-полимераза ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/q5_hf_dnk-polimeraza/?sphrase_id=5992#item17577 ), Q5 High-Fidelity Hot Start ДНК-полимераза ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/q5_hot_start_hf_dnk-polimeraza/?sphrase_id=5993#item18845 ),
так и в виде наборов:Набор Q5 HF для ПЦР ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/nabory_i_reaktivy_dlya_provedeniya_amplifikatsii_i_ptsr/nabor_q5_dlya_hf_ptsr/?sphrase_id=5994#item22955 ),

Набор Q5 для сайт-направленного мутагенеза ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/nabory_i_reaktivy_dlya_provedeniya_amplifikatsii_i_ptsr/nabor_q5_dlya_sayt-napravlennogo_mutageneza/?sphrase_id=6077#item23206 ).

Отдельно можно приобрести Буфер для Q5 ДНК-полимераз ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/bufery_dlya_dnk-polimeraz/bufer_dlya_q5_dnk-polimerazy/?sphrase_id=5992#item19954 ), Master Mix Q5 HF для ПЦР ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/gotovye_nabory_master_mix/master_mix_q5_hf_dlya_ptsr/?sphrase_id=5992#item18844 ) и Master Mix Q5 HF Hot Start для ПЦР ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/gotovye_nabory_master_mix/master_mix_q5_hot_start_hf_dlya_ptsr/?sphrase_id=5992#item18847 ).

Заказать бесплатный образец ДНК-полимеразы Q5 High-Fidelity! ( http://www.skygen.com/obzory/q5sample.php?sphrase_id=6077 )



SkyGen 20.08.2014 10:37
Прикреплённое изображение
Пользуетесь ли вы колоночным выделением ДНК?

Сегодня мы рады предложить Вам серию новых продуктов для колоночного выделения ДНК на силикагелевой мембране, которые является прекрасной альтернативой существующим методам, и при этом сочетают в себе высокое качество и привлекательные цены.

Этап выделения ДНК из различных образцов является определяющим в успешном проведении всех последующих экспериментов, поэтому так важно обеспечить высокий выход и чистоту полученного продукта.

Приобретая каждый набор ISOLATE II, Вы получаете следующие преимущества:

продуманный состав наборов для выделения: сочетание простоты использования и скорости;
высокий выход и чистота полученной ДНК;
воспроизводимость результатов;
большой охват различных типов образцов;
настольные протоколы предусматривают минимальное разбрызгивание;
включение в набор необходимой ДНК-азы;
обеспечение фильтрами (и шредерами);

Наборы ISOLATE II предусматривают выделение и очистку геномной и плазмидной ДНК из широкого спектра образцов, включая ткани, клетки, кровь, сыворотку, так же как очистку ПЦР-продуктов из агарозного геля.

Пользуясь приведенной ниже таблицей Вы сможете выбрать, какой именно продукт ISOLATE II подходит для Вашего типа образцов.
Прикреплённое изображение
Вы можете заказать один из четырех наборов, в зависимости от типа образца, из которого будет производиться выделение ДНК:
ISOLATE II Plasmid Mini Kit – набор для выделения плазмидной ДНК;
ISOLATE II Genomic DNA Kit – набор для выделения геномной ДНК;
ISOLATE II PCR and Gel Kit – набор для выделения ДНК из ПЦР-продуктов и из агарозного геля ;
ISOLATE II Blood DNA Kit – набор для выделения ДНК из крови;
[url=http://www.skygen.com/produktsiya/reaktivy/isolatedemo.php]



SkyGen 22.08.2014 14:31
Получите образец маркера длин ДНК Quick-Load Purple 2-log в подарок к каждой High-Fidelity рестриктазе от New England Bioloabs!
Прикреплённое изображение
Протестируйте наш новый маркер длин ДНК Quick-Load Purple 2-log ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/markery_dlin_i_standarty/markery_dlin_dnk/marker_quick-load_purple_2-log_01-10_tpn_dlin_dnk/?brand= ) , получив бесплатный образец, при заказе любого High-Fidelity фермента рестрикции ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/endonukleazy_restriktsii/high_fidelity_hf_fermenty_restriktsii/?brand= ) от New England Biolabs до 20 сентября 2014 года.

С использованием нашего нового маркера длин, Вы сможете:

- быстро определить длину своего ДНК, ориентируясь на фрагменты одинаковой интенсивности свечения в составе маркера, а также на референсные фрагменты с повышенной интенсивностью;
- облегчить опознавание линий, благодаря новому пурпурному красителю, который улучшает четкость изображения;
улучшить узнавание полосок меньшего размера, благодаря тому, что пурпурный краситель не оставляет тени под УФ светом;
- сэкономить на стоимости.

Образцы нового маркера длин ДНК будут направлены Вам в подарок при заказе любого High-Fidelity (высокоточного) фермента рестрикции, который Вы выберете, при условии наличия маркера на складе.

High-Fidelity (высокоточные) ферменты рестрикции разрезают тот же участок ДНК, что и их немодифицированные аналоги, однако в то же время проявляют в меньшей степени неспецифическую и "звездочную" активность. Благодаря этому, время реакции может составлять как 5-15 минут, так и всю ночь. Также исследователи могут не опасаться неправильно подобрать концентрацию фермента. Другим удобным новшеством является то, что все ферменты данной линейки оптимально работают в одном буферном растворе CutSmart Buffer.
Высокоточные High-Fidelity ферменты рестрикции можно ЗАКАЗАТЬ уже сегодня. ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/endonukleazy_restriktsii/high_fidelity_hf_fermenty_restriktsii/?brand= )



SkyGen 09.09.2014 11:10
Прикреплённое изображение
Компания New England Biolabs, в связи со своим 40-летним юбилеем, объявляет конкурс на получение наград за страстное увлечение наукой (Passion in Science Awards) ( http://nebpassioninscience.com/ ). Таким образом New England Biolabs хочет отметить тех представителей научного сообщества, кто страстно работает для изменения окружающего нас мира к лучшему.

Все мы хотим жить в обществе, в котором люди вокруг нас относятся друг другу с состраданием и заботятся природе, мы верим, что развитие науки будет способствовать улучшению всех составляющих нашей жизни. Эти мысли послужили основой создания New England Biolabs 40 лет назад.

Мотивацией успешной деятельности компании служила и служит вера в то, что наука должна расширять наши познания о мире вокруг нас, что ученые должны служить примером для окружающих, в том числе примером человеколюбия. New England Biolabs верит в то, что все живые существа имеют право жить в гармонии с окружающей нас природой, и наконец в то, что настоящая наука всегда креативна, и меняет наше представление об окружающих нас вещах.

Сегодня, мы с радостью сообщаем, что в 40-летний юбилей компании New England Biolabs Вы можете номинировать себя, а также своих коллег ( https://neb.skild.com/skild2/neb/addNominations.action/ ) для получения наград по 4 категориям конкурса:

Награда за вдохновение в науке (Inspiration in Science Award) ( http://nebpassioninscience.com/awards/inspiration-in-science-award/ ) будет присуждаться тем исследователям, кто в своей ежедневной работе раздвигает границы знаний в своей области.

Объявляя конкурс на эту номинацию, New England Biolabs намеревается поощрить ученых, посвятивших свою жизнь изменению в лучшую сторону отрасли науки, которой они отдали свое сердце.

Награда за человечность (Humanitarian Duty Award) ( http://nebpassioninscience.com/awards/humanitarian-duty-award/ ) найдет своих победителей среди научных работников, которые совершают поступки во благо благополучия и счастья окружающих.

Достигнув рубежа сорокалетия, New England Biolabs оглядывается назад и особенно хочет оценить тех, кто пытался найти способ улучшить жизнь окружающих, приложить усилия и выйти из того формата, куда загоняет нас жизнь, и не жалел на это свое время и силы.

Награда за служение интересам окружающей среды (Environmental Stewardship Award) ( http://nebpassioninscience.com/awards/environmental-stewardship-award/ ) предназначена для ученых, которые работают для сокращения бесполезного расходования природных ресурсов нашей планеты.

Компания New England Biolabs, которая всегда уделяла особое внимание вопросам окружающей среды, считает, что именно клиенты компании могут послужить примером того, как можно совмещать занятия наукой и желание жить в гармонии с окружающей нас природой.

Награда за креативное отношение к науке как к искусству (Arts and Creativity Award) ( http://nebpassioninscience.com/awards/arts-and-creativity-award/ ) будет вручена ученым, которые способны совместить науку и искусство в новых, непредсказуемых и странных ракурсах.

Возможно, Вы были удивлены, прочитав о таком неожиданном решении - учредить награду в области искусства и креативности, но эти понятия всегда являлись неотъемлемой частью настоящей науки!

Победители конкурса будут награждены на торжественной церемонии в штаб-квартире New England Biolabs, а также получат финансовую поддержку своим начинаниям. Помните, что любое Ваше достижение, как кажущееся незначительным, так и крупное, будут интересно комиссии по отбору!

Подумайте, с какими невероятными людьми мы работаем бок о бок каждый день и номинируйте своих коллег! ( https://neb.skild.com/skild2/neb/addNominations.action/ )

Заполните удобную форму на сайте http://nebpassioninscience.com ( http://nebpassioninscience.com ) уже сегодня, и помните, что заявки принимаются до 30 сентября 2014 г.



SkyGen 11.09.2014 15:56
Прикреплённое изображение
В последние годы среди существующих методов выделения нуклеиновых кислот все большей популярностью пользуется колоночное выделение. Каждый день в лабораториях сталкиваются с различными задачами на этапе пробоподготовки по выделению ДНК из широкого спектра биологических образцов.

Сегодня компания SkyGen представляет новый продукт на российском рынке – наборы для колоночного выделения ISOLATE II ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/bioline/nabory_dlya_vydeleniya_dnk/ ), которые сочетают в себе высокую чистоту полученного продукта с хорошим выходом и чрезвычайно привлекательными ценами. Давайте подробнее остановимся на описании каждого из наборов для выделения ДНК от BIOLINE.

Если Вам необходимо выделить геномную ДНК из тканей животных, бактериальных клеток, биологических жидкостей организмов, образцов биопсии, слюны, замороженных тканей, клеточных культур, фекалий млекопитающих, из волос, насекомых, образцов тканей в парафине, хвостов грызунов, из вирусов и из дрожжей – Вашим лучшим выбором будет являться набор для выделения геномной ДНК ISOLATE II (Genomic DNA Kit).

На первом этапе первичный материал подвергается лизированию с помощью протеиназы К, далее ДНК специфично иммобилизуется на поверхности силика-мембраны в присутствии хаотропных ионов, откуда после промывания элюируется ДНК с высокой чистотой (соотношение А260/А280 = 1,7-1,9).

Оптимизированное использованием для широкого разнообразия образцов обеспечиваются при помощи 17 протоколов. Выделенная ДНК может далее использоваться для ПЦР, rtПЦР, секвенирования следующего поколения (NGS). Возможно выделение до 35 мкг геномной ДНК из одного препарата, после этапа лизиса, время выделения составляет порядка 20 мин.

Для выделения плазмидной ДНК из бактериальных клеток, клеточных культур, Р1 конструктов и космид мы рекомендуем воспользоваться набором для выделения плазмидной ДНК ISOLATE II (Plasmid DNA Mini kit).

С помощью набора возможно выделение как высококопийных, так и низкокопийных плазмид, с высокой чистотой выделения (соотношение А260/А280 >1,8). Количество выделяемой плазмидной ДНК может составлять до 40 мкг из 10 мл культуры (на примере E.Coli). ДНК может использоваться далее для ПЦР, трансформации, клонирования, секвенирования, рестрикционного анализа и др. Протокол выделения позволят выделять ДНК из 18 препаратов за 25 минут, и состоит из этапов щелочного лизиса, очищения лизата, связывание плазмидной ДНК с силикагелевой мембраной колонки, промывание и последующее элюирование. Для случая низкокопийных плазмид, Р1 конструктов и космид предусмотрен отдельный вариант протокола, в котором используются увеличенные объемы буферных растворов.

В случае, если выделение ДНК планируется из крови, сыворотки крови, биологических жидкостей, бактериальных клеток, клеточных культур и вирусов – мы можем порекомендовать набор ISOLATE II для выделения ДНК из крови (Blood DNA kit). Возможно выделение образцов ДНК, свободных от ПЦР-ингибиторов за 30 минут, с высокой чистотой (соотношение А260/А280= 1,7-1,9) с высоким выходом. Для выделения возможно использовать как свежую кровь, так и замороженную, в том числе с добавками таких популярных коагулянтов как цитраты, ЭДТА, гепарин или ACD.

Кроме того, с помощью набора возможно выделить бактериальную и вирусную ДНК (например, ДНК HBV) из образцов крови. Для выделения таких образцов ДНК рекомендуется удалить клетки крови центрифугацией. Полученная в результате очистки ДНК может применяться для ПЦР разного типа, Southern Blotting и других ферментативных реакций.

Очень часто перед исследователями встает задача выделить ДНК из геля или из смеси ПЦР-продуктов, для решения обеих этих задач идеальным выбором станет набор для выделения ДНК из продуктов ПЦР и из агарозного геля (PCR and Gel kit). Используя набор, Вы сможете в течение 10 минут очистить ДНК из продуктов ПЦР и за 20 минут выделить ДНК из ТАЕ и TBE агарозных гелей.

Полученную с высокой чистотой ДНК (соотношение А260/А280 = 1,8-1,9) возможно будет использовать для клонирования, трансфекции, секвенирования и рестрикционного анализа. Особенно важно, что при выделении из ПЦР-смеси фрагментов ДНК длиной от 50 оснований выход составляет от 75 по 90 %, при полном очищении ДНК от праймеров и других низкомолекулярных примесей.

Приобретая любой из продуктов ISOLATE II, Вы сможете быть уверены, что получаете качество и эффективность выделения ДНК, одни из самых высоких среди существующих на сегодняшний день.

Закажите уже сегодня свой набор для выделения ДНК! ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/bioline/nabory_dlya_vydeleniya_dnk/ )



SkyGen 26.09.2014 13:17
xGen Lockdown зонды и панели от IDT сфокусируют ваши исследования в области секвенирования следующего поколения (NGS)
Прикреплённое изображение

Несмотря на то, что удешевление стоимости секвенирования ДНК позволило проводить масштабные исследования (1), непомерно высокая стоимость обработки образцов до сих пор является проблемой практически для всех пользователей. Это заставляет все большее количество лабораторий проводить секвенирование только той части генома, которая представляет интерес. Целевое обогащение при помощи гибридного захватывания, которое рассматривается в данном обзоре, реализуется непосредственно перед проведением секвенирования, схема такого обогащения представлена на рис.1. Методы обогащения генома уменьшают стоимость секвенирования и позволяют сфокусировать свои усилия на конкретном участке гена.

Если мы выделим специфический регионе генома, это позволяет секвенировать один участок во множестве образцов одновременно. Благодаря гибридному захватыванию интересующих участков генома и последующему секвенированию возможно проводить эксперименты по генотипированию, идентификацию вариантов сплайсинга, нахождение мест вставки новых или делеции существовавших нуклеотидов, а также изучение геномной рекомбинации и секвенирование сайтов интеграции вирусов и транспозонов.

Прикреплённое изображение
Рис.1. Целевое захватывание последовательности с помощью xGen Lockdown зондов.


Проведение анализа большого количества целевых участков генома во множестве образцов.


Давайте рассмотрим эксперимент по генотипированию 100 образцов, реализованный при помощи ПЦР, он потребует проведения множества индивидуальных ПЦР-реакций, каждую из которых необходимо будет оптимизировать. Оптимизация и проведение этих реакций потребует большого количества времени и возможность появления ошибок возрастет, из-за того что качество будет зависеть от большого количества индивидуальных реакций. Более того, потребуется большое количестве первоначального материала. В конце концов, генотипирование при помощи ПЦР может не завершиться успешно, если мутации возникают в праймерах. Обычно последовательность праймеров оптимизируется с использованием нескольких образцов, и далее полученные таким путем праймеры используются для амплификации большой совокупности образцов. Такая практика основана на предположении о том, что участки, на которые будут садиться праймеры не претерпевают изменений в составе всей совокупности образцов. Это может оказаться правдой для небольшой серии образцов, но если число реакций увеличивается, то увеличивается и вероятность деформации последовательности сдвигом (рис.2А).

В качестве альтернативы ПЦР, секвенирование NGS после целевого обогащения объединяет все реакции генотипирования и обнаружение мутации в один этап, схема расположения зонда показана на рис.2. При гибридном захватывании последовательности с одиночным нуклеотидным полиморфизмом (SNP) используется зонд, направленный на узнавание последовательности вокруг SNP, и мутация гибридизующейся последовательности, несмотря на неполную комплементарность с зондом не окажет критического воздействия на процесс узнавания. Фактически, зонды xGen Lockdown Probes могут игнорировать до 7 мутаций внутри целевого участка без влияния на эффективность гибридизации. Обогащенная ДНК далее секвенируется в один этап. В таком случае нет необходимости в подборке условий индивидуальных ПЦР и гелей для анализа. Если исследователь решит расширить спектр экспериментов и увеличить количество зондов, направленных на узнавание других SNP, то возможно воспользоваться уже подобранными условиями эксперимента по обогащению и секвенированию.
Прикреплённое изображение
Идентификация сайтов встраивания вирусов и транспозонов

Эксперименты по изучению функций генов часто включают в себя гетеротипическую и экспрессию их последующий нокдаун при помощи интерференцией РНК (RNAi). Ретровирусы используются для введения экзогенной ДНК в геном изучаемых организмов. Фрагмент ДНК может быть интегрирован в безопасный участок между генами или в транскрибируемый участок (2) который может варьировать функцию генов, и вызываемые этим ложные фенотипы. Для исследования проблемного сайта встраивания во множестве различных образцов, возможно проводить целевое обогащение с использованием гибридизации зондов с известными участками экзогенной последовательности ДНК (рис.3). Таким образом, образцы, в которых произошло встраивание экзогенной ДНК могут быть отобраны для дальнейшего изучения.
Прикреплённое изображение
Методика также важна для изучения сайтов интеграции транспозонов и инфицирующих вирусов. Информация о молекулярном механизме встраивания может улучшить понимание разработки лекарств для соответствующих заболеваний, а также быть полезной для решения других задач. Идентификация вирусной ДНК в изучаемом организме также используется для диагностирования стадии заболевания (3). проведение секвенирования ДНК человека, после целевого обогащения участками вирусного генома может подтвердить факт инфицирования.

Изучение альтернативного сплайсинга

Альтернативный сплайсинг наблюдается в 95% генах человека, которые имеют более чем 1 экзон, а ошибки во время этого процесса ассоциированы со множеством болезней (4). Некоторые из таких болезней могут быть диагностированы с помощью нахождения генов, которые альтернативно участвуют в сплайсинге. Для этого может использоваться, например, секвенирования следующего поколения РНК (NGS). Получаемая информация позволяет проанализировать количество РНК, представленной в определенный момент времени, и таким образом, этот метод чувствителен к различиям в генной экспрессии. РНК, полученная из образца, конвертируют в ДНК, и далее проводится стандартная процедура секвенирования ДНК. Для того чтобы облегчить определение малые количества вариантов сплайсинга, которые ассоциированы с заболеваниями, зонды, специфичные к изучаемому транскрипту могут использоваться для обогащения, облегчая обнаружение таких транскриптов (Рис.4). Также, различные изоформы протеинов детектируются в пропорции образца, и оставшиеся образцы могут быть легко проверены на наличие транскриптов альтернативного сплайсинга, по сравнению с изучением экспрессированных протеинов при помощи Western Blot.
Прикреплённое изображение

Гибридное связывание увеличивает универсальность экспериментов


Секвенирование следующего поколения, проводимое после этапа целевого обогащения, позволяет исследовать один и тот же образец для решения нескольких задач одновременно, а также упрощается процесс увеличения количества целевых последовательностей. Такая простота расширения количества обогащаемых участков позволит добавить новый участок SNP, информация о котором появилась в печати - для этого к существующей панели зондов добавляется еще несколько, и ее можно использовать для последующих экспериментов по генотипированию. Добавление дополнительного зонда никак не скажется на эффективности работы существовавшей ранее панели, но позволит получать большее количество информации в результате каждого эксперимента. Таким образом возможно более оперативно реагировать на появляющиеся каждый день публикации в сфере NGS.

Прочитав большую часть данного обзора, и узнав обо всех дополнительных возможностях метода, кроме того что он фокусирует эксперименты по секвенированию, Вы задаетесь следующим вопросом: Упростит ли гибридное связывание постановку экспериментов?

Хотя гибридное связывание может быть использовано для решения большого количества задач, иногда этот метод может и не являться наиболее подходящим для всех исследователей. Например, процент прочтений последовательности, полученный от определенного региона увеличивается одновременно с увеличением количества зондов. Панели из большего количества зондов, как правило, более эффективны (в том числе и с точки зрения цены). Маленькие панели зондов используются для изучения ретровирусов и транспозонов; Тем не менее, следует обращать внимание на то, что результаты с использованием разных панелей и разных методов для обогащения могут разниться. Например, повторяемые участки будут захватываться с большей частотой.

В то же время следует понимать, что если задачей является изучение одного целевого участка в тысяче различных образцов, то лучше использовать метод обогащения при помощи ПЦР. xGen Lockdown зонды - изготавливаются полностью на заказ, из которых могут быть использованы для создания захватывающих панелей любого размера.

Зонды xGen Lockdown Probes от IDT

Зонды xGen Lockdown Probes - это индивидуально синтезируемые зонды для целевого обогащения при помощи гибридного связывания. Этот продукт был разработан специально для совместного применения с NGS секвениварония. Зонды могут быть использованы индивидуально для создания панелей, которые могут быть оптимизированы, расширены, комбинированы с другими панелями при необходимости. Также отдельные зонды могут быть добавлены в уже существующие панели для улучшения узнавания труднодоступных участков (например GC-богатых участков).

Кроме того, возможно выбрать одно из готовых решений от IDT - одну из готовых панелей:

xGen Inherited Diseases Panel - панель для обогащения генов, ассоциированных с наследственными заболеваниями, содержит 116 355 зондов, нацеленных на узнавание 4503 генов и 80 однонуклеотидных полиморфизмов (SNPs), сцепленных с наследственными заболеваниями.

xGen Acute Myeloid Leukemia Cancer Panel v1.0 - панель для обогащения более чем 260 генов ассоциированных с развитием острой миелоидной лейкемии (AML), содержит 11 743 индивидуально синтезированных зондов.

xGen Pan-Cancer Panel v1.5 - панель для обогащения генов, ассоциированных с 12 типами раковых заболеваний, состоит из 7 816 индивидуальных синтезированных зондов, которые обеспечивают обогащение более чем 127 генов.

Обеспечение совместимости с популярными платформами NGS

В процессе обогащения используются блокирующие олигонуклеотиды xGen Blocking Oligos для адаптеров в составе последовательностей библиотек. Такие блокирующие олигонуклеотиды уменьшают неспецифичное связывание и увеличивают эффективность обогащения.

xGenUniversal Blocking Oligos совместимы с Illumina TruSeq и другими Single-Index адаптерами, с Illumina TruSeq HT и другими Dual-Index адаптерами, а также с Ion Torrent Barcoded адаптерами.

xGen Standard Blocking Oligos совместимы с Illumina TruSeq, и другими Single-Index адаптерами, с Illumina TruSeq HT и другими Dual-Index адаптерами, а также с Ion Torrent Barcoded адаптерами и адаптерами Roche/454.

Возможно также производство блокирующих олигонуклеотидов на заказ (xGen Custom Blocking Oligos).

Использованная литература

Hayden EC (2013) Gene sequencing leaves the laboratory. Nature 494(7437):290-291.
Ambrosi A, Cattoglio C, Di Serio C. (2008) Retroviral integration process in the human genome: is it really non-random? A new statistical approach. PLoS Comput Biol 4(8):e1000144.
Depledge DP, Palser AL, et al. (2011) Specific capture and whole-genome sequencing of viruses from clinical samples. PLoS ONE 6(11): e27805.
Matlin AJ, Clark F, Smith CW. (2005) Understanding alternative splicing: towards a cellular code. Nat Rev Mol Cell Biol, 6(5):386–398.
Cancer Genome Atlas Research Network. (2013) Genomic and epigenomic landscapes of adult _de novo_ acute myeloid leukemia. N Engl J Med, 368(22):2059–2074.

По всем вопросам подбора Вашей индивидуально панели для обогащения перед секвенированием NGS обращайтесь в СкайДжин: info@skygen.com СкайДжин является официальным дистрибьютором IDTDNA в России!

Для обзора использовалась информация из статьи Target Enrichment Facilitates Focused Next Generation Sequencing ( http://eu.idtdna.com/pages/decoded/decoded-articles/core-concepts/decoded/2014/01/15/target-enrichment-facilitates-focused-next-generation-sequencing )



SkyGen 20.10.2014 15:44
Прикреплённое изображение
Красивое совместное решение от IDT и New England Biolabs для создания плазмидного вектора, кодирующего нуклеазу Cas9

Мы всегда рады, когда узнаем об удобных, красивых, а главное, эффективных решениях, реализованных с использованием продуктов New England Biolabs и Integrated DNA Technologies руками наших клиентов. Сегодня мы хотели бы рассказать о методике сборки уникальной последовательности плазмидного вектора, которую применяют в своих исследованиях лаборатории из Новосибирска и Калининграда. Задачей было получить плазмидный вектор, содержащий несколько функциональных элементов, располагающихся в строго определенной последовательности. Плазмидный вектор должен был кодировать нуклеазу Cas9, специфично проникающую в митохондрии клеток человека для редактирования митохондриального генома. В руках исследователей была схема эксперимента, а также возможность воспользоваться лучшими решениями компаний NEB&IDT. Давайте посмотрим, как это было реализовано на практике!
На первом этапе перед сотрудниками сектора клеточных технологий Института цитологии и генетики СО РАН и сотрудниками лаборатории молекулярно-генетических технологий Балтийского федерального университета им. И. Канта стояла задача по сборке протяженной последовательности ДНК, содержащей функциональные элементы, не встречающиеся в нужном порядке в коммерчески доступных плазмидных векторах. Причем собрать эти элементы воедино с помощью классических методов молекулярного клонирования было достаточно проблематичным.
В качестве примера мы приводим структуру одного из такие фрагментов. Это последовательности, кодирующие: промотор цитомегаловируса, митохондриальный сигнальный пептид, последовательность FLAG для иммуноцитохимической детекции, и нуклеаза Cas9, располагающиеся друг за другом встык. Изначально, дизайн плазмидного вектора был разработан в программном обеспечении SnapGene (http://www.snapgene.com/). Нуклеотидную последовательность фрагмента вектора вы можете увидеть в любезно предоставленном скриншоте. Фрагмент, содержащий нужные последовательности, расположенные встык, на рисунке выделен оранжевым цветом.
После того, как исследователи определились с нуклеотидной последовательностью, предстояло осуществить ее синтез. Мы остановимся на двух вариантах решения этой задачи. Первое решение: предлагалось «разбить» данную последовательность на олигонуклеотиды длиной 60 оснований с перекрытием 20 оснований. Протокол такого решения опубликован Даниелем Гибсоном (Gibson 2011) и может быть выполнен при помощи набора для лигирования Gibson Asembly Kit (New England Biolabs) ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/reaktivy_dlya_modifikatsii_nk/klonirovanie_i_mutagenez/nabor_master_mix_dlya_ptsr_gibson_assembly/?brand= ). Другим решением является заказ нужного фрагмента в готовом виде в компании IDT. Данный продукт называется gBlocks. Говоря о gBlocks от IDT- необходимо понимать, что это двухцепочечные последовательности ДНК длиной до 2000 пар оснований, которые поставляются компанией IDTготовые к дальнейшему использованию, как в виде фрагментов ДНК, так и в составе плазмидного вектора с выбранными по Вашему усмотрению сайтами рестрикции на 3’ и 5’ концах.

Скриншот фрагмента ДНК, содержащего функциональные блоки в требуемом взаиморасположении.

Прикреплённое изображение

В конкретно приведенном примере исследователям требовалось собрать воедино три фрагмента:
1. Фрагмент, содержащий энхансер и промотор цитомегаловируса, клонированный из коммерческого плазмидного вектора pTurboGFP-Mito (Евроген).
2. gBlock, содержащий промотор цитомегаловируса, митохондриальный сигнальный пептид, последовательность FLAG для иммуноцитохимической детекции, и нуклеазу Cas9.
3. Фрагмент, содержащий последовательность, кодирующую нуклеазу Cas9, клонированный из плазмидного вектора hCas9 (Addgene).
Для бесшовного соединения трех вышеописанных фрагментов, каждый из них был амплифицирован с использованием олигонуклеотидных праймеров, содержащих в своей последовательности дезокиурацил (dU). Праймеры подбирались таким образом, что их «хвосты» перекрываются, начиная с dU. Компания IDT предлагает синтез таких праймеров. Условия амплификации со специфичными праймерами лучше предусмотреть заранее - например, в рассматриваемом случае наилучшие результаты показала ДНК-полимераза PfuTurbo Cx (Agilent Technologies).
Полученные ампликоны обрабатывались ферментом USER (New England Biolabs) ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/reaktivy_dlya_modifikatsii_nk/fermenty_dlya_reparatsii_dnk/ferment_user/?brand= ): смесью урацил-ДНК-гликозилазы, которая удаляет урацил из ампликона, формируя AP-сайт и эндонуклеазы VIII, которая удаляет нуклеотиды от AP-сайта в сторону 5΄-конца, формируя липкие концы (структура праймеров представлена на рисунке). Затем липкие концы, имеющие уникальную последовательность, лигируются друг с другом.
В оригинальной работе исследователей из Новосибирска и Калининграда был собран плазмидный вектор из 8 фрагментов в ходе одной реакции лигирования: 4 фрагмента амплифицировали из коммерчески доступных плазмидных векторов, а 4 – заказывали в виде gBlock в IDT.
Все описанные стадии наглядно представлены на следующем рисунке:
Прикреплённое изображение
Давайте теперь подробнее остановимся на продуктах IDT, использовавшихся в предложенном решении. gBlocks - фрагменты гена на заказ, с адекватной ценой, сиквенс их строго контролируется, и точность синтеза - самая высокая из доступных на сегодняшний день на рынке.
После того, как Вы получили Ваш фрагмент gBlocks, возможно ввести его в требуемую плазмиду как при помощи клонирования по тупым концам, липким концами (в таком случае надо предусмотреть сайты рестрикции в вашем gBlock), так и используя метод клонирования Gibson Assembly. Кроме gBlock - IDT дает возможность заказать необходимый фрагмент гена уже встроенный в плазмиду, при этом на оба конца встроенного гена возможно включить разные сайты рестрикции. Чтобы заказать как просто фрагмент гена, так и встроенный в вектор ген, обратитесь к нам по адресу info@skygen.com, и мы с удовольствием поможем Вам сделать Ваш эксперимент проще и быстрее!
Мы искренне надеемся, что представленная нами в данном обзоре информация поможет Вам в Вашей повседневной работе и привнесет новые идеи!



Файл/ы:

Скачать файл Gibson_2011_Enzymatic_assembly_of_overlapping_DNA_fragments.pdf
Размер:: 305.83к
кол-во скачиваний: 1108




SkyGen 02.12.2014 14:56
Решения от New England Biolabs для секвенирования следующего поколения (Next Generation Sequencing, NGS). Часть 1.

Прикреплённое изображение


Все большее внимание в последние годы уделяется методам севенирования следующего поколения (Next Generation Sequencing, NGS), которые благодаря своей высокой производительности постепенно вытесняют другие методики, такие как, например, автоматическое секвенирование по Сэнгеру. В сегодняшнем обзоре мы расскажем, что же представляет собой NGS, и какие продукты компании New England Biolabs помогут решить задачи по секвенированию образцов ДНК и РНК.

На первом этапе давайте ответим на вопрос: что такое NGS?

Технологии секвенирования NGS основаны на анализе последовательности присоединяемых нуклеотидов в множестве происходящих параллельно реакций амплификации. На сегодняшний день, наиболее распространенными платформами для секвенирования являются Illumina®, 454™, SOLiD™, Ion Torrent&trade. Каждая компания-производитель использует свой собственный подход для детекции присоединяемого нуклеотида.

В целом, если вы поставите перед собой задачу провести секвенирование образца с использованием NGS, следующий алгоритм действий, при правильной постановке экспериментов, обеспечит требуемый результат:

1. Выделить образец ДНК/РНК
2. Подготовить образцы для проведения секвенирования: получить библиотеку, годную для дальнейшего секвенирования. Библиотека NGS - это совокупность фрагментов исследуемого образца ДНК/РНК одинаковой длины, при этом каждый из фрагментов модифицирован соответствующим для своего метода образом.
3. Загрузить библиотеку в секвенатор и получить массив данных с информацией о последовательности различных фрагментов библиотеки.
4. Проанализировать полученные данные с использованием программы-сборщика и сформировать последовательность ДНК/РНК целиком.

Несмотря на кажущуюся простоту алгоритма анализа, существует огромное количество подводных камней и деталей, которые необходимо учесть при проведении эксперимента.

Общие рекомендации при подготовке библиотек ДНК

Используйте самые качественные образцы ДНК из доступных. Качество исходного материала напрямую влияет на характеристики полученной библиотеки. Для оценки целостности и степени загрязненности ДНК можно использовать электрофорез. Смазанные полосы или «лестницы» на геле свидетельствуют о повреждении ДНК или о попадании в пробу детергентов или загрязняющих веществ. Наличие РНК можно детектировать внизу геля. С помощью измерения поглощения в УФ также можно оценить чистоту образца. В идеальных пробах соотношение оптического поглощения при 260 и 280 нм должно быть порядка 1,8 – 2,0. Однако на результаты этих измерений может повлиять наличие в пробе РНК или коротких фрагментов ДНК.

Очень важно точно оценить исходное количество ДНК, используемое для создания библиотеки. Использование флуоресцентных красителей, специфично связывающихся с двуцепочечных ДНК позволяет измерять количество ДНК намного точнее, чем измерения в УФ (Qubit, Life Technologies). Этот метод позволяет исключить вклад загрязнителей, РНК и коротких фрагментов ДНК.

Для очистки ДНК после каждого из этапов пробоподготовки,согласно протоколу NEBNext, рекомендуется воспользоваться AMPure XP® Beads (Beckman Coulter, Inc).

Общие рекомендации при подготовке библиотек РНК

Очень важно использовать РНК высокого качества. Образцы с частично деградированной РНК могут привезти к низкому выходу, или к получению библиотеки неприемлемого качества. Мы рекомендуем определять индекс целостности выделенной РНК (RIN) на анализаторах Bioanalyzer (Agilent). Образец должен иметь RIN выше 7.

Целостность и распределение длин фрагментов РНК может быть проверена электрофоретически в денатурирующем агарозном геле с окраской бромидом этидия. Полосы рибосомальной РНК должны быть четкими. В образцах общей РНК эукариот четкие яркие полосы будут соответствовать 28S и 18S рРНК. Полоса 28S должна быть примерно в два раза более интенсивной, чем полоса 18S рРНК. Соотношение 2:1 является хорошим знаком целостности РНК. Частично деградировавшая РНК будет образовывать на геле смазанные полосы, и соотношение рРНК будет отличаться от 2:1. Полностью деградировавшая РНК на геле выглядит как смазанная зона в низкомолекулярной области геля.

Образцы РНК должны быть полностью очищены от ДНК. Рекомендуется обрабатывать выделенную РНК ДНКазой, не имеющей РНКазной активности. Для очистки РНК рекомендуем воспользоваться модулем NEBNext для выделения поли(А) мРНК с помощью магнитных шариков ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/reaktivy_dlya_sekvenirovaniya_sleduyushchego_pokoleniya/reaktivy_dlya_sozdaniya_bibliotek_rnk/modul_nebnext_dlya_vydeleniya_polia_mrnk_s_pomoshchyu_magnitnyh_sharikov/?brand= ), который не входит в состав наборов для пробоподготовки библиотек РНК, и заказывается отдельно.

После приготовления библиотеки очень важно оценить ее качество при помощи Bioanalyzer (Agilent) и количественной ПЦР.

Компания New England Biolabs предлагает реактивы NEBNext, обеспечивающие полный цикл подготовки библиотек NGS высокого качества. Вообще, процедура секвенирования NGS доступна не только лабораториям, которые приобрели секвенатор NGS – все больше лабораторий самостоятельно готовят библиотеки NGS и далее отдают их на анализ в центры коллективного пользования. Стоимость секвенирования в пересчете на один нуклеотид падает за счет увеличения производительности. При этом современные приборы позволяют проанализировать за один прогон большее количество образцов, чем требуется отдельной лаборатории или даже небольшому институту.

Пробоподготовка для различных платформ NGS

Учитывая указанные требования и потребности, компания New England Biolabs (NEB) разработала серию реактивов NEBNext&reg; для NGS на платформах Illumina&reg;, 454&trade;, SOLiD&trade;, Ion Torrent&trade;, предлагаемых мировыми лидерами в области NGS. Реактивы NEBNext&reg; доступны в следующих комплектациях:


1. Наборы реактивов - содержат ферменты, нуклеотиды и буферы, необходимые для проведения всех этапов пробоподготовки.</li>

2. Наборы реактивов в виде готовых смесей содержат те же компоненты, что и наборы реактивов, но их более удобно использовать, что ускоряет процесс пробоподготовки. </li>

3. Модули - содержат компоненты, необходимые для проведения отдельных этапов пробоподготовки, позволяют подстраивать процесс под определенные задачи. </li>

В данном обзоре мы по большей части обсуждаем наборы, обеспечивающие полный цикл пробоподготовки. Реактивы NEBNext применяются для создания библиотек ДНК, Chip-Seq библиотек, библиотек мРНК, библиотек малых РНК, экспрессионных библиотек и дальнейшего секвенирования на различных платформах.

NEBNext для создания ДНК-библиотек для Illumina

Прикреплённое изображение
Рис.1. Набор NEBNext

Все рассматриваемые реактивы прошли функциональную валидацию путём создания библиотек и последующего секвенирования на платформах HiSeq, MiSeq, Genome Analyzer IIx и HiScan компании Illumina.

Адаптеры и праймеры поставляются отдельно от наборов NEBNext, это позволяет увеличить количество комбинаций адаптеров, праймеров и реактивов друг с другом.

На первом этапе, в случае приготовления библиотек ДНК &ndash; необходима фрагментация исходного образца ДНК до определенной длины. Если в вашей лаборатории не используется для фрагментации ультразвук или небулизация, NEB предлагает воспользоваться фрагментазой NEBNext для двуцепочечной ДНК ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/reaktivy_dlya_sekvenirovaniya_sleduyushchego_pokoleniya/reaktivy_dlya_sozdaniya_bibliotek_dnk/ferment_nebnext_dtsdnk_fragmentase/?brand= ), которая позволит получить фрагменты ДНК в заданном диапазоне длин.

После анализа полученных фрагментов ДНК, проводится реакция восстановления концов и их фосфорилирования. Далее на 3'-конец прикрепляют аденин, чтобы произошло узнавание адаптеров, которые имеют тимидин на 3'-конце.

Далее проводят лигирование к концам полученных фрагментов адаптеров &ndash; это в случае Illumina шпилеобразные олигонуклеотиды, последовательность которых будет узнаваться секвенатором.

Далее, фрагменты ДНК, составляющие библиотеку, и присоединенные к ним шпилеобразные адаптеры, содержащие урацил в середине, обрабатываются ферментом урацилгликозилазой USER ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/reaktivy_dlya_modifikatsii_nk/fermenty_dlya_reparatsii_dnk/ferment_user/?sphrase_id=8171#item17584 ), которая позволяет получить линейные адаптеры на концах фрагментов ДНК.
И наконец, на последнем этапе полученные фрагменты амплифицирует при помощи высокоточной ДНК-полимеразы. При этом, на данном этапе, кроме увеличения количества копий, возможно избавиться от фрагментов, к которым адаптеры не прикрепились на оба конца, а также ввести на концы фрагментов праймеры (в случае мультиплексирования - также индекс праймеры). Праймеры понадобятся при процессе секвенирования.

Схема процесса пробоподготовки с использованием NEBNext представлена ниже на Рис.2.

Прикреплённое изображение
Рис.2. Схема пробоподготовки с использованием NEBNext, с мультиплексированием
Если перед вами стоит задача секвенирования образцов ДНК - то можно воспользоваться готовыми наборами: например набором реактивов NEBNext Ultra для создания геномных библиотек для Illumina ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/reaktivy_dlya_sekvenirovaniya_sleduyushchego_pokoleniya/reaktivy_dlya_probopodgotovki_illumina/nabor_reaktivov_nebnext_ultra_dlya_sozdaniya_genomnyh_bibliotek_dlya_illumina/?sphrase_id=8155#item22841 ) и готовой смесью NEBNext для создания геномных библиотек для Illumina ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/reaktivy_dlya_sekvenirovaniya_sleduyushchego_pokoleniya/reaktivy_dlya_probopodgotovki_illumina/master_mix_nebnext_dlya_sozdaniya_genomnyh_bibliotek_dlya_illumina/?brand= ).

Различия между двумя наборами состоят в том, что набор Ultra оперирует меньшими количествами исходного образца ДНК, а протокол занимает меньшее время. Поэтому набор Ultra рекомендуется начинающим работать с NGS.

Для приготовления ChIP-Seq библиотек можно воспользоваться
набором реактивов в виде готовой смеси NEBNext для создания библиотек ChIP-Seq для Illumina ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/reaktivy_dlya_sekvenirovaniya_sleduyushchego_pokoleniya/reaktivy_dlya_probopodgotovki_illumina/master_mix_nebnext_dlya_sozdaniya_bibliotek_chip-seq_dlya_illumina/?brand= ), а также
набором реактивов NEBNext для создания библиотек ChIP-Seq для Illumina ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/reaktivy_dlya_sekvenirovaniya_sleduyushchego_pokoleniya/reaktivy_dlya_probopodgotovki_illumina/nabor_reaktivov_nebnext_dlya_sozdaniya_bibliotek_chip-seq_dlya_illumina/?brand= ).

Мы искренне надеемся, что представленная информация будет полезна в вашей ежедневной работе!

Во второй части нашего обзора, посвященного NGS секвенированию, мы расскажем о мультиплексировании, продолжим обсуждение пробоподготовку для платформы Illumina, а также подробнее остановимся на реактивах для пробоподготовки на платформах Ion Torrnent, SOLiD, 454/Roche.



SkyGen 02.12.2014 14:59
Решения от New England Biolabs для секвенирования следующего поколения (Next Generation Sequencing, NGS). Часть 2.

Во второй части нашего обзора, посвященного NGS секвенированию, мы рассказываем о мультиплексировании, продолжаем обсуждение пробоподготовку для платформы Illumina, а также подробнее остановимся на реактивах для пробоподготовки на платформах Ion Torrnent, SOLiD, 454/Roche.

Мультиплексирование образцов

Прикреплённое изображение
Рис.2. Схема пробоподготовки с использованием NEBNext, с мультиплексированием

Выше уже упоминалось, что на этапе амплификации библиотеки можно воспользоваться одним комплектом праймеров или несколькими индекс праймерами. В первом случае, необходимо выбрать набор олигонуклеотидов NEBNext Singleplex для Illumina ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/reaktivy_dlya_sekvenirovaniya_sleduyushchego_pokoleniya/reaktivy_dlya_probopodgotovki_illumina/nabor_oligonukleotidov_nebnext_singleplex_dlya_illumina/?brand= ), и в таком случае в одном запуске Illumina может анализироваться один образец. Если стоит задача проанализировать за один раз несколько образцов, тогда необходимо воспользоваться возможностями мультиплексирования.

Чтобы на этапе анализа последовательностей образцов после секвенирования возможно было отличить образцы друг от друга - каждый образец использует праймеры с разными индексами (разными сигнальными последовательностями олигонуклеотидов) - для этого можно использовать набор олигонуклеотидов NEBNext Multiplex для Illumina (набор праймеров №1) ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/reaktivy_dlya_sekvenirovaniya_sleduyushchego_pokoleniya/reaktivy_dlya_probopodgotovki_illumina/nabor_oligonukleotidov_nebnext_multiplex_dlya_illumina_nabor_praymerov_1/?brand= ), или набор олигонуклеотидов NEBNext Multiplex для Illumina (набор праймеров №2) ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/reaktivy_dlya_sekvenirovaniya_sleduyushchego_pokoleniya/reaktivy_dlya_probopodgotovki_illumina/nabor_oligonukleotidov_nebnext_multiplex_dlya_illumina_nabor_praymerov_2/?brand= ).

Схематическое расположение индексов и праймеров представлено на Рис.2.

Наборы олигонуклеотидов NEBNext Multiplex содержат праймеры, достаточные для создания 12 мультиплексных библиотек. Праймеры имеют одинаковую нуклеотидную последовательность, за исключением последовательности из 6 нуклеотидов, которая у каждого праймера уникальна. Эту последовательность называют индексом, поскольку именно она позволяет идентифицировать, к какой библиотеке принадлежит фрагмент ДНК. Последовательности праймеров указаны в инструкциях к наборам.

Технология мультиплексирования была усовершенствована с появлением нового продукта NEB: набора олигонуклеотидов NEBNext с двойным баркодированием для Illumina (набор на 96 реакций) ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/reaktivy_dlya_sekvenirovaniya_sleduyushchego_pokoleniya/reaktivy_dlya_probopodgotovki_illumina/nabor_oligonukleotidov_nebnext_dualbarcode_dlya_illumina_nabor_na_96_reaktsiy/?brand= ). В данном случае используются два участка в 8 нуклеотидов для идентификации образца - по одному на каждом из праймеров. Возможно зашифровать 96 образцов с использованием лишь 20 пробирок с различными индексами (12+8). Двойное баркодирование существенно увеличивает точность отбора фрагментов при сборке последовательности различных образцов, так как идентификация каждого образца происходит дважды.

При планировании эксперимента с использованием NEBNext для Illuina, кроме набора для подготовки библиотеки важно не забыть включить в заказ один из наборов олигонуклеотидов, а также фрагментазу, если не планируется фрагментация при помощи небулизации или ультразвука.


Реактивы NEBNext для создания библиотек РНК, малых РНК и микро-РНК для Illumina


Для секвенирования образцов РНК, в процессе пробоподготовки их переводят в кДНК, и далее проводят пробоподготовку аналогично библиотеки ДНК. Дли приготовления библиотеки РНК воспользуйтесь набором реактивов NEBNext Ultra Directional для создания библиотек РНК для Illumina ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/reaktivy_dlya_sekvenirovaniya_sleduyushchego_pokoleniya/reaktivy_dlya_probopodgotovki_illumina/nabor_reaktivov_nebnext_ultra_directional_dlya_sozdaniya_bibliotek_rnk_dlya_illumina/?brand= ) и набором реактивов NEBNext Ultra для создания библиотек РНК для Illumina ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/reaktivy_dlya_sekvenirovaniya_sleduyushchego_pokoleniya/reaktivy_dlya_probopodgotovki_illumina/nabor_reaktivov_nebnext_ultra_dlya_sozdaniya_bibliotek_rnk_dlya_illumina/?brand= ).

Зачастую стоит задача по секвенированию малых РНК - в таком случае пользуются [url=http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/reaktivy_dlya_sekvenirovaniya_sleduyushchego_pokoleniya/reaktivy_dlya_probopodgotovki_illumina/nabor_nebnext_multiplex_dlya_sozdaniya_bibliotek_malyh_rnk_dlya_illumina/?brand=" >набором NEBNext Multiplex для создания библиотек малых РНК для Illumina (набор праймеров №1,№2)[/url] или набором реактивов NEBNext для создания библиотек малых РНК для Illumina ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/reaktivy_dlya_sekvenirovaniya_sleduyushchego_pokoleniya/reaktivy_dlya_probopodgotovki_illumina/nabor_reaktivov_nebnext_dlya_sozdaniya_bibliotek_malyh_rnk_dlya_illumina/?brand= ).

Дополнительно есть возможность при помощи набора реактивов NEBNext для создания библиотек мРНК для Illumina ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/reaktivy_dlya_sekvenirovaniya_sleduyushchego_pokoleniya/reaktivy_dlya_probopodgotovki_illumina/nabor_reaktivov_nebnext_dlya_sozdaniya_bibliotek_mrnk_dlya_illumina/?brand= ) подготовить для секвенирования экспрессионные библиотеки.



Реактивы NEBNext для создания ДНК-библиотек для Ion Torrent

Для пользователей Ion Torrent NEB предлагает два набора для создания ДНК-библиотек: набор реактивов NEBNext для быстрой фрагментации и создания геномных библиотек для Ion Torrent ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/reaktivy_dlya_sekvenirovaniya_sleduyushchego_pokoleniya/reaktivy_dlya_probopodgotovki_ion_torrent/nabor_reaktivov_nebnext_dlya_bystroy_fragmentatsii_i_sozdaniya_genomnyh_bibliotek_dlya_ion_torrent/?brand= ), и набор реактивов NEBNext для быстрого создания геномных библиотек для Ion Torrent ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/reaktivy_dlya_sekvenirovaniya_sleduyushchego_pokoleniya/reaktivy_dlya_probopodgotovki_ion_torrent/nabor_reaktivov_nebnext_dlya_bystrogo_sozdaniya_genomnyh_bibliotek_dlya_ion_torrent/?brand= ) (в данном случае в набор не включены реактивы для фрагментации ДНК).

В отличие от реактивов для Illumina, нет необходимости заказывать набор олигонуклеотидов отдельно, он уже включен в набор. Однако следует учитывать, что для данной платформы также существует возможность мультиплексирования, но с использованием набора олигонуклеотидов для мультиплексирования от Applied Biosystems. В таком случае в протоколе NEBNext просто используются олигонуклеотиды с мультиплексными индексами.


Реактивы NEBNext для создания библиотек малых РНК для SOLiD


Для пользователей данной платформы New England Biolabs предлагает воспользоваться набором реактивов NEBNext для создания библиотек малых РНК для SOLiD ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/reaktivy_dlya_sekvenirovaniya_sleduyushchego_pokoleniya/reaktivy_dlya_probopodgotovki_solid/nabor_reaktivov_nebnext_dlya_sozdaniya_bibliotek_malyh_rnk_dlya_solid/?brand= ).

Реактивы NEBNext для создания ДНК-библиотек для 454/Roche

NEB предлагает воспользоваться набором готовых смесей NEBNext для быстрого создания геномных библиотек для 454 ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/reaktivy_dlya_sekvenirovaniya_sleduyushchego_pokoleniya/reaktivy_dlya_probopodgotovki_roche_454/master_mix_nebnext_dlya_bystrogo_sozdaniya_genomnyh_bibliotek_dlya_454/?brand= ) или набором готовых смесей NEBNext для создания геномных библиотек для 454 ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/reaktivy_dlya_sekvenirovaniya_sleduyushchego_pokoleniya/reaktivy_dlya_probopodgotovki_roche_454/master_mix_nebnext_dlya_sozdaniya_genomnyh_bibliotek_dlya_454/?brand= ).

Следует, однако, иметь в виду, что наборы олигонуклеотидов NEB не предоставляет, и для проведения полноценного эксперимента необходимо использовать олигонуклеотиды от Roche.

Мы искренне надеемся, что представленная информация будет полезна в вашей ежедневной работе!



SkyGen 16.02.2015 18:18
Как найти свою ДНК-полимеразу среди многообразия ферментов от New England Biolabs? (Часть 1)

Прикреплённое изображение
Введение

Каждый день мы с вами встречаемся с различными задачами при постановке ПЦР-экспериментов. У каждого из нас, конечно, есть проверенные и хорошо проявившие себя варианты, которые подтвердили свою эффективность в лаборатории в течение многих лет. Однако научно-технический прогресс не стоит на месте, и постоянно хочется улучшить свою работу, используя более эффективные и продвинутые новые решения.

В этот момент, в поисках новых решений и идей, вы открываете список доступных полимераз, например, на сайте или в каталоге New England Biolabs, и видите, что для проведения простой амплификации ДНК можно воспользоваться более чем 125 продуктами. Это не только разные типы ДНК-полимераз, но и разные форматы, в которых они доставляются к потребителю. Сразу разбегаются глаза, и не всегда ясно, чем "Hot Start" отличается от "Master Mix"?

Поэтому, сегодняшний обзор является первой частью из двух статей и посвящен тому, как же ориентироваться на этом огромном рынке, и будет полезен в первую очередь новичкам, однако и продвинутые пользователи, надеемся, смогут по иному взглянуть на некоторые новые продукты New England Biolabs.

Фермент можно купить как отдельно, так и в виде наборов, содержащих все компоненты для постановки эксперимента

Итак, NEB сегодня предлагает большое разнообразие ДНК-полимераз и наборов с ними. Давайте на первом этапе определимся с форматами, в которых выпускаются ферменты.

Конечно же самое простое решение - это купить просто фермент, выбрав необходимое количестве единиц активности, в комплекте к нему будет прилагаться буферный раствор.

В некоторых случаях также прилагается так называемый GC-Enhancer - специальный раствор, которые добавляют, когда предстоит работа с GC-богатыми образцами. Такой раствор для улучшения работы ДНК-полимеразы, например, поставляется вместе с OneTaq ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/onetaq_dnk-polimeraza/#item18821 )/ OneTaq Hot Start ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/onetaq_hot_start_dnk-polimeraza/?brand= ), Q5 High-Fidelity ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/q5_hf_dnk-polimeraza/?brand= )/Q5 Hot Start ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/gotovye_nabory_master_mix/master_mix_q5_hot_start_hf_dlya_ptsr/#item18847 ), Phusion High-Fidelity ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/phusion_hf_dnk-polimeraza/?brand= )/ Phusion Flex Hot Start ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/phusion_hot_start_flex_dnk-polimeraza/?brand= ) ДНК-полимеразам.

Если вы хотите сразу приобрести все компоненты реакции, которые понадобятся во время постановки эксперименты - ваш выбор - это готовый набор для проведения ПЦР. Такой набор содержит в себе в отдельных пробирках: фермент, смесь dNTP, буферный раствор без Mg2+, буферный раствор с Mg2+, раствор Mg2+, очищенную от нуклеаз воду. Приобретая такой набор, вы будете уверены, что, имея на руках образец ДНК и праймеры, вы будете готовы провести эксперимент. Такая фасовка предусмотрена для Taq ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/nabory_i_reaktivy_dlya_provedeniya_amplifikatsii_i_ptsr/nabor_dlya_provedeniya_ptsr_s_taq_dnk-polimerazoy/ ) (в наборе дополнительно маркер длин), Q5 High-Fidelity ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/nabory_i_reaktivy_dlya_provedeniya_amplifikatsii_i_ptsr/nabor_q5_dlya_hf_ptsr/ ) (также в наборе маркер длин, краситель для нанесения на гель, фермент в виде готовой смеси 2X), Phusion ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/nabory_i_reaktivy_dlya_provedeniya_amplifikatsii_i_ptsr/nabor_phusion_dlya_hf_ptsr/ ) (также в наборе маркер длин, контрольный образец ДНК, смесь праймеров для контрольной реакции), LongAmp ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/nabory_i_reaktivy_dlya_provedeniya_amplifikatsii_i_ptsr/nabor_dlya_provedeniya_longamp_ptsr_s_taq_dnk-polimerazoy/ ) ДНК-полимераз.

Чем Master Mix отличается от Hot Start и от QuickLoad?

Другой популярный формат для поставки ДНК-полимераз - в виде готовой смеси "Master mix". В этом случае, все компоненты ПЦР реакции находятся в одной пробирке с концентрацией x2,x5: там находится сам фермент, dNTP, MgCl2, KCl, стабилизаторы. В чем преимущество такой фасовки: уменьшается вероятность совершить ошибку при раскапывании, и упрощается протокол. Практически все ДНК-полимеразы от New England Biolabs можно приобрести в формате готовой смеси: Q5 ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/gotovye_nabory_master_mix/master_mix_q5_hf_dlya_ptsr/ ) / Q5 Hot Start ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/gotovye_nabory_master_mix/master_mix_q5_hot_start_hf_dlya_ptsr/ ), Phusion ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/gotovye_nabory_master_mix/master_mix_phusion_hf_dlya_ptsr/ ) / Phusion Flex Hot Start ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/gotovye_nabory_master_mix/master_mix_phusion_hot_start_flex_dlya_ptsr/ ), LongAmp ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/gotovye_nabory_master_mix/master_mix_longamp_taq_dnk-polimerazy/ ) / LongAmp Hot Start ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/gotovye_nabory_master_mix/master_mix_longamp_hot_start_taq_dlya_ptsr/ ), OneTaq ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/gotovye_nabory_master_mix/master_mix_onetaq/ ) / OneTaq Hot Start ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/gotovye_nabory_master_mix/master_mix_onetaq_hot_start/ ), Taq ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/gotovye_nabory_master_mix/master_mix_taq_dnk-polimerazy/ ) / Taq Hot Start ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/gotovye_nabory_master_mix/master_mix_hot_start_taq_dlya_ptsr/ ).

Конечно же, в таком случае надо сразу выбирать - какой буфер должен быть добавлен - специальный для GC-богатых участков, стандартный или содержащий уже краску, так чтобы можно было реакцию сразу нанести на гель (т.н. QuickLoad). В формате QuickLoad можно приобрести готовые смеси следующих полимераз: OneTaq ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/gotovye_nabory_master_mix/master_mix_onetaq_quick-load/?brand= ) / OneTaq Hot Start ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/gotovye_nabory_master_mix/master_mix_onetaq_hot_start_quick-load/?brand= ) , Taq ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/gotovye_nabory_master_mix/master_mix_quick-load_taq_dnk-polimerazy/?brand= ) ДНК полимеразы.

При анализе многообразия продуктов для ПЦР, можно обратить внимание, что некоторые полимеразы представлены с добавлением приставки Hot Start. Это означает, что благодаря присутствию стабилизирующих антител ДНК-полимераза находится в неактивном состоянии, активируясь при нагревании, которое сопровождает денатурацию ДНК в первом цикле ПЦР. В таком виде можно найти OneTaq Hot Start ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/onetaq_hot_start_dnk-polimeraza/?brand= ), Hot Start Taq ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/hot_start_taq_dnk-polimeraza_so_standartnym_taq_buferom/?sphrase_id=7565#item18849 ), Q5 Hot Start ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/q5_hot_start_hf_dnk-polimeraza/?sphrase_id=7566#item18845 ), Phusion Hot Start Flex ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/phusion_hot_start_flex_dnk-polimeraza/?sphrase_id=7567#item18862 ), LongAmp Hot Start Taq ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/longamp_hot_start_taq_dnk-polimeraza/?sphrase_id=7569#item18860 ) а также EpiMark Hot Start Taq ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/epigenetika/epigeneticheskiy_analiz/epimark_hot_start_taq_dnk-polimeraza/?sphrase_id=7568#item18841 ).


Цель эксперимента определят выбор ДНК-полимеразы


На первом этапе выбора ДНК-полимеразы надо понять - предстоит ли делать стандартный эксперимент, ПЦР с высокой точностью или специфическую реакцию ПЦР.

Если перед нами стоит задача провести самый обычный, рутинный эксперимент - нашим выбором будут OneTaq ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/onetaq_dnk-polimeraza/?brand= ) / OneTaq Hot Start ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/onetaq_hot_start_dnk-polimeraza/?brand= ), Taq ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/taq_dnk-polimeraza_so_standartnym_taq_buferom/?brand= ) / Hot Start Taq ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/hot_start_taq_dnk-polimeraza_so_standartnym_taq_buferom/#item18850 ) ДНК-полимеразы.

GC-богатые образцы, высокий выход и высокие требования к точности амплификации

Для экспериментов, к которым предъявляются особенно высокие стандарты точности копирования, рекомендуем воспользоваться Q5 ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/q5_hf_dnk-polimeraza/?brand= ) / Q5 Hot Start ( http://href=''http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/q5_hot_start_hf_dnk-polimeraza/?sphrase_id=7570#item18845 ), Phusion ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/phusion_hf_dnk-polimeraza/#item18853 )/Phusion Flex ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/phusion_hot_start_flex_dnk-polimeraza/#item18863 ) ДНК-полимеразы, а для амплификации библиотек для NGS был разработан специальный продукт на основе Q5 - готовая смесь 2Х для высокоточной ПЦР NEBNext ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/gotovye_nabory_master_mix/master_mix_dlya_multipleks-ptsr/?brand= ) . Точность ДНК-полимеразы Q5 более чем в 100 раз выше чем у полимеразы Taq, а у Phusion - более чем в 50 раз. Эти же полимеразы следует выбирать, если скорость копирования является критической величиной для эксперимента (соответственно 6000 и 4000 нуклеотидов в минуту), а расход фермента на реакцию на 25% меньше, чем у аналогичных ферментов NEB. Оба фермента обладают 3'-5' экзонуклеазной активностью. В результате амплификации получают ампликоны с тупыми концами.

Если вы планируете проводить сайт-направленный мутагенез - также выбирайте Q5 ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/q5_hf_dnk-polimeraza/?brand= )/ Q5 Hot Start ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/q5_hot_start_hf_dnk-polimeraza/?sphrase_id=7570#item18845 ) ДНК-полимеразу.

В то же время, VentR ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/ventr_dnk-polimeraza/?brand= ) / Deep VentR ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/deep_ventr_dnk-polimeraza/?brand= ) ДНК-полимераза обладает в 5 раз более высокой точностью, чем у ДНК-полимеразы Taq, а также обладает 3'-5' экзонуклеазной активностью и оставляет после себя тупые концы.Такая термостабильная полимераза может использоваться для рутинных экспериментов, требующих более высокую точность, чем у Taq.

Если вам предстоит работать с образцами с высоким содержанием GC, в первую очередь стоит обратить внимание на Q5 ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/q5_hf_dnk-polimeraza/?brand= ) / Q5 Hot Start ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/q5_hot_start_hf_dnk-polimeraza/?brand= ), OneTaq ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/onetaq_dnk-polimeraza/?brand= )/ OneTaq Hot Start ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/onetaq_hot_start_dnk-polimeraza/?brand= ) ДНК-полимеразы. Однако если предстоит амплификация очень длинных фрагментов, длиннее 20 000 нуклеотидов, которые к тому же GC-богатые, то можно рассмотреть возможность использования LongAmp ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/longamp_taq_dnk-polimeraza/?brand= ) / LongAmp Hot Start Taq ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/longamp_hot_start_taq_dnk-polimeraza/?brand= ).



В следующих 2-х частях нашего обзора по ДНК-полимеразам, читайте про другие важные для амплификации продукты!



SkyGen 16.02.2015 18:22
Как найти свою ДНК-полимеразу среди многообразия ферментов от New England Biolabs? (Часть 2)
Прикреплённое изображение

Мы продолжаем наш рассказ о ДНК-полимеразах от New England Biolabs.

Высокий выход экспериментам обеспечат Q5 ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/q5_hf_dnk-polimeraza/?brand= ) / Q5 Hot Start ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/q5_hot_start_hf_dnk-polimeraza/?sphrase_id=7570#item18845 ), OneTaq ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/onetaq_dnk-polimeraza/?brand= ) / OneTaq Hot Start ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/onetaq_hot_start_dnk-polimeraza/?brand= ), Phusion ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/phusion_hf_dnk-polimeraza/?brand= ) / Phusion Flex ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/phusion_hot_start_flex_dnk-polimeraza/?brand= ).

Амплификация длинных фрагментов ДНК

Если перед вами стоит задача амплификации длинных фрагментов - хорошим выбором будут ДНК-полимеразы Q5 ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/q5_hf_dnk-polimeraza/?brand= )/Q5 Hot Start ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/q5_hot_start_hf_dnk-polimeraza/?sphrase_id=7570#item18845 ), Phusion ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/phusion_hf_dnk-polimeraza/#item18853 ) / Phusion Flex ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/phusion_hot_start_flex_dnk-polimeraza/#item18863 ), подтвержденная длина амплификации - до 20 000 нуклеотидов. В то же время для амплификации ультра-длинных фрагментов - до 30 000 нуклеотидов, самым оптимальным решением будет LongAmp ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/longamp_taq_dnk-polimeraza/#item18772 ) / LongAmp Hot Start Taq ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/longamp_hot_start_taq_dnk-polimeraza/#item18861 ) ДНК-полимеразы.

С другой стороны - если длина ампликона меньше 6 000 нуклеотидов - можно остановить свой выбор на One Taq ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/onetaq_dnk-polimeraza/#item18821 )/One Taq Hot Start ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/onetaq_hot_start_dnk-polimeraza/#item18823 ) или Vent R ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/ventr_dnk-polimeraza/#item18680 )/Deep VentR ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/deep_ventr_dnk-polimeraza/#item18682 ), а при длине ампликона 5 000 нуклеотидов - на Taq ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/taq_dnk-polimeraza_so_standartnym_buferom_thermopol_ii_ne_sodergit_mg/#item18770 )/Hot Start Taq ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/hot_start_taq_dnk-polimeraza_so_standartnym_taq_buferom/#item18850 ). Однако для фрагмента Кленова Hemo KlenTaq ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/fragment_klenova_hemo_klentaq/#item18786 ), EpiMark Hot Start Taq ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/epigenetika/epigeneticheskiy_analiz/epimark_hot_start_taq_dnk-polimeraza/#item18842 ) пределом будет являться 2 000 и 1 000 нуклеотидов соответственно.

Теперь давайте рассмотрим ДНК-полимеразы, которые используются для реализации ПЦР со специфическими задачами:


Мультиплексная ПЦР (ПЦР с использованием множества пар праймеров одновременно)


Если перед вами стоит задача успешно провести ПЦР с несколькими парами праймеров - наш совет, в первую очередь - использовать готовую смесь для мультиплескной ПЦР 5X ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/gotovye_nabory_master_mix/master_mix_dlya_multipleks-ptsr/?brand= ).

Кроме того, хорошие результаты для мультиплексной ПЦР показывает OneTaq® Hot Start ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/onetaq_hot_start_dnk-polimeraza/ ) ДНК-полимераза.


Амплификация ДНК из образцов цельной крови человека и мыши


Фрагмент Кленова Hemo KlenTaq® ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/fragment_klenova_hemo_klentaq/#item18786 ) - ваш выбор, когда требуется проводить амплификацию с образцами цельной крови, так как именно этот фермент наименее восприимчив к ингибиторам, содержащимся в крови. Это аналог Taq полимеразы, которая была адаптирована для амплификации в одной реакционной смеси с образцами цельной крови. Будет успешно использоваться для образцов крови человека и мыши, при этом содержание крови может составлять до 20% (объем реакционной смеси 25 мкл) или до 30% (объем реакционной смеси 50 мкл).

Кроме использования образцов цельной крови, возможна амплификация с использованием образцов засохшей крови, а также для удлинения праймеров. Длина амплифицируемых участков не должна превышать 2 000 нуклеотидов. Полимераза вообще не обладает экзонуклеазной активностью. После амплификации оставляет на 3'-конце на один нуклеотид больше.

Количественная ПЦР (qПЦР)

При выборе ДНК-полимеразы для проведения количественной ПЦР - самым главным параметром будет являться наличие 5'→3' экзонуклеазной активности. Такой активностью обладают OneTaq ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/onetaq_dnk-polimeraza/?brand= ) / OneTaq Hot Start ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/onetaq_hot_start_dnk-polimeraza/#item17576 ), Taq ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/taq_dnk-polimeraza_so_standartnym_buferom_ne_sodergit_mg/#item18768 )/ Taq Hot Start ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/hot_start_taq_dnk-polimeraza_so_standartnym_taq_buferom/#item18850 ), LongAmp ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/longamp_taq_dnk-polimeraza/#item18772 )/ LongAmp Hot Start ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/longamp_hot_start_taq_dnk-polimeraza/#item18861 ) ДНК полимеразы. Соответственно, в зависимости от поставленной задачи по точности амплификации и длины амплифицируемого участка, можно остановиться как на Taq ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/taq_dnk-polimeraza_so_standartnym_buferom_ne_sodergit_mg/#item18768 ) (или ДНК-полимеразе Taq с буфером, увеличивающим термостабильность ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/taq_dnk-polimeraza_so_standartnym_buferom_thermopol_ii_ne_sodergit_mg/#item18770 )), OneTaq ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/onetaq_dnk-polimeraza/?brand= ) (ее точность в два раза выше чем точность Taq) или на LongAmp ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/longamp_taq_dnk-polimeraza/#item18772 )(длина амплифицируемого участка может достигать 30 000 нуклеотидов.

Амплификация ДНК, модифицированной бисульфитом

С такой задачей превосходно справится EpiMark Hot Start Taq ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/epigenetika/epigeneticheskiy_analiz/epimark_hot_start_taq_dnk-polimeraza/?sphrase_id=7556#item18841 ) ДНК-полимераза. В результате амплификации на 3'-конце остается один лишний аденозин.


ПЦР колоний клеток


Если Вам надо подтвердить наличие фрагмента ДНК в плазмиде, введенной в клетку, а также определить ориентацию введенного участка, то возможно провести ПЦР лизата клеток при помощи OneTaq ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/onetaq_dnk-polimeraza/#item18821 ) ДНК-полимеразы (альтернативной возможностью является LongAmp Taq ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/longamp_taq_dnk-polimeraza/#item18772 )).
Полная амплификация генома отдельной клетки
В последнее время становится все более популярным и востребованным изучать геном отдельных клеток (особенно это актуально в эмбриологии) - для этого проводят полногеномную амплификацию ДНК отдельной клетки - и для этой задачи NEB выпустила на рынок набор для полной амплификации генома клетки Pico Plex ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/nabory_i_reaktivy_dlya_provedeniya_amplifikatsii_i_ptsr/nabor_dlya_polnoy_amplifikatsii_genoma_kletki/?brand= ).

Заключение

Таким образом, компания New England Biolabs предоставляет возможность выбрать ДНК-полимеразу для решения практически любой задачи. Если вы все еще сомневаетесь, начните работу, используя OneTaq ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/onetaq_dnk-polimeraza/#item18821 ) или Q5 ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/q5_hf_dnk-polimeraza/#item17578 ) ДНК-полимеразу. А тем временем мы предоставим третью часть нашего обзора, где расскажем о ДНК-полимеразах от NEB, о которых мы не упомянули в данном тексте.



SkyGen 24.02.2015 11:51
Как найти свою ДНК-полимеразу среди многообразия ферментов от New England Biolabs? (Часть 3)

Прикреплённое изображение

Изотермальная амплификация

ПЦР в классическом понимании включает в себя повторяющийся цикл изменения температуры инкубации реакционной смеси. В то же время существуют другие методы сиквенс-специфичной амплификации ДНК.

Предложенный в 2000 г. метод изотермальной петлевой амплификации (LAMP) - новый, эффективной и относительно малозатратный метод, который может быть осуществлен в лабораториях, не имеющих сложного оборудования, или в поле.

LAMP позволяет амплифицировать целевые последовательности ДНК в изотермальных условиях. В этом случае нет необходимости применять амплификаторы, достаточно иметь нагревательный блок, для установки постоянной температуры 60-65°C. Используются 4-6 праймеров (прямых и обратных внутренних, прямых и обратных внешних), направленных на 6-8 различных комплементарных участков ДНК. Такой подход повышает специфичность амплификации.

Для проведения изотермальной амплификации могут быть использованы следующие ДНК-полимеразы от New England Biolabs: Bst 2.0 ДНК-полимераза ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/bst_20_dnk-polimeraza/?brand= ), [url=http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/bst_20_warm_start_dnk-polimeraza/?brand=" >Bst 2.0 WarmStart® ДНК-полимераза[/url], полноразмерная Bst ДНК-полимераза ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/bst_dnk-polimeraza_polnorazmernaya/?brand= ), большой фрагмент Bst ДНК-полимеразы ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/bst_dnk-polimeraza_bolshoy_fragment/?brand= ), фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I (без 3' - 5' экзонуклеазной активности) ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/fragment_klenova_dnk-polimerazy_i_net_3_-_5_ekzonukleaznoy_aktivnosti/?brand= ). Все они обладают хеликазной активностью, которая требуется для проведения амплификации при постоянной температуре. В то же время, NEB предлагает воспользоваться для изотермальной амплификации уникальным продуктом на рынке - <a href ="http://www.skygen.com/catalog/2_biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/nabory_i_reaktivy_dlya_provedeniya_amplifikatsii_i_ptsr/universalnyy_nabor_isoamp_ii_dlya_termofilnoy_helikaza-zavisimoy_amplifikatsii_thda/?sphrase_id=8071#item23207]универсальным набором IsoAmp II для термофильной хеликаза-зависимой амплификации (tHDA)[/url].

Говоря о продуктах, используемых для проведения изотермальной амплификации, следует отметить также набор для полной амплификации генома клетки SingePlex ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/nabory_i_reaktivy_dlya_provedeniya_amplifikatsii_i_ptsr/nabor_dlya_polnoy_amplifikatsii_genoma_kletki/?brand= ) от New England Biolabs.

Условия многих типов изотермальных экспериментов предусматривают повышенные температуры (> 50°C). ДНК-полимераза Bst заполняет нишу между термофильными и мезофильными полимеразами. Оптимум температуры порядка 60-65°C выше, чем у фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/fragment_klenova_dnk-polimerazy_i/?sphrase_id=8072#item17537 ) но ниже, чем у VentR ДНК-полимеразы ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/ventr_dnk-polimeraza/?brand= ). разброс оптимальных температур у различных ДНК-полимераз дает исследователям больше возможностей для оптимизации соотношения хеликазной активности и условий отжига праймеров. Повышенная температура обеспечивает севенирование в GC-богатых регионах.

Большой фрагмент полимеразы I Bacillus stearothermophilus (Bst ДНК-полимераза, большой фрагмент ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/bst_dnk-polimeraza_bolshoy_fragment/?brand= )) очень долгое время оставался лучшим выбором для проведения изотермальной амплификации (оптимум рабочей температуры порядка 65°C).

Данный фермент был доработан и усовершенствован и появился под названием Bst 2.0 ДНК-полимераза ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/bst_20_dnk-polimeraza/?brand= ) -это in silico сконструированный гомолог большого фрагмента Bst ДНК-полимеразы.

Обе ДНК-полимеразы могут быть использованы для проведения изотермальной амплификации и для секвенирования ДНК. Bst 2.0 ДНК-полимераза ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/bst_20_dnk-polimeraza/?brand= ) характеризуется увеличением выхода амплификации, большую устойчивость к солям (до 120 mM одновалентной соли), больший диапазон температурного оптимума и увеличенную термостабильность (60–72°C) по сравнению с исходной ДНК-полимеразой. Также Bst 2.0 ДНК-полимераза ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/bst_20_dnk-polimeraza/?brand= ) упрощает вставку dUTP. В то же самое время Bst 2.0 ДНК-полимераза ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/bst_20_dnk-polimeraza/?brand= ) может обеспечить решение всех задач, для которых используется большой фрагмент Bst ДНК-полимеразы ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/bst_dnk-polimeraza_bolshoy_fragment/?brand= ).

Для диагностических экспериментов, требующих высокую воспроизводимость, мы рекомендуем использовать [url=http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/bst_20_warm_start_dnk-polimeraza/?brand=" >Bst 2.0 WarmStart® ДНК-полимеразу[/url].

WarmStart вариант обладает всеми качествами Bst 2.0 ДНК-полимеразы, с дополнительным преимуществом, аналогичным HotStart у обычных ДНК-полимераз. Так, фермент может проявлять нежелательную, не зависящую от матрицы активность при температуре ниже температуры амплификации и эта активность может значительно повлиять на эффективность и на воспроизводимость. Аптамер, входящий в состав [url=http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/bst_20_warm_start_dnk-polimeraza/?brand=" >Bst 2.0 WarmStart® ДНК-полимеразы[/url], ингибирует активность при температуре ниже 50°C, поэтому реакционная смесь может быть приготовлена при комнатной температуре без опасности прохождения неспецифической реакции. Также в данном случае не требуется отдельный шаг для активации при проведении ПЦР.

Если 5'-3' экзонуклеазная активность более важна, чем хеликазная активность, мы можем предложить использовать полноразмерную Bst ДНК-полимеразу ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/bst_dnk-polimeraza_polnorazmernaya/?brand= ).

Также NEB предлагает ряд ДНК-полимераз, которые сохраняют активность при пониженных температурах. Фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I (без 3' - 5' экзонуклеазной активности) ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/fragment_klenova_dnk-polimerazy_i_net_3_-_5_ekzonukleaznoy_aktivnosti/?brand= ) и большой фрагмент Bsu ДНК-полимеразы ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/bst_dnk-polimeraza_polnorazmernaya/?brand= ), - оптимальный выбор для решения задач по проведению изотермальной амплификации при температуре 25&deg;C Bsu ДНК-полимераза сохраняет 50% от своей активности при 37&deg;C, что в свою очередь в два раза выше активности фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I.

Кроме вышеперечисленного,большой фрагмент Bsu ДНК-полимеразы ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/bst_dnk-polimeraza_polnorazmernaya/?brand= ) используется для случайного мечения праймеров, синтеза второй цепи кДНК, удлинения одного конца цепи при помощи dA и амплификации замещением цепей.

Особенно хочется отметить в нашем обзоре ДНК-полимеразу phi29 ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/phi29_dnk-polimeraza/?brand= ). Если задачи эксперимента требуют чрезвычайно высокую процессивность, наличие проверяющего экзонуклеазного домена, высокую точность и высокую хеликазную активность - тогда следует остановить свой выбор на этой полимеразе.

Термофильная хеликаза-зависимая амплификация (tHDA)

Термофильная хеликаза-зависимая амплификация (tHDA) - это новый метод изотермальной амплификации нуклеиновых кислот. Так как же при ПЦР, с помощью метода tHDA селективно амплифицируют регион последовательности ДНК, ограниченный парой праймеров. Тем не менее, в отличие от ПЦР, для разделения двуцепочечной ДНК используется фермент с хеликазной активностью вместо нагревания. Это позволяет амплифицировать ДНК без циклической программы нагревания. Такой метод может быть объединен с реакцией обратной транскрипцией при анализе РНК.

[url=http://www.skygen.com/catalog/2_biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/nabory_i_reaktivy_dlya_provedeniya_amplifikatsii_i_ptsr/universalnyy_nabor_isoamp_ii_dlya_termofilnoy_helikaza-zavisimoy_amplifikatsii_thda/?sphrase_id=7896#item23207" >Универсальный набор IsoAmp II для термофильной хеликаза-зависимой амплификации (tHDA[/url] используется для амплификации и детекции коротких последовательностей ДНК (70-120 п.о.) при постоянной температуре. Набор может быть использован с различными матрицами, включая геномную ДНК микробов, вирусную ДНК, плазмидную ДНК и кДНК. После оптимизации состава праймеров и буферного раствора, при помощи tHDA может быть амплифицирована, и далее обнаружена при помощи электрофореза в агарозе, даже одиночная копия ДНК. Универсальный набор IsoAmp II для термофильной хеликаза-зависимой амплификации позволяет проводить различные типы ПЦР с использованием единого реакционного буфера.

Срок использования набора составляет 6 месяцев при хранении при -20&deg;C и дольше при хранении при 80&deg;C.

Восстановление и амплификация поврежденных образцов ДНК


Иногда для проведения экспериментов приходится использовать образцы поврежденной ДНК. Улучшить качество образцов перед амплификацией, поможет набор PreCR для репарации ДНК ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/reaktivy_dlya_modifikatsii_nk/fermenty_dlya_reparatsii_dnk/nabor_precr_dlya_reparatsii_dnk/?sphrase_id=8070#item18755 ). Этот набор поможет восстановить целостность ДНК и исправить такие повреждения как: фрагментация (гидролиз, действие нуклеаз), сшивки между ДНК и протеинами (действие формальдегида), деаминированные цитозины (гидролиз), окисление пиримидинов, окисление гуанина, блокированные 3'-концы, димеры тимидинов (ультрафиолетовая радиация), выщепление одиночных нуклеотидов из последовательности и т.д.

С другой стороны, даже поврежденные образцы ДНК можно амплифицировать, если воспользоваться специально предназначенной для этого Sulfolobus ДНК-полимеразой IV ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/sulfolobus_dnk-polimeraza_iv/?brand= ). Эта полимераза с успехом подходит как для устранения повреждений ДНК, так и для амплификации через поврежденные участки.

Включение в цепь ДНК нестандартных нуклеотидов

C использованием Therminator ДНК-полимеразы ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/therminator_dnk-polimeraza/?brand= ) возможно решить следующие задачи:
1. провести секвенирование ДНК при частичном замещении на рибонуклеотиды;
2. провести секвенирование (а также анализ SNP) при помощи дидезоксинуклеотидов;
3. провести секвенирование (а также анализ SNP) при помощи нуклеотидов, модифицированных ацильными остатками;

Следует, однако, обратить внимание на то, что при амплификации протяженных участков вам потребуется пристально отнестись к оптимизации условий реакции.

ДНК-полимеразы VentR и Deep VentR ДНК-полимераза

VentR ДНК-полимераза ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/ventr_dnk-polimeraza/?brand= ) - это высокоточная термостабильная полимераза. Точность ее в 5-15 раз выше чем у Taq, что является результатом 3'→5' экзонуклеазной активности. При этом более чем 90% фермента остаются активными после инкубации в течение 1 часа при 95°C.

Deep VentR ДНК-полимераза ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/deep_ventr_dnk-polimeraza/?brand= ) - это вторая высокоточная полимераза от компании New England Biolabs. Характеризуется еще больше термостабильностью, чем ДНК-полимераза VentR при температуре 95-100°C.

VentR ДНК-полимераза (без экзонуклеазной активности) ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/ventr_dnk-polimeraza_net_ekzonukleaznoy_aktivnosti/?brand= ) получена путем удаления 3´→ 5´ экзонуклеазного домена в составе ДНК-полимеразы VentR ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/ventr_dnk-polimeraza/?brand= ). Такой вариант предпочтителен для использования в высокотемпературных реакциях секвенирования с использованием дидезоксинуклеотидов, и для реакции удлинения праймеров. Точность полимеразы ниже, чем у оригинального фермента, и в 2 раза выше, чем у Taq.

Deep VentR ДНК-полимераза (нет экзонуклеазной активности) ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/deep_ventr_dnk-polimeraza_net_ekzonukleaznoy_aktivnosti/?brand= ) - это результат модификации ДНК-полимеразы Deep VentR, не обладает 3´→ 5´ экзонуклеазной активностью. Фермент чрезвычайно термостабилен, сохраняя до 50% активности после инкубации в течение 23 ч при 95°C и 8 ч при 100°C.

VentR ДНК-полимераза (без экзонуклеазной активности) и Deep VentR ДНК-полимераза (без экзонуклеазной активности) могут применяться для удлинения праймеров и для секвенирования при температуре 72°C.

Мы надеемся, что представленный обзор будет полезен в ежедневной работе, поможет внедрить результаты новых разработок NEB и улучшить качество ПЦР-экспериментов!



SkyGen 24.02.2015 12:12
Реактивы для секвенирования по Сэнгеру и многое другое от компании Nimagen
Прикреплённое изображение
Мы хотим еще раз обратить ваше внимание на аналоги реактивов для секвенирования на платформе ABI Genetic Analyzer, от компании Nimagen. Данные реактивы, которые позволят сэкономить значительные средства при проведении Ваших экспериментов.

Теперь, при работе на платформах ABI Genetic Analyzers 3100, 3130, 3130XL, 3500, 3500XL, 3730 &amp; 3730XL, воспользуйтесь наборами для проведения терминирующей реакции ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/nimagen/nabory_reagentov_dlya_sekvenirovaniya/ ), полимерами и буферными растворами ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/nimagen/polimery/ ), а также нашими новинками для улучшения качества результатов - раствором для очистки капилляров ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/nimagen/ochistka_kapillyarov/ ), наборами для очистки реакционной смеси ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/nimagen/ochistka_reaktsionnoy_smesi_posle_sekvenirovaniya/ ) после реакции секвенирования, стандартами ДНК ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/nimagen/standarty/ ), добавками для улучшения секвенирования GC-богатых и сложных образцов ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/nimagen/dobavki_dlya_uluchsheniya_kachestva_sekvenirovaniya/ ).

Если вы планируете проведение экспериментов секвенирования по Сэнгеру, то ваша работа будет разделена не несколько этапов, на каждом из которых мы сейчас коротко остановимся, и расскажем, какие продукты потребуются для реализации каждого шага.

Платформы, на которых работают сегодня большинство исследователей, для проведения секвенирования по Сэнгеру: ABI Genetic Analyzers 310, 3100, 3130, 3130XL, 3500, 3500XL, 3730 &amp; 3730XL. Данные приборы отличаются друг от друга прежде всего количеством капилляров, и следовательно производительностью.

Выделение исследуемого образца ДНК

На первом этапе необходимо выделить образец ДНК из вашего образца и очистить его. На данном этапе мы рекомендуем воспользоваться колоночным выделением от Bioline ( http://www.skygen.com/proizvoditeli/bioline/catalog/ ), или другим методом, который успешно зарекомендовал себя в ваших руках.

Реакция терминируюшего секвенирования с использованием BrightDye

После проверки качества очистки и оценки количества выделенной ДНК, можно приступить к реакции терминирующего секвенирования: введения флуоресцентной метки в фрагменты ДНК разной длины, которые будут далее анализироваться на одной из платформ. Фрагменты разной длины образуются благодаря обрыву цепи по время ПЦР, который происходит во время встраивания флуоресцентно меченых дидезоксинуклеотидов. Проведение данного этапа, для дальнейшего исследования на всех платформах (ABI 310, 31xx, 3500 и 3730 ) успешно обеспечивается наборами для проведения терминирующей реакции BrightDye ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/nimagen/nabory_reagentov_dlya_sekvenirovaniya/ ). Набор реактивов состоит из готовой смеси для секвенирования BrightDye и буфера для секвенирования.

В готовую смесь для проведения терминирующего секвенирования достаточно добавить образец ДНК для секвенирования и праймеры согласно протоколу (прикреплен к данному обзору). Набор реактивов полностью аналогичен реактивам Bigdye 3.1, и позволяет получить аналогичные результаты, что подтверждено ведущими лабораториями Москвы и Новосибирска.

На рисунках 1 и 2 представлены результаты проведения секвенирования с использованием BrigthDye и Bigdye в сравнении. Результаты любезно предоставлены исследователями из Института цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск.

Прикреплённое изображение
Рис.1. Сравнение секвенирования с использованием BrightDye (A), Bigdye (Б), в 35 мкл реакционной смеси добавляли 4 мкл готовой смеси для секвенирования, количество образца ДНК (pGEM ) - 300 fmole, количество праймера - 8 pmole.

Прикреплённое изображение
Рис.2. Сравнение секвенирования с использованием BrightDye (A), Bigdye (Б), в 35 мкл реакционной смеси добавляли 2 мкл готовой смеси для секвенирования, количество образца ДНК (pGEM ) - 300 fmole, количество праймера - 8 pmole.

Из рисунков видно, что реактивы дают аналогичные результаты, причем при разбавлении аликвоты готовой смеси для секвенирования в 2 раза, качество полученных результатов не страдает.

Многократное разбавление готовых смесей для секвенирования

Ни для кого из нас не секрет, что даже при разбавлении готовой смеси для секвенирования многократно по сравнению с рекомендуемым протоколом, возможно проведение удачной реакции секвенирования. Мы предлагаем дополнительно приобрести буфер для секвенирования, для этих целей: буфер для секвенирования BrightDye/Bigdye ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/nimagen/bufer_dlya_reaktsii_sekvenirovaniya/ ) (может использоваться для постановки реакции как с BrightDye так и с Bigdye), буфер для секвенирования BrightDye ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/nimagen/bufer_dlya_reaktsii_sekvenirovaniya/ )(специально разработан для использования совместно с BrighDye).

Специальные добавки для улучшения качества реакции секвенирования

Специально для сложных образцов ДНК мы предлагаем воспользоваться нашей новинкой - добавкой к BigDye 3.1 для оптимизации секвенирования сложных образцов ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/nimagen/dobavki_dlya_uluchsheniya_kachestva_sekvenirovaniya/ ).
Также, мы рекомендуем другую нашу новинку:буфер для оптимизации работы BigDye 3.1 X64 ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/nimagen/dobavki_dlya_uluchsheniya_kachestva_sekvenirovaniya/ ): он имеет ионную силу, аналогичную ионной силе BigDye 3.1 и 1.1. Данная добавка (с разбавлением в 64 раза) увеличивает активность полимеризации и скорость полимеризации в 4 раза. Улучшает соотношение высоты пиков в результатах секвенирования.

Очистка реакционной смеси после реакции с терминирующими дидезоксинуклеотидами

После проведения реакции с терминирующими дидезоксинуклеотидами, очень важно правильно провести очистку, перед проведением анализа образца на платформе ABI. Из нашего опыта общения с клиентами хочется акцентировать внимание на этом этапе - грамотная очистка образца поможет избежать многих проблем и обеспечит вас хорошими результатами. Мы предлагаем 2 варианта очистки, каждый из которых протестирован для очистки перед секвенированием по Сэнгеру.

Набор для очистки реакционной смеси D-Pure Dye ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/nimagen/ochistka_reaktsionnoy_smesi_posle_sekvenirovaniya/?brand= ) специально был разработан для данного этапа проведения секвенирования. При очистке используются магнитные частицы, и позволит очистить образец ДНК без этапа центрифугирования и фильтрации. Каждый компонент был оптимизирован для удаления солей и не использованных в реакции полимеризации дидезоксинуклеотидов.

В качестве альтернативы мы хотим предложить набор для энзиматической очистки ПЦР-смеси, который также специально предназначен для очистки перед проведением секвенирования - это [url=] набор ферментов для быстрой очистки реакционной ПЦР реакции [/url=http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/reaktivy_dlya_modifikatsii_nk/nukleazy/fermenty_dlya_bystroy_ochistki_reaktsionnoy_ptsr_reaktsii/] от New England Biolabs. Входящие в состав смеси ферменты - экзонуклеаза I и щелочная фосфатаза обеспечивают недорогую очистку ПЦР-смеси за 15 минут. Набор специально предназначен для исследователей, которые хотят отойти от традиционной очистки при помощи колонок, экстракции и осаждения.

Если вы привыкли использовать для очистки AMPure XP, Agencourt Beckman, и не хотите менять методику очистки - мы можем предложить уменьшить стоимость очистки, не меняя протокола при помощи набора для очистки ПЦР-реакции AmpliClean ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/nimagen/ochistka_reaktsionnoy_smesi_posle_sekvenirovaniya/ )

Полимеры для секвенирования на различных платформах и буферные растворы для электрофореза

Для проведения непосредственно капиллярного электрофореза вам потребуется заполнить капилляры вашего приборы полимером определенного типа. Между собой полимеры отличаются процентным содержанием диметилакриламида. Например, мы предлагаем полимерные денатурирующие разделительные матрицы (полимеры) для всех актуальных платформ ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/nimagen/polimery/?brand= ): NanoPOP 4 для 3130, NanoPOP 4 для 310/3100, NanoPOP 6 для 3130, NanoPOP 6 для 310/3100, NanoPOP 7 для 3130, NanoPOP 7 для 3500, NanoPOP 7 для 3730.
Буферные растворы представлены буферами с ЭДТА CE10X, с ЭДТА NanoPOP 10X, NanoPOP 1X, ЭДТА CE10X для 3500.
Все полимеры являются полными аналогами полимеров серии POP, и были протестированы ведущими научными центрами Москвы и Новосибирска (данные не представлены). Отдельно отмечалось, что полимеры серии NanoPOP позволяют разделять пики в составе гомополимеров после 900 п.о. Пользователи имеют возможность начать использовать новый полимер для своего анализатора, не меняя существующий рабочий модуль и с использованием стандартного протокола и методики. Нет необходимости в новой спектральной калибровке приборов.

Вы можете использовать новую матрицу для улучшения пропускной способности и разрешения Вашего 3100 Genetic Analyzer, не затрачивая средств на изменение других параметров анализатора.

Весь перечень доступных полимеров и буферных растворов для электрофореза с ценами можно посмотреть здесь ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/nimagen/polimery/?brand= ).

Очистка капилляров

Мы рады также представить средство для очистки капилляров Care ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/nimagen/ochistka_kapillyarov/ ), который помогут вас увеличить срок службы капилляров и улучшить качество получаемых результатов. Раствор для регенерации внутренней поверхности капилляров был успешно использован с ABI 310, 3100, 3130Xl и 3730XL.

Кроме перечисленных выше реактивов, доступны также стандарты длин ДНК (красный, оранжевый, двойной) и раствор формамида (для 3730, 3130, 3100, 310).

Мы искренне надеемся, что информация, которую мы сегодня представили вашему вниманию будет полезна и позволит удешевить, убыстрить и упростить проведение ежедневной работы в лаборатории.



SkyGen 24.02.2015 12:23
Буферы от New England Biolabs: инструкция к действию

Прикреплённое изображение

В сегодняшнем обзоре мы постараемся помочь Вам ориентироваться огромном разнообразии буферных растворов, и как наиболее эффективно и умно использовать возможности, которые нам дарят последние разработки в области оптимизации постановки реакций.

Все мы пользуемся буферными растворами каждый день, при постановке реакций со всеми типами ферментов. Мы понимаем, что раствор, содержащий определенные вещества и ионы, а также обладающий определенным значением рН создает идеальные условия для работы нашего фермента. Периодически, производители заменяют цифру после названия нашего буфера, с 1 на 2 или с 3 на 5. Мы принимаем эти изменения, и пытаемся не перепутать пробирку, когда ставим следующий эксперимент. Однако, за этими маленькими изменениями, стоит огромная и кропотливая работа исследователей, в том числе и компании New England Biolabs, которые постепенно стараются сделать нашу ежедневную работу проще.

Прежде всего, давайте остановимся на тех случаях, когда к одному ферменту предлагается на выбор несколько типов буферных растворов. Все поставляемые ферменты прибывают к потребителю вместе с буферным раствором, и как правило, тип буфера выбирается уже на момент заказа.

Буферные растворы для Taq ДНК-полимеразы

NEB предлагает три различных буферных раствора для использования с Taq ДНК-полимеразой. Каждый из них может поставляться как с Mg2+, так и без.

Это стандартный Taq буферный раствор: не содержит детергенты и создан для того, чтобы подходить для всех существующих протоколов. Поставляется с ДНК-полимеразой со стандартным буфером и ДНК-полимеразой со стандартным буфером (без Mg2+).

Другой разновидностью буфера является ThermoPol® ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/bufery_dlya_dnk-polimeraz/bufer_thermopol_dlya_termofilnyh_polimeraz/ ), который был создан для оптимизации выхода и специфичности ДНК-полимераз.

Поставляется с ДНК-полимеразой Taq с буфером ThermoPol™ ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/taq_dnk-polimeraza_so_standartnym_taq_buferom/ ) и ДНК-полимеразой Taq с ThermoPol™ II (без Mg2+) ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/taq_dnk-polimeraza_so_standartnym_buferom_thermopol_ii_ne_sodergit_mg/ ).

И наконец, предлагается специальный буферный раствор ThermoPol (свободный от детергентов) для специальных задач.
Все данные буферные растворы могут также быть использованы и с некоторыми другими термофильными ДНК-полимеразами.

Буферные растворы для использования с OneTaq ДНК-полимеразой

Для образцов с различным содержанием GС, предлагается использовать различные буферные растворы.
Для образцов с <50% GC рекомендуется стандартный буферный раствор OneTaq ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/bufery_dlya_dnk-polimeraz/bufer_dlya_onetaq_dnk-polimerazy/ ). При 50–65% GC также рекомендуется стандартный OneTaq буферный раствор. Однако при сложных ампликонах возможно использовать буферный раствор OneTaq для GC-богатых ампликонов ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/bufery_dlya_dnk-polimeraz/bufer_dlya_onetaq_dnk-polimerazy/ ). В случае, если >65% GC, рекомендуется OneTaq для GC-богатых ампликонов, с добавкой 10–20% OneTaq Enhancer для образцов с высоким содержанием GС .

Основные буферные растворы для эндонуклеаз рестрикции от New England Biolabs

К каждой эндонуклеазе рестрикции поставляется один из 4 буферных растворов, помеченный каждый своим цветом, чтобы обеспечить максимальную активность фермента. Случается, что некоторые ферменты требуют специфические условия, в таком случае поставляется специальный буфер. В таблице ( https://www.neb.com/tools-and-resources/usage-guidelines/nebuffer-performance-chart-with-restriction-enzymes ) вы сможете найти, какой буфер и при какой температуре будет находиться в оптимальных условиях.

Для удобства пользователей, БСА был включен во все буферные растворы от NEB для рестриктаз, и не требует дополнительного добавления.

Вот здесь ( https://www.neb.com/tools-and-resources/usage-guidelines/nebuffer-comparison-chart ) представлено сравнение химического состава основных буферных растворов от New England Biolabs. Это NEBuffer 1 ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/endonukleazy_restriktsii/neb-bufery/neb-bufer_1_geltyy/ ), NEBuffer 1.1 ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/endonukleazy_restriktsii/neb-bufery/neb-bufer_11/ ), NEBBuffer 2 ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/endonukleazy_restriktsii/neb-bufery/neb-bufer_2_siniy/ ), NEBBuffer 2.1 ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/endonukleazy_restriktsii/neb-bufery/neb-bufer_21/ ), NEBBuffer 3 ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/endonukleazy_restriktsii/neb-bufery/neb-bufer_3_krasnyy/ ), NEBBuffer 3.1 ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/endonukleazy_restriktsii/neb-bufery/neb-bufer_31/ ) и CutSmart Buffer ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/endonukleazy_restriktsii/neb-bufery/neb-bufer_cutsmart/ ).

Как видно, использование ограниченного числа буферных растворов позволяет экономить время, и проводить разрезание образца ДНК несколькими рестриктазами не последовательно, теряя время на очистку продуктов, а в одной реакционной смеси. Вот тут ( https://www.neb.com/tools-and-resources/interactive-tools/double-digest-finder ) представлен удобный инструмент, каким образом подобрать рестриктазы, чтобы они были совместимы в одном буферном растворе.

В то же время, можно упросить задачу подборки ферментов, если помнить, что все высокоточные (HF) рестриктазы активны в одном буферном растворе CutSmart.

[/b]Активность эндонуклеаз рестрикции в реакционных растворах ДНК-полимераз [/b]

Q5® ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/q5_hf_dnk-polimeraza/ ), Taq ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/taq_dnk-polimeraza_so_standartnym_buferom_ne_sodergit_mg/ ) и Phusion ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/phusion_hf_dnk-polimeraza/ )[/b]
Часто случается, что ПЦР-продукт после амплификации должен подвергнуться действию эндонуклеаз рестрикции. Для удобства пользователей, на сегодняшний день существует возможность разрезать образец ДНК при помощи эндонуклеаз рестрикции сразу после ПЦР реакции, без очистки реакционной смеси. В таблице ( https://www.neb.com/tools-and-resources/usage-guidelines/activity-of-restriction-enzymes-in-a-q5-taq-or-phusion-pcr-mix ) представлена степень активности (в процентах) эндонуклеаз в ПЦР реакционных смесях.

Например, высокоточная рестриктаза BamHI-HF® ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/endonukleazy_restriktsii/high_fidelity_hf_fermenty_restriktsii/bamhi-hf/#item19573 ) на 100% активна в ПЦР-смеси полимеразы Taq (как в стандартном буфере ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/taq_dnk-polimeraza_so_standartnym_taq_buferom/ ), так и в буфере Thermopol ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/taq_dnk-polimeraza_s_buferom_thermopol/ )). Но при этом неактивна в буфере
полимеразы Phusion ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/phusion_hf_dnk-polimeraza/ ), и на 50% активна в буфере полимеразы LongAmp ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/longamp_taq_dnk-polimeraza/ ).
При составлении данной таблицы, 5 е.а. рестриктазы инкубировали в течение 1 часа при оптимальной температуре, в ПЦР-смеси, содержащей 1 мкг ДНК и 1 е.а. ДНК-полимеразы в 50 мкл реакционной смеси с концентрацией соответствующего буферного раствора 1X, и добавленными dNTPs (200 µM). Активность ферментов проверяли при помощи электрофореза.
Следует, однако, иметь в виду, что полимераза остается активной и может изменять концы фрагментов ДНК после их разрезания, вызывая последующее лигирование. Праймеры, содержащие сайты узнавания могут ингибировать процесс разрезания, а использование рестриктаз в условиях не абсолютно оптимальных может вызвать увеличение звездчатой активности. Если наблюдались серьезные отклонения результатов, рекомендуется очистить ДНК. Также, в некоторых случаях добавление х1 буферного раствора самой рестриктазы позволяет зачастую улучить качество результатов.

CutSmart буфер

Как уже было упомянуто выше, в ряду буферных растворов для рестриктаз от NEB появился буфер CutSmart ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/endonukleazy_restriktsii/neb-bufery/neb-bufer_cutsmart/#item22951 ), позволяющий проводить реакции со всеми HF ферментами в одном растворе. Более чем 200 рестриктаз сегодня на 100% активны в данном буферном растворе. Также множесто ДНК-модифицирующих ферментов на 100% активны в данном буфере, и таким образом, избавляют от дополнительного этапа очистки при комбинировании реакций.

Активность ДНК-модифицирующих ферментов в CutSmart буферном растворе

В таблице ( https://www.neb.com/tools-and-resources/usage-guidelines/activity-of-dna-modifying-enzymes-in-cutsmart-buffer ) показана активность таких ферментов в CutSmart буферном растворе. Таким образом, видно, что щелочная фосфатаза ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/reaktivy_dlya_modifikatsii_nk/fosfatazy/shchelochnaya_fosfataza/#item18728 ), Т4 ДНК-лигаза ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/reaktivy_dlya_modifikatsii_nk/ligazy/t4_dnk-ligaza/#item18608 ), Т4 полинуклеотидкиназа ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/reaktivy_dlya_modifikatsii_nk/kinazy/t4_polinukleotidkinaza/#item18606 ) и многие другие прекрасно комбинируются с [url=http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/endonukleazy_restriktsii/neb-bufery/neb-bufer_cutsmart/#item22951] СutSmart буфером. /url].

Буферы для разбавления рестриктаз перед их использованием в реакции

Специально для разбавления рестриктаз перед использованием их в реакции, представлены буферы для разбавления A, B и C ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/endonukleazy_restriktsii/bufery_dlya_razvedeniya/ ). Мы рекомендуем разбавлять ферменты непосредственно перед использованием, до концентрации по крайней мере 1,000 е.а./мл. Таблица соответствия буферов для разбавления рестриктазам представлена здесь ( https://www.neb.com/tools-and-resources/usage-guidelines/restriction-enzyme-diluent-buffer-compatibility ). Следует иметь в виду, что при комбинации разрезания с термофильными полимеразами следует использовать другие растворы для разбавления.



SkyGen 24.02.2015 12:50
Очистка нуклеиновых кислот: многообразие методов и подходов

Прикреплённое изображение

На сегодняшний день, множество решений для очистки и выделения ДНК представлены на рынке, какой из методов выбрать - это решение, которое принимает каждый индивидуальный исследователь. Методы отличаются друг от друга сферой применения, подходом, задачей, и конечно же ценой. Иногда, исследователям удобнее использовать метод, который для них более привычен, однако следует принять во внимание, что каждый день появляются все более прогрессивные новинки, которые могут существенно помочь и ускорить все процессы в лаборатории.
Сегодня мы постараемся систематизировать наиболее распространенные методы выделения и очистки РНК и ДНК, и рассказать в целом для чего он могут применяться, и, конечно же, предложить отдельные конкретные продукты, которые вы сможете начать использовать уже в ближайшие недели!
В наступившем году, мы приняли решение расширить ассортимент продуктов для выделения и очистки нуклеиновых кислот, для того чтобы помочь нашим клиентам в их ежедневной работе.
До сегодняшнего дня мы предлагали лишь решения по колоночному выделению: наборы для выделения геномной ДНК ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/bioline/kolonochnoe_vydelenie_i_ochistka_dnk/nabory_dlya_vydeleniya_genomnoy_dnk/ ), ДНК из образцов крови ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/bioline/kolonochnoe_vydelenie_i_ochistka_dnk/nabory_dlya_vydeleniya_dnk_iz_krovi/ ), плазмидной ДНК ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/bioline/kolonochnoe_vydelenie_i_ochistka_dnk/nabory_dlya_vydeleniya_plazmidnoy_dnk/ ), ДНК из агарозного геля и из ПЦР продуктов ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/bioline/kolonochnoe_vydelenie_i_ochistka_dnk/nabory_dlya_vydeleniya_dnk_iz_produktov_ptsr_i_agaroznogo_gelya/ ).
На сегодняшний день, множество решений для очистки и выделения ДНК представлены на рынке, какой из методов выбрать - это решение, которое принимает каждый индивидуальный исследователь. Методы отличаются друг от друга сферой применения, подходом, задачей, и конечно же ценой. Иногда, исследователям удобнее использовать метод, который для них более привычен, однако следует принять во внимание, что каждый день появляются все более прогрессивные новинки, которые могут существенно помочь и ускорить все процессы в лаборатории.
Сегодня мы постараемся систематизировать и объяснить наиболее распространенные методы выделения и очистки РНК и ДНК, и рассказать в целом для чего он могут применяться, и, конечно же, предложить отдельные конкретные продукты, которые вы сможете начать использовать уже в ближайшие недели!

Колоночное выделение

Метод колоночного выделения использует способность ДНК и РНК адгезироваться к поверхности материала silica в присутствии хаотропных ионов, и легко смываться в их отсутствии. Данный метод пришел из органической химии, где на первых этапах набивались стеклянные колонки различными материалами, в том числе silica, потом ДНК и РНК смывались, и далее колонка разбиралась и набивалась заново. Чтобы исключить эти трудоемкие этапы, было предложено использовать одноразовые пластиковые колонки, уже с прослойкой silica-мембраны, которые идеально подходят по размеру к обычным пробиркам эппендорф на 1,5 и 2 мл.
Таким образом, приобретая набор для колоночного выделения - вы получаете определенное количество готовых колонок, в них вы добавляете ваш образец, откуда будет происходить выделение ДНК/РНК, в специальном буфере, в условиях которого будет происходить связывание ДНК/РНК c поверхностью мембраны, вставляете пробирку, куда будет собираться свободная от ДНК/РНК жидкость, и центрифугируете. Далее, мембрана промывается - чтобы удалить все ненужные примеси и вещества. После этого, добавляется буфер для смывки нуклеиновых кислот, которые смываются во время центрифугирования в специально подготовленную пробирку. Казалось бы, процесс достаточно прост, почему же существует такое разнообразие наборов для выделения? В том числе и наборы для колоночного выделения ISOLATE II ( http://www.skygen.com/proizvoditeli/reaktivy/bioline/catalog/ ). Основные различия происходят на этапе подготовки образца, содержащего нуклеиновые кислоты. Иногда проведения лизиса не требуется (в случае наборов для выделения ДНК из ПЦР продуктов ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/bioline/kolonochnoe_vydelenie_i_ochistka_dnk/nabory_dlya_vydeleniya_dnk_iz_produktov_ptsr_i_agaroznogo_gelya/ )), но требуется экстракция (как в случае выделения из агарозного геля ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/bioline/kolonochnoe_vydelenie_i_ochistka_dnk/nabory_dlya_vydeleniya_dnk_iz_produktov_ptsr_i_agaroznogo_gelya/ )). Требуется лизис бактерий ( набор для выделения плазмидной ДНК ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/bioline/kolonochnoe_vydelenie_i_ochistka_dnk/nabory_dlya_vydeleniya_plazmidnoy_dnk/ )), лизис тканей ( набор для выделения геномной ДНК ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/bioline/kolonochnoe_vydelenie_i_ochistka_dnk/nabory_dlya_vydeleniya_genomnoy_dnk/ )). В случае выделения ДНК из крови, существует как протокол выделения ДНК из клеток крови, так и из сыворотки (например, если требуется идентифицировать ДНК вирусов), все это обеспечивает набор для выделения ДНК из крови ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/bioline/kolonochnoe_vydelenie_i_ochistka_dnk/nabory_dlya_vydeleniya_dnk_iz_krovi/ ). Выделение ДНК из крови может быть осложнено добавками к образцам крови различных реактивов для консервации крови, для чего компания Bioline разработала специальные решения.

Энзиматическая очистка ПЦР-продуктов

Несмотря на то, что колоночное выделение - хорошее решение для получения чистых ДНК и РНК, но иногда нужно более дешевое и быстрое решение для специальных нужд. Поэтому, компанией New England Biolabs было предложено новое решение для очистки ПЦР реакции ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/reaktivy_dlya_modifikatsii_nk/nukleazy/fermenty_dlya_bystroy_ochistki_reaktsionnoy_ptsr_reaktsii/ )при помощи смеси энзимов. Смесь щелочной фосфатазы и эндонуклеазы VIII удаляет все dNTPи непрореагировавшие праймеры, и, если ДНК/РНК, поступившая в ПЦР реакцию не была загрязнена другими примесями, через 15 минут вы получаете готовый образец для дальнейшего использования для секвенирования по Сэнгеру или NGS или для любого другого назначения, без проведения каких-либо других этапов. Быстрый протокол (время проведения очистки в два раза меньше других аналогов на рынке) низкая стоимость одного выделения, подкрепленные традиционным качеством всех продуктов от New England Biolabs позволят этому набору завоевать сердца множества исследователей.

Очистка ДНК при помощи магнитных частиц

Одним из самых прогрессивных и наиболее совершенных методов очистки ДНК, существующих на сегодняшний день, является очистка ДНК при помощи магнитных частиц. Все чрезвычайно просто - в образец добавляется взвесь магнитных частиц, ДНК адгезируется к ним, потому пробирка ставится в магнитный штатив, магнитные частицы собираются на стенке пробирки, супернатант собирается и удаляется. Потом для промывки частицы ресуспензируются, опять собираются на стенке. На последнем этапе ДНК смывается с магнитных частиц, частицы собираются на стенке, а чистый раствор ДНК отбирается для дальнейших исследований. Мы предлагаем набор Ampliclean для очистки ПЦР-продуктов ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/nimagen/ochistka_reaktsionnoy_smesi_posle_sekvenirovaniya/ )и набор для очистки реакционной смеси D-Pure Dye Terminator ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/nimagen/ochistka_reaktsionnoy_smesi_posle_sekvenirovaniya/ ) (специально для использования перед секвенированием по Сэнгеру). Плюсы очевидны: ультра чистота продукта, быстрота, простота. Из минусов мы должны отметить более высокую цену в пересчете на реакцию, а также отсутствие других реагентов, если выделение происходит непосредственно из ткани, образца крови или бактериальной культуры.
Так как для проведения очистки на магнитных частица вам понадобятся специальные штативы, содержащие встроенные магниты, например штативы для микропробирок объемом 1.5 мл для магнитного разделения ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/ekspressiya_i_ochistka_belkov/magnitnye_nositeli_i_shtativy/ )и штатив для 96-луночного планшета для магнитного разделения ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/ekspressiya_i_ochistka_belkov/magnitnye_nositeli_i_shtativy/shtativ_dlya_96-lunochnogo_plansheta_dlya_magnitnogo_razdeleniya/ )от New England Biolabs.

Специальные предложения от New England Biolabs для очистки РНК, обогащения мРНК и избавления от рибосомальной РНК

Специально для всех, кто выделяет РНК перед проведением реакции обратной транскрипции, чтобы далее проводить секвенирование или оценку при помощи реал-тайм или классической ПЦР - New England Biolabs предлагает набор для выделения РНК при помощи магнитных частиц, из клеточных культур и тканей, без использования органических реагентов и фенола - набор для магнитной экстракции мРНК ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/reaktivy_dlya_raboty_s_rnk/vydelenie_i_detektsiya_rnk/nabor_dlya_magnitnoy_ekstraktsii_mrnk/ )а также набор PolyA Spin для экстракции мРНК ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/reaktivy_dlya_raboty_s_rnk/vydelenie_i_detektsiya_rnk/nabor_polya_spin_dlya_ekstraktsii_mrnk/ )из образцов общей РНК при помощи аффинной хроматографии.
В то же время - специально чтобы увеличить эффективность секвенирования образцов РНК, мы рады представить набор NEBNext для избавления от рибосомальной РНК ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/reaktivy_dlya_sekvenirovaniya_sleduyushchego_pokoleniya/reaktivy_dlya_sozdaniya_bibliotek_rnk/nabor_nebnext_dlya_izbavleniya_ot_ribosomalnoy_rnk_rnk_cheloveka_myshey_krys/ )от New England Biolabs.

Выделение ДНК и двуцепоченой РНК при помощи соосаждения

Другой вариацией использования силика-материалов для очистки нуклеиновых кислот является SureClean Plus ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/bioline/vydelenie_i_ochistka_nukleinovyh_kislot/reaktiv_sureclean_plus_dlya_ochistki_nukleinovyh_kislot_osagdeniem/ )для очистки нуклеиновых кислот, представленный компанией Bioline. Чрезвычайно простой и быстрый протокол позволит вам сэкономить время и деньги, а возможность дополнительно использовать розовый краситель упростит визуализацию осадка.
Фракционное разделение РНК, ДНК и протеинов при помощи экстракции
Если начальным образцом вам служит ткань, клетки или культура, из которой требуется отдельно получить ДНК, РНК протеины - то классической реактив TRIsure ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/bioline/vydelenie_i_ochistka_nukleinovyh_kislot/reaktiv_trisure_dlya_fraktsionnogo_razdeleniya_nukleinovyh_kislot_i_proteinov/ )для фракционного разделения нуклеиновых кислот и протеинов от Bioline - ваш выбор!

Выделение ДНК при помощи лизиса при нагревании в присутствии полимерных материалов

Мы не можем обойти вниманием очень интересной решение от Nimagen: реактив GenePurgeDirect для выделения ДНК и РНК, для проведения протокола выделения ДНК и РНК из крови, бактериальных культур, тканей в парафине, образцов биопсии, хвостов мышей, растений и инфекционных агентов (например MTB, HIV) вам потребуется амплификатор или микроволновая печь.
GenePurgeDirect® состоит из полимерных материалов, которые обеспечивают быстрое извлечение нуклеиновых кислот из клеток в форме, которую можно использовать для ПЦР. Ингибиторы ПЦР, высвобождающие во время лизиса и другие вещества, которые могут принять участие в реакции ПЦР, сегрегируются с полимерным материалом, и супернатант, содержащий нуклеинвые кислоты, может быть использован напрямую для ПЦР. Протокол выделения занимает до 10 минут.

Заключение

Чтобы не запутаться среди большого разнообразия продуктов на рынке, хочется посоветовать две важных вещи, которые следует принять во внимание: имейте в виду, что стоимость следует оценивать исходя из цены в пересчете на одну вашу реакцию (с вашим объемом реагента), и что чем больше содержится количества реакций/объема в упаковке, тем дешевле выйдет одна очистка. Мы надеемся, что информация в нашем обзоре поможет удачно выбрать реактив для очистки и оптимизировать исследования.



SkyGen 24.02.2015 14:10
Расширение линейки продуктов от английской компании Bioline

Прикреплённое изображение

Мы с удовольствием сообщаем, что в Новый 2015 год компания СкайДжин входит с новыми продуктами для Вашей лаборатории!
В первом квартале 2015 мы планируем обеспечить Вашу лабораторию реактивами для реал-тайм ПЦР с красителем SYBR Green по крайне доступным ценам. При этом вы сможете использовать Ваш ПЦР-амплификатор любой модели, и проводить любые требуемые вариации экспериментов. Реакцию возможно провести как с использованием референсного красителя ROX, так и без, в то же время возможно проводить эксперимент как с использованием зондов, так и без. Вы сможете использовать в качестве стартового материала как ДНК так и РНК. При этом новейшие технологии позволяют провести реакцию обратной транскрипции РНК и реал-тайм ПЦР кДНК в один этап.
Одновременно, мы расширяем линейку наборов для колоночного выделения и очистки ДНК, РНК и протеинов.
Количественная ПЦР - одно из самых мощных и чувствительных методик для анализа генов, доступных на сегодняшний день. Этот метод принят на вооружение практически во всех лабораториях мира. Его эффективность, особенно для амплификации и определения малых количеств ДНК и РНК, позволила изменить представление о многих типах диагностических исследований. Наиболее важными областями применения является анализ генной экспрессии и детекция патогенов. Другие важные задачи, которые позволяет решать количественная ПЦР - оценка количества мРНК и микроРНК, поиск биомаркеров, оценка количества микробов, выявление вероятности раковых заболеваний.
Итак, мы предлагаем наборы для проведения реал-тайм ПЦР ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/bioline/nabor_dlya_provedeniya_ptsr_v_realnom_vremeni/ ) во всех вариантах которые используются на сегодняшний день. Давайте коротко остановимся на вариациях ПЦР.

Реал-тайм ПЦР с красителем SYBR Green I

Для проведения реал-тайм ПЦР мы предлагаем линейку наборов от Bioline: наборы SensiFAST и SensiMix SYBR ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/bioline/nabor_dlya_provedeniya_ptsr_v_realnom_vremeni/ ). SensiFAST - это последнее поколение разработок компании Bioline. Входящие в состав смеси антитела реализуют принцип HotStart во время проведения реакции ПЦР. Характеристики набора позволяют успешно использовать SensiFAST в клинических лабораториях, для определения чрезвычайно малых количеств генов или мультиплексирования.
В состав наборов SensiMix SYBR - предыдущего поколения наборов для проведения ПЦР, входит другой буферный раствор по сравнению с SensiFAST - но эти наборы, обладая все таким же высоким качеством - порадуют вас своей стоимостью.
В состав каждой линейки входят наборы, содержащие высокую концентрацию референсного красителя ROX набор для проведения реал-тайм ПЦР SensiFAST SYBR Hi-ROX ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/bioline/nabor_dlya_provedeniya_ptsr_v_realnom_vremeni/nabor_dlya_provedeniya_ptsr_v_realnom_vremeni_sensifast_sybr_hi-rox/ ), набор для проведения реал-тайм ПЦР SensiMix SYBR Hi-ROX ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/bioline/nabor_dlya_provedeniya_ptsr_v_realnom_vremeni/nabor_dlya_provedeniya_ptsr_v_realnom_vremeni_sensimix_sybr_hi-rox/ )), среднюю концентрацию набор для проведения реал-тайм ПЦР SensiFAST SYBR Lo-ROX ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/bioline/nabor_dlya_provedeniya_ptsr_v_realnom_vremeni/nabor_dlya_provedeniya_ptsr_v_realnom_vremeni_sensifast_sybr_lo-rox/ ), набор для проведения реал-тайм ПЦР SensiMix SYBR Lo-ROX ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/bioline/nabor_dlya_provedeniya_ptsr_v_realnom_vremeni/nabor_dlya_provedeniya_ptsr_v_realnom_vremeni_sensimix_sybr_lo-rox/ )), и не содержащие референсного красителя совсем набор для проведения реал-тайм ПЦР SensiFAST SYBR No-ROX ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/bioline/nabor_dlya_provedeniya_ptsr_v_realnom_vremeni/nabor_dlya_provedeniya_ptsr_v_realnom_vremeni_sensifast_sybr_no-rox/ ), набор для проведения реал-тайм ПЦР SensiMix SYBR No-ROX ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/bioline/nabor_dlya_provedeniya_ptsr_v_realnom_vremeni/nabor_dlya_provedeniya_ptsr_v_realnom_vremeni_sensimix_sybr_no-rox/ )). В то же самое время, есть наборы, где кроме SYBR Green I также используется флуоресцеин набор для реал-тайм ПЦР SensiFAST SYBR&флуоресцеин ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/bioline/nabor_dlya_provedeniya_ptsr_v_realnom_vremeni/nabor_dlya_provedeniya_ptsr_v_realnom_vremeni_sensifast_sybrifluorestsein/ ), набор для реал-тайм ПЦР SensiMix SYBR&флуоресцеин ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/bioline/nabor_dlya_provedeniya_ptsr_v_realnom_vremeni/nabor_dlya_provedeniya_ptsr_v_realnom_vremeni_sensimix_sybrifluorestsein/ )).
Наборы для проведения ПЦР в реальном времени SensiFAST были специально разработаны для использования при укороченном времени циклов во время амплификации. С другой стороны, система HotStart не позволяет реакции начаться до активации, и увеличенная скорость копирования ДНК ферментами, наряду с улучшенным составом буфера - все это в совокупности увеличивает воспроизводимость, надежность и производительность наборов для реал-тайм ПЦР.

Реал-тайм ПЦР с использованием зондов

Для проведения реал-тайм ПЦР с использованием зондов мы предлагаем линейку наборов от Bioline: наборы SensiFAST и SensiMix II SYBR.
Так же как при реал-тайм ПЦР без использования зондов, в состав каждой линейки входят наборы, содержащие высокую концентрацию референсного красителя ROX набор для реал-тайм ПЦР с зондами SensiMix II Hi-ROX ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/bioline/nabor_dlya_provedeniya_ptsr_v_realnom_vremeni_s_zondami/nabor_dlya_provedeniya_ptsr_v_realnom_vremeni_s_zondami_sensimix_ii_hi-rox/ ), набор для реал-тайм ПЦР с зондами SensiFAST Hi-ROX ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/bioline/nabor_dlya_provedeniya_ptsr_v_realnom_vremeni_s_zondami/nabor_dlya_provedeniya_ptsr_v_realnom_vremeni_s_zondami_sensifast_hi-rox/ )), низкую концентрацию референсного красителя ROX набор для реал-тайм ПЦР с зондами SensiMix II Lo-ROX ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/bioline/nabor_dlya_provedeniya_ptsr_v_realnom_vremeni_s_zondami/nabor_dlya_provedeniya_ptsr_v_realnom_vremeni_s_zondami_sensimix_ii_lo-rox/ ), набор для реал-тайм ПЦР с зондами SensiFAST Lo-ROX ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/bioline/nabor_dlya_provedeniya_ptsr_v_realnom_vremeni_s_zondami/nabor_dlya_provedeniya_ptsr_v_realnom_vremeni_s_zondami_sensifast_lo-rox/ )), не содержащие референсного красителя ROX набор для реал-тайм ПЦР с зондами SensiMix II No-ROX ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/bioline/nabor_dlya_provedeniya_ptsr_v_realnom_vremeni_s_zondami/nabor_dlya_provedeniya_ptsr_v_realnom_vremeni_s_zondami_sensimix_ii_no-rox/ ), набор для реал-тайм ПЦР с зондами SensiFAST No-ROX ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/bioline/nabor_dlya_provedeniya_ptsr_v_realnom_vremeni_s_zondami/nabor_dlya_provedeniya_ptsr_v_realnom_vremeni_s_zondami_sensifast_no-rox/ )).

Реал-тайм ПЦР кДНК и обратная транскрипция образцов РНК в один этап: технология One-Step от Bioline

Новые разработки в области химии буферов позволили объединить этап обратной транскрипции с образцов РНК и этап количественной ПЦР образца кДНК. Таким образом, возможно использовать этот метод при работе с образцами РНК как для реал-тайм ПЦР без использования зондов набор для реал-тайм ПЦР образцов РНК SensiFAST SYBR No-ROX ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/bioline/nabor_dlya_provedeniya_ptsr_v_realnom_vremeni_s_obratnoy_transkriptsiey_one-step/ ), набор для реал-тайм ПЦР образцов РНК SensiFAST SYBR Hi-ROX ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/bioline/nabor_dlya_provedeniya_ptsr_v_realnom_vremeni_s_obratnoy_transkriptsiey_one-step/ ), набор для реал-тайм ПЦР образцов РНК SensiFAST SYBR Lo-ROX ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/bioline/nabor_dlya_provedeniya_ptsr_v_realnom_vremeni_s_obratnoy_transkriptsiey_one-step/ ), набор для реал-тайм ПЦР образцов РНК SensiFAST SYBR&флуоресцеин ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/bioline/nabor_dlya_provedeniya_ptsr_v_realnom_vremeni_s_obratnoy_transkriptsiey_one-step/ )), так и с использованием зондов набор для реал-тайм ПЦР образцов РНК с зондами SensiFAST SYBR No-ROX ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/bioline/nabor_dlya_provedeniya_ptsr_v_realnom_vremeni_s_obratnoy_transkriptsiey_s_zondami_one-step/ ), набор для реал-тайм ПЦР образцов РНК с зондами SensiFAST SYBR Hi-ROX ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/bioline/nabor_dlya_provedeniya_ptsr_v_realnom_vremeni_s_obratnoy_transkriptsiey_s_zondami_one-step/ ), набор для реал-тайм ПЦР образцов РНК с зондами SensiFAST SYBR Lo-ROX) ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/bioline/nabor_dlya_provedeniya_ptsr_v_realnom_vremeni_s_obratnoy_transkriptsiey_s_zondami_one-step/ ).
Когда мы говорим о проведении реал-тайм ПЦР, чрезвычайно важным обстоятельством будет являться тип вашего реал-тайм амплификатора, в зависимости от марки которого и от задачи эксперимента, необходимо будет выбирать набор реагентов.
Наборы от Bioline позволяют проводить эксперименты с использованием всех популярных и стандартных амплификаторов: Applied Biosystems (7000, 7300, 7500. 7500 FAST, 7700, 7900, 7900HT, 7900HT FAST, StepOne, Stepone plus, ViiA7, QuantStudio), Cepheid (SmartCycler), Illumina (Eco), Thermo (Piko Real), Takara (Thermal Cycler Dice), Fludigm (BiomMark), Analytik Jena (qTOWER/qTOWER2), Qiagen (Corbett) (Rotor-Gene 3000, Rotor-Gene 6000, Rotor-Gen Q), Bio-Rad (iCycler, MyiQ, iQ5, Opticon, Opticon2, Chromo4, MiniOpticon, CFX96, CFX384), Roche (LightCycler 96, LightCycler 480, LightCycler Nano), Eppendorf (Mastercycler ep reallex, Mastercycler ep realplex 2S), Techne (Quantica, PrimeQ), BJS (Xxpress), Agilent (Stratagene) (MX4000P, MX3000P, MX3005P).
Кроме того, мы с удовольствием хотим сообщить, что в первом квартале 2015 года мы расширяем линейку продуктов для колоночного выделения нуклеиновых кислот ISOLATE II, среди новых продуктов: Набор для выделения микро РНК ISOLATE II, набор для выделения микро РНК из растений ISOLATE II, набор для выделения РНК/ДНК/белков ISOLATE II, набор для выделения РНК из биологических жидкостей ISOLATE II, набор для выделения РНК/ДНК из образцов в формальдегиде и парафине ISOLATE II.
Для консультаций по данным продуктам, пожалуйста, обращайтесь по электронному адресу info@skygen.com
Мы надеемся, что представленная в настоящем обзоре информация будет полезна, и позволит вывести ваши исследования на новый уровень, сэкономив ваши средства!



SkyGen 26.02.2015 15:12
Скидка 25% на пластик Sorenson всем держателям грантов!

Прикреплённое изображение

В эти предвесенние дни и до 31 марта, компания СкайДжин объявляет скидку в 25% всем держателям грантов РФФИ, ФАНО, РНФ, Минобр и Минпромторг на имеющийся в наличии пластик Sorenson.

При заказе, просто укажите, в рамках какого гранта будет производиться закупка, и мы предоставим Вам скидку!

Пожалуйста, уточняйте наличие интересующего Вас пластика по электронной почте info@skygen.com, или по телефонам +7 (495) 215 02 22, +7 (800) 333 12 26!



SkyGen 27.02.2015 15:22
Интерактивные Online инструменты от компании New England Biolabs

Прикреплённое изображение

New England Biolabs предлагает мобильное приложение на телефон NEB Tool и разнообразные интерактивные онлайн-инструменты. Таким образом, планирование эксперимента в современной лаборатории становится еще проще!
Мобильное приложение NEB ( http://‘‘https://www.neb.com/sitecore/content/nebsg/home/tools-and-resources/mobile-app" ) существует на английском языке для наиболее популярных платформ - iPhone и Android.

При помощи мобильного приложения NEBTools вы сможете:

Использовать Enzyme Finder для того, чтобы выбрать рестриктазу по категории и сайту узнавания.
Найти информация о каждом ферменте NEB
Отсортировать списки ферментов по желаемому признаку
Отправить найденные результаты на ваш email
Найти подходящий буферный раствор при планировании эксперимента с несколькими рестриктазами в одной реакционной смеси
Быстро и просто выбрать высокоточные и сберегающие время ферменты и готовые смеси
Спланировать ваш эксперимент и получить нужную информацию, в том числе о рестриктазах с помощью мобильного телефона, находясь вне лаборатории

Полный список доступных приложений на английском языке можно найти [url=‘‘https://www.neb.com/tools-and-resources/interactive-tools ">тут[/url], а ниже мы остановимся на каждом приложении подробнее.

1. Инструмент для картирования ДНК-последовательностей - DNAsequenceMap ( http://‘‘https://www.neb.com/tools-and-resources/interactive-tools/dna-sequences-and-maps-tool )

Используйте инструмент для картирования ДНК-последовательностей, чтобы найти и получить информацию о последовательности наиболее популярных плазмид, векторов вирусов и бактериофагов.

Информацию о последовательностях векторов плазмид, генетических картах вирусов и бактериофагов, из каталога New England Biolabs, вместе с таблицами расположения сайтов узнавания рестриктаз можно скачать виде pdf файлов. Последовательности находятся в формате FASTA и/или GenBank.

2. Для планирования эксперимента по клонированию воспользуйтесь NEBcloner™ ( http://‘‘http://nebcloner.neb.com/#!/ )

Если вы используете традиционные методы клонирования, используйте этот инструмент для того чтобы подобрать ферменты и протоколы, которые потребуются для каждого этапа клонировнаия (расщепление, модификация концов, лигирование, трансформация и др.).

3. Вам необходимо заменить одно или несколько оснований в последовательности - вам поможет NEBaseChanger ( http://‘‘http://nebasechanger.neb.com )

NEBaseChanger может быть использован для дизайна специфических праймеров, при планировании экспериментов по мутагенезу, который проводится с использованием, например Q5® набора для сайт-направленного мутагенеза ( http://‘‘http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/reaktivy_dlya_modifikatsii_nk/#item42875 ). Этот инструмент также подсчитает рекомендуемую температуру отжига на основании информации о праймерах, принимая в расчет несовпадающие пары оснований.

4. Инструмент для выбора ДНК-полимераз PCRSelector ( http://‘‘https://www.neb.com/tools-and-resources/interactive-tools/pcr-selection-tool )

Используйте PCRSelector для того, чтобы выбрать подходящую ДНК-полимеразу для планируемого ПЦР-эксперимента. Работаете ли вы с длинным или сложным ампликоном, GC-богатым или с образцом, представленным в единственном экземпляре, при помощи PCRSelector возможно подобрать правильную ДНК-полимеразу и ее формат.

5. Инструмент для подбора условий одновременного использования двух и более рестриктаз Double Digest Finder ( http://‘‘https://www.neb.com/tools-and-resources/interactive-tools/double-digest-finder )

Используйте этот инструмент для правильного подбора буферного раствора, при постановке реакции с использованием двух и более рестриктаз, чтобы сэкономить свое время, уменьшить звездчатую активность и уменьшить потери образца во время очистки.

6. Калькулятор температуры отжига праймеров TmCalculator ( http://‘‘http://tmcalculator.neb.com )

Используйте этот инструмент при создании протокола ПЦР для подсчета оптимальной температуры отжига праймеров для конкретного эксперимента. Введите в качестве исходных параметров название ДНК-полимеразы, концентрацию праймеров, и их последовательность. Получите в результате рекомендуемую температуру отжига праймеров.

7. Инструмент для планирования реакции с рестриктазами NEBCutter v.2 ( http://‘‘http://nc2.neb.com/NEBcutter2/ )

Введите свою исходную последовательность ДНК, и найдите все сайты узнавания для всех рестриктаз типа II и коммерчески доступных рестриктаз типа III, которые имеют лишь по одному сайту узнавания участок лишь один раз. Программа учитывает как все рестриктазы, доступные у New England Biolabs, так и другие ферменты.

Максимальный размер вводимого файла последовательности составляет 1 Мб, и максимальная длина последовательности - 300 тысяч оснований. Также программа посчитает частоту разрезания и чувствительность к степени метилирования.

8. Если вы используете наборы для лигирования Gibson Assembly ( http://‘‘http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/reaktivy_dlya_modifikatsii_nk/klonirovanie_i_mutagenez/nabor_master_mix_dlya_ptsr_gibson_assembly/" ) или NEBuilder ( http://‘‘http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/reaktivy_dlya_modifikatsii_nk/klonirovanie_i_mutagenez/gotovaya_smes_dlya_ligirovaniya_dnk_nebuilder_hifi/" ) от NEB - вам потребуется NEBuilder Assembly Tool ( http://‘‘http://nebuilder.neb.com/" )

NEBuilder&reg; Assembly Tool может быть использован для дизайна праймеров для проведения сборки при помощи [url=‘‘http://www.skygen.com/obzory/ metod_gibsona_dlya_effektivnoy_sshivki_bolshogo_kolichestva_dlinnyh_fragmentov_dvuhtsepopochechnyh_d
nk/"> метода Гибсона [/url], основываясь на введенной последовательности фрагментов, а также ДНК-полимеразы, которая должна использоваться для амплификации. Важно указать количество фрагментов, из которых должна производиться сборка, и тип фермента для ПЦР. Фрагменты могут быть удалены, перегруппированы. В результате вы получаете список требуемых праймеров, температуры отжига и финальную последовательность собираемого конструкта.

9. Найдите свой фермент с EnzymeFinder ( http://‘‘https://www.neb.com/tools-and-resources/interactive-tools/enzyme-finder" )
С использованием этого инструмента вы сможете найти эндонуклеазу рестрикции по имени, сайту узнавания, типу или степени перекрывания. Укажите свою последовательность, и программа укажет правильные ферменты для разрезания.


10. При помощи NEB Golden Gate Assembly Tool ( https://goldengate.neb.com/editor ) возможно автоматизировть in silico дизайн ДНК с использованием метода Golden Gate

При помощи данного инструмента вы сможете:
- импортировать последовательности в большом количестве форматов, выбрать фрагменты для сборки
- сделать автоматический дизайн праймеров для создания совмещаемых концов или с использованием существующих сайтов разрезания
- сделать дизайн подходящих праймеров и введения точечных мутаций

11. NEBioCalculator® ( http://‘‘http://nebiocalculator.neb.com/#!/" )
Используйте инструмент для подсчетов, и перевода единиц для ДНК и РНК. Возможно конвертировать массу в моли, перевести о.е. в концентрацию, разбавление и молярность.

12. База данных InBase ( http://»http://tools.neb.com/inbase/ )
Интеины являются последовательностями, которые разрушают кодирующий регион в гене хозяина. В отличие от интронов, интеины вырезаются послетрансляционно из предшественника протеина при помощи самокатализируемого механизма сплайсинга пртеинов. InBase описывает действие интеинов, включает в себя их список и их свойства. Возможно найти информацию о таких свойствах, как: прототип, эндонуклеазную активность, расположение вырезаемых участков, комментарии по сайту вставки, открывателей и ссылки на литературу.

13. База данных PolBase ( http://‘‘https://polbase.neb.com/ )
Polbase является хранилищем биохимических, генетической и структурной информации о ДНК-полимеразах.

14. База данных REBASE ( http://rebase.neb.com/rebase/ )
Используйте этот инструмент в качестве гида в постоянно-меняющемся мире рестриктаз. REBASE - это динамическая, постоянно обновляемая база данных рестриктаз и связанных с ними протеинов.

Мы надеемся, что использование данных программ существенно упростит работу в вашей лаборатории!



SkyGen 02.03.2015 15:06
Новые продукты для проведения реакции обратной транскрипции от New England Biolabs

Прикреплённое изображение

Сегодня мы рады представить всем исследователям, работающим с образцами РНК два абсолютно новых продукта для проведения реакции обратной транскрипции. Это набор для RT-PCR OneTaq One-Step ( http://''http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/reaktivy_dlya_sinteza_kdnk_i_ptsr_s_obratnoy_transkriptsiey/nabor_onetaq_one-step_dlya_ptsr_s_obratnoy_transkriptsiey/ ) и обратная транскриптаза WarmStart RTx ( http://''http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/reaktivy_dlya_sinteza_kdnk_i_ptsr_s_obratnoy_transkriptsiey/warmstart_rtx_obratnaya_transkriptaza/ ).

В условиях динамичных изменений и постоянного развития методов работы с РНК, исследователи компании New England Biolabs обеспечивают своих клиентов новыми инструментами, которые позволят оптимизировать проведение реакций и ускорить ежедневный протокол. В данном случае, появляется возможность проводить реакцию обратной транскрипции и ПЦР полученной кДНК в один этап при помощи набора RT-PCR OneTaq One-Step ( http://''http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/reaktivy_dlya_sinteza_kdnk_i_ptsr_s_obratnoy_transkriptsiey/nabor_onetaq_one-step_dlya_ptsr_s_obratnoy_transkriptsiey/ ). С другой стороны, второй продукт - обратная транскриптаза WarmStart RTx ( http://''http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/reaktivy_dlya_sinteza_kdnk_i_ptsr_s_obratnoy_transkriptsiey/warmstart_rtx_obratnaya_transkriptaza/ )- это первая и единственная на рынке обратная транскриптаза, активируемая при повышении температуры (выше 40&degС).

Проведение реакции обратной транскрипции и ПЦР полученной кДНК

Если вы работаете в лаборатории с образцами РНК, зачастую, после этапа проведения реакции обратной транскрипции следующим этапом является ПЦР полученной кДНК. Таким образом, возможность объединить эти два этапа и провести их в один этап, с использованием ген-специфичных праймеров упростит протокол и ускорит время получения результата исследования.
Набор для RT-PCR OneTaq One-Step ( http://''http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/reaktivy_dlya_sinteza_kdnk_i_ptsr_s_obratnoy_transkriptsiey/nabor_onetaq_one-step_dlya_ptsr_s_obratnoy_transkriptsiey/ ) содержит три компонента, которые обеспечивают успешное проведение каждого этапа - готовая смесь ферментов OneTaq One-Step содержит ферменты NEB: обратную транскриптазу , ингибитор РНКазы Н, и ДНК-полимеразу One Taq Hot Start.
Protoscript II - является мутантом обратной транскриплазы M-Mulv с уменьшенной активностью РНКазы Н и повышенной термостабильностью. One Taq Hot Start. ДНК-полимераза представляет собой смесь Hot Start Taq и второй полимеразы с редактирующей способностью. Такая комбинация позволяет достичь высокого выхода ПЦР при минимальной оптимизации условий реакции.
Кроме того, в состав набора входят две смеси для постановки реакции: реакционная смесь OneTaq One-Step создает идеальную буферную среду для работы ферментов, входящих в состав набора. В то же время реакционная смесь для нанесения на гель One Taq Quick-Load One-Step содержит красители, которые позволяют нанести образец, по окончании реакции на гель.

Преимущества набора для RT-PCR OneTaq One-Step:

1. Возможность амплифицировать длинные ампликоны длиной до 9 000 нуклеотидов
2. Возможность проведения мультиплексной реакции детектирования (2-3 участка интереса)
3. В качестве матрицы могут быть использованы как образцы РНК, так и ДНК
4. Набор дает возможность детектировать, например, наличие GADPH при количестве 0,1 пг в реакционной смеси

Единственная в мире обратная транскриптаза, активируемая при помощи температуры - WarmStart RTx

Обратная транскриптаза WarmStart RTx ( http://’’http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/reaktivy_dlya_sinteza_kdnk_i_ptsr_s_obratnoy_transkriptsiey/warmstart_rtx_obratnaya_transkriptaza/ ) - это уникальная, смоделированная in silico РНК-зависимая ДНК-полимераза, которая, благодаря использованию совместно с аптамером ингибирует свою активность ниже 40&degС.
WarmStart Rx позволяет проводить синтез кДНК, с использованием в качестве матрицы РНК и одноцепочечной ДНК.

WarmStart Rx обладает РНК-азной активностью, является надежным инструментом для детектирования РНК в реакции амплификации. Фермент отличается от других продуктов линейки тем, что оптимизирован для использования в реакции обратной транскрипции в условиях изотермальной амплификации (RT-LAMP). Так, при комбинации различных обратных транскриптаз с этапом амплифкации с использованием ДНК-полимеразы Bst.2 ( http://''http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/dnk-polimerazy/bst_20_dnk-polimeraza/ ), WarmStart продемонстрировала наилучшие результаты. Позволяет проводить постановку реакции при комнатной температуре и увеличивают специфичность реакции амплификации.

Преимущества обратной транскриптазы WarmStart RTx
1. Технология WarmStart увеличивает специфичность реакции
2. Увеличенная термостабильность позволяет проводить реакцию при повышенных температурах
3. Ускорение протокола позволяет уменьшать время, затрачиваемое на детекцию
4. Уменьшение количества образца для реакции TR-LAMP (0,1 пг для РНК)& синтеза кДНК (1 пг)


Мы будем рады ответить на ваши вопросы, и порекомендовать другие реактивы для синтеза кДНК ( http://''http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/reaktivy_dlya_sinteza_kdnk_i_ptsr_s_obratnoy_transkriptsiey/ ), а также продукты, используемые для работы с РНК ( http://''http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/reaktivy_dlya_raboty_s_rnk/ ).

Наш email: info@skygen.com; тел: +7 (495) 215 02 22; +7 (800) 333 12 26



SkyGen 06.03.2015 16:26
Конкурс на лучший доклад от компании СкайДжин в рамках 19 Пущинской школы-конференции "Биология - наука 21 века

Прикреплённое изображение

В рамках работы 19 Пущинской школы-конференции "Биология - наука 21 века" помимо традиционного конкурса лучших работ по мнению экспертного совета Конференции, проводится конкурс на Лучший доклад секции по версии Компании СкайДжин. Оцениваться будет оригинальность научной идеи, максимальное использование возможностей современного лабораторного оборудования и методических подходов.

Заявить о своем намерении участвовать в конкурсе необходимо направив заявку в свободной форме на адрес оргкомитета конференции orgcom@biology21.ru с темой письма "Конкурс SkyGen" и указанием какие реактивы и каких производителей, приобретенных в компании СкайДжин, Вы используете в своей работе.


Победители определяться в дни проведения Конференции и получат Сертификаты номиналом 12 000, 8000 и 5000 рублей на приобретение реактивов и расходных материалов из ассортимента нашей компании!


Более подробную информацию о мероприятии в Пущино, Вы сможете найти на сайте конференции www.biology21.ru


Мы, со своей стороны, будем чрезвычайно рады, видеть результаты научной работы наших любимых клиентов, и встретить лично и вручить победителям конкурса наши призы!



SkyGen 18.03.2015 19:09
Выиграйте конкурс на лучший постерный доклад, и получите сертификат на продукцию компании СкайДжин!

Прикреплённое изображение

Мы долго думали, как помочь нашим любимым клиентам получить нашу продукцию совершенно бесплатно, и вот придумали!

Мы рады объявить, что компания Скайджин является спонсором 3-ей Международной конференции "Генетика, геномика, биоинформатика и биотехнология растений" (Россия, г. Новосибирск, 17-21 июня 2015 года; http://conf.nsc.ru/plantgen2015) ( http://conf.nsc.ru/plantgen2015) ) и спонсором проводимого в рамках данной конференции конкурса на лучший постерный доклад. Пять победителей конкурса получат сертификаты компании Скайджин стоимостью 4000 рублей каждый, которые можно будет потратить на приобретение всевозможных ферментов (например, рестриктаз), на реактивы для секвенирования по Сэнгеру, наборы для выделения ДНК и РНК и ферментативной очистки ПЦР-смеси и на многое-многое другое!

Участвуйте в конференции, получайте новый опыт, выигрывайте! А потом обращайтесь к нам и получайте любимые ферменты!


Со всеми вопросами обращайтесь по электронной почте: info@skygen.com, или по телефонам: +7 (495) 215 02 22; +7 (800) 333 12 26



SkyGen 31.03.2015 17:34
Амплификация полного генома отдельной клетки - решение от New England Biolabs

Прикреплённое изображение

Часто ли вы оказывались в такой ситуации, когда исчезающе малые количества исходного материала не позволяют думать о продолжении экспериментов? Существуют также ситуации, когда важно использовать ДНК одной единственной клетки. Сегодня все это стало возможно, благодаря появлению новых, высокопродуктивных ДНК-полимераз.

Метод полной амплификации генома клетки особенно актуален для изучения эмбрионального развития, дифференциации стволовых клеток, нейронов и разработки новых подходов для лечения опухолевых заболеваний.

Всем, а особенно тем, кому такие возможности приоткрывают новые двери для шага вперед в их исследованиях, мы расскажем в нашем обзоре про набор для полной амплификации генома клетки PicoPLEX™ WGA Kit ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/nabory_i_reaktivy_dlya_provedeniya_amplifikatsii_i_ptsr/nabor_dlya_polnoy_amplifikatsii_genoma_kletki/ ) от компании New England Biolabs. А также о возможностях секвенирования ДНК материала отдельной клетки.

В каком направлении должны были двигаться исследователи, чтобы иметь возможность увеличить то мизерное количество ДНК и РНК, которое можно получить из одной единственной клетки в миллионы раз и получить количество, достаточное для анализа?

Набор для полной амплификации генома клетки PicoPLEX™ WGA Kit ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/amplifikatsiya_i_ptsr/nabory_i_reaktivy_dlya_provedeniya_amplifikatsii_i_ptsr/nabor_dlya_polnoy_amplifikatsii_genoma_kletki/ ) эффективно амплифицирует общую ДНК из одной клетки или ДНК эквивалента одной клетки в 1 миллион раз, с получением 2-5 мг ДНК меньше чем за 3 часа.

Для решения каких задач возможно использовать набор для полной амлпификации генома клетки?

1. Анализ вариаций числа копий (Copy Number Variation, CNV)
2. SNP генотипирование
3. Детекция мутаций
4. Секвенирование

Принцип метода полной амлпификации генома клетки (WGA)

Набор для полной амплификации генома клетки PicoPLEX&trade; WGA Kit позволяет эффективно амплифицировать целиком ДНК, содержащуюся в одной клетке, до суммарного количества в 2-5 мкг за 3 часа (в результате протокола происходит увеличение количества исходной ДНК в 1 миллион раз). Длина получаемых при помощи набора ампликонов варьирует от 200 до 1000 п.н.

Прикреплённое изображение

Рис.1. Последовательность действий при проведении 3-х шагового протокола амплификации генома одиночной клетки или 15 пг - 15 нг ДНК.</i>

Какие преимущества дает использованием методики полногономной амплификации клетки (WGA)?
1. Возможность амплификации генома отдельно взятой клетки. Эффективность амплификации единичного бластомера и полярных телец достигает 95%.
2. Набор может быть также применен при необходимости амплификации неопределенного малого количества исходного материала (от одной до тысячи клеток или от нескольких пикограмм до нескольких нанограмм ДНК).

3. Метод позволяет одинаково успешно амлифицировать как AT-, так и GC-богатые регионы.
4. Высокая воспроизводимость: коэффициент корреляции между значениями Ct при повторных ПЦР в реальном времени достигает 90%.

5. Специфичность и высокая эффективность метода могут быть наглядно проиллюстрированы (Рис.2.), когда мы сравним рост кривых амплификации одиночного клеточного генома и отрицательного контроля: нарастание сигнала в пробирках с отрицательным контролем происходит с отставанием, как минимум, в 5 ПЦР-циклов.

Прикреплённое изображение

[i] Рис.2. Амплификационные кривые, полученные при проведении ПЦР при помощи набора для полной амплификации генома клетки в режиме реального времени на приборе Bio-Rad I Cycler iQ.


Другим примером эффективности работы может служить электрофореграмма разделения продуктов ПЦР после использования набора WGA (Рис.3).

Прикреплённое изображение

Рис. 3 Электрофореграмма разделения продуктов ПЦР в 1,4% агарозном геле. Дорожка 1: отрицательный контроль, дорожки 2 и 3: продукты двух независимых реакций с использованием 15 пг геномной ДНК человека, М: Маркер 2-Log 0.1-10 т.п.н. длин ДНК.

Амплификация полного генома отдельной клетки для последующего секвенирования NGS

Давайте вместе посчитаем: в одной клетке находится 70-100 пг ДНК и порядка 10 пг тотальной РНК (что составит 0,1-0,5 пг мРНК). Для того, чтобы, например, приготовить ДНК библиотеку для NGS с помощью набора NEBNext для Illumina, нам потребуется 1-5 мкг ДНК (в случае набора NEBNext Ultra - 5 нг-1 мкг). Значит, при условии увеличения количества ДНК в 10 000 раз возможно будет создать библиотеку NGS. Для РНК задача усложняется: для использования набора NEBNext для создания библиотеки потребуется 100 нг-1мкг тотальной РНК (10 нг-1 мкг для набора Ultra). Получаемое количество ДНК после использования набора, даже с учетом потерь на очистку, достаточно для проведения NGS эксперимента.

Cостав набора

1. Фермент для экстракции ДНК
2. Фермент для подготовки к амплификации
3. Фермент для амплификации
4. Буфер для экстракции
5. Буфер для разведения фермента для экстракции
6. Реакционная смесь для подготовки к амплификации
7. Реакционная смесь для амплификации
8. Очищенная от нуклеаз вода
9. Температура хранения: -20°С

Примечания:

Пробирки с ферментами следует доставать из холодильника и ставить на планшет со льдом только перед непосредственным их использованием. Остальные компоненты набора можно размораживать на планшете со льдом, а перед использованием их следует перемешать при помощи вортекса.

Набор для полной амплификации генома клетки предполагает работу со сверхнизкими (пикограммы) количествами ДНК, поэтому при работе с ним необходимо соблюдать особую осторожность для предотвращения возможной контаминации.

Мы надеемся, что представленная в данном обзоре информация будет полезна, и поможет вашей работе! Со всеми вопросами и предложениями (в том числе по тематикам обзоров, которые интересные) обращайтесь по электронной почте info@skygen.com, и по телефонам: +7 (495) 215 02 22; +7 (800) 333 12 26



SkyGen 31.03.2015 18:11
Выделение микроРНК, РНК и ДНК с использованием phenol-free колоночных наборов от Bioline

Прикреплённое изображение

Мы продолжаем расширять нашу линейку для колоночного выделения нуклеиновых кислот из самых разных образцов. Сегодня мы хотим обратить внимание всех, кто работает с микроРНК, тотальной РНК, а также с образцами тканей в парафине на новинки для колоночного выделения:
Набор для выделения РНК из биологических жидкостей ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/bioline/nabory_dlya_vydeleniya_rnk/ ) позволяет выделить РНК высокого качества из физиологических жидкостей - крови/сыворотки, мазков изо рта, клеточных культур, вирусов.
Набор для выделения микро РНК ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/bioline/nabory_dlya_vydeleniya_rnk/ ) и набор для выделения микро РНК из растений ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/bioline/nabory_dlya_vydeleniya_rnk/ ) позволяют получить тотальную РНК и микроРНК из самых различных образцов (см. Табл.1 в тексте обзора).
Набор для выделения РНК/ДНК из тканей, зафиксированных формалином в парафине ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/bioline/nabory_dlya_vydeleniya_rnk/ ) позволяет получить геномную ДНК и тотальную РНК хорошего качества из проблемных образцов.
Набор для выделения ДНК/РНК/протеинов ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/bioline/nabory_dlya_vydeleniya_rnk/ ) позволяет выделить три различных типа макромолекул из одного образца без этапа экстракции органическими растворителями.

Преимущества линейки наборов для выделения РНК от ISOLATE II
1. Безопасность: простой протокол, без использования токсичных химикатов (без фенола)
2. Достоверные результаты: возможность очистить как микро РНК, так и малые РНК (длиной до 200 нуклеотидов) без разрушения, вызываемых использованием фенола
3. Быстрый протокол: без трудоемкого этапа разделения фаз и осаждения спиртом
4. Надежность: без инициируемого фенолом разрушения образцов
5. Использование для дальнейших экспериментов: РНК готова к дальнейшему использованию в большинстве экспериментов.

Было показано, что малые РНК с малым содержанием GC могут быть селективно потеряны при очистке с использованим фенола (Kim et al., Molecular Cell 46(6): 2012).
Таблица 1. Типы образцов, из которых возможно выделять микро РНК, РНК, ДНК и протеины при помощи наборов для выделения ISOLATE II

Прикреплённое изображение

Давайте подробнее остановимся на каждом из рассматриваемых наборов.

1. Набор для выделение РНК из биологических жидкостей и из вирусов ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/bioline/nabory_dlya_vydeleniya_rnk )

Типы выделяемой РНК:
1. большие фрагменты мРНК
2. вирусная РНК
3.рибосомальная РНК (rRNA)
4. малые РНК, такие как микроРНК (miRNA) и короткие интерферирующие РНК (siRNA)

Откуда выделяется РНК?
1. кровь/плазма/сыворотка
2. слюна
3. цереброспинальная жидкость (CSF)
4. семенная жидкость
5. вирусы

Откуда выделяется вирусная РНК?
Кроме перечисленных выше типов образцов, также из культивируемых клеток и тканей.
Принцип выделения:
Колоночное выделение с использованием аффинного полимера, связывающего РНК разного размера (используется новый тип silica, к которой преимущественно присоединяются малые РНК). Набор не использует фенол и хлороформ.
Образцы подвергаются лизису в присутствии гуанидиниум тиоционата, и хаотропных солей, которые деактивируют эндогенные РНКазы и позволяют выделить неповрежденную РНК. Затем, геномная ДНК захватывается колонками и удаляется. Добавляется этанол, и РНК переносится в колонку для выделения РНК. Далее, тотальная РНК задерживается колонкой и может быть избавлена от примесей при промывании.
Полученная высокочистая РНК может быть использована в следующих экспериментах:
1. реал-тайм ПЦР (qPCR)
2. реакция обратной транскрипции
3. синтез кДНК
4. секвенирование следующего поколения
5. Nothern blotting

2. Набор для выделения РНК/ДНК из тканей, зафиксированных формалином в парафине ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/bioline/nabory_dlya_vydeleniya_rnk )
Набор обеспечивает выделение и очистку геномной ДНК и тотальной РНК (включая микроРНК) из образцов тканей в парафине. Зафиксированные в парафине ткани характеризуются образованием связок между нуклеиновыми кислотами и белками, и друг с другом. Фиксация также часто характеризуется фрагментацией ДНК с течением времени. Набор позволяет частично избавиться от модификаций, вызванных формалином, увеличивая качество и выход нуклеиновых кислот.
Разделительный матрикс в составе колонок позволяет отделять РНК и ДНК от других компонентов клеток. Набор не требует использования хлороформа и фенола.
На первом этапе избавляются от парафина при помощи промывки ксиленом и этанолом, далее образцы разлагаются с использованием Протеиназы К и специального буфера. Растворимый лизат собирается для очистки РНК, а оставшийся образец разлагается для выделения ДНК. Лизирующий буфер и этанол добавляются в лизат, содержащий ДНК и РНК и переносят в микроколонки для выделения РНК и ДНК. Связанные нуклеиновые кислоты промываются. Очищенные РНК и ДНК могут использоваться для широкого спектра экспериментов.

3. Набор для выделения микроРНК ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/bioline/nabory_dlya_vydeleniya_rnk/ ) и набор для выделения микроРНК из растений ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/bioline/nabory_dlya_vydeleniya_rnk/ )
Набор был разработан для выделения обогащенной микроРНК (размер составляет &lt;200 нуклеотидов), выделение происходит из следующих образцов:
1. культивируемые клетки
2. ткани млекопитающих
3. бактерии
4. кровь
5. другие биологические жидкости

Какие типы малых РНК выделяются:
1. регуляторные молекулы РНК (такие например как микроРНК (miRNA)
2. короткие интерферирующие РНК (siRNA),
3. транспортные РНК (tRNA)
4. РНК из 5Sсубъединицы (rRNA)
Малые РНК, имеющие длину 20-25 нуклеотидов, вовлечены в регуляцию генной экспрессии при помощи связывания с мессенджер РНК (mRNA)

Принцип выделения
РНК прикрепляется к колонки при помощи аффинного связывания,при этом при помощи размера пор возможно разделить РНК по размеру.
Тотальная РНК, в растворе этанола проходит через связывающую колонку, где большие фрагменты РНК остаются связанными, а малые смываются в супернатант. Далее супернатант, содержащие малые РНК проходит через колонку для выделения малых РНК, где связываются малые молекулы.

4. Набор для выделения ДНК/РНК/протеинов ( http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/bioline/nabory_dlya_vydeleniya_rnk/ )
Набор позволяет выделить и очистить с высоким качеством одновременно следующие три компонента, из одного образца
1. тотальную РНК (включая малые РНК),
2. геномную ДНК
3. белки

Выделение может проводиться из следующих образцов:
1. культивируемые клетки
2. ткани млекопитающих
3. биологические жидкости (включая слюну, мочу, семенную жидкость и кровь)
4. бактерии
5. дрожжи,
6. грибы
7. растения
Особенно набор подходит для исследователей, которые выделяют макромолекулы из особенно ценных, труднодоступных образцов (таких как результаты биопсии), - потому что это позволяет не проводить фракционирование образца. Также, анализ становится более достоверным, вследствие того, что РНК, ДНК протеины получаются из одного и того же образца.
Протокол предотвращает деградацию РНК (при помощи перемешивания образца с гуанидинумом тиоцианатом. Геномная ДНК захватывается и отделяется при помощи ДНК колонки. Оставшийся супернатант погружается в колонку для выделения РНК/протеинов. Далее тотальная РНК (включая микроРНК) связывается с поверхностью колонки, в то время как протеины остаются в растворе. Протеины, оставшиеся в промывном растворе - могут быть нанесены непосредственно на SDS-PAGE гель, для визуального анализа, или очищаться. Набор не содержит фенол и хлороформ.
Возможно исследовать одновременно геном, транскриптом и проводить протеомные исследования в одном образце. Очищенная РНК может быть использована для реал-тайм ПЦР, ПЦР с обратной транскрипцией, Nothern Blotting, экспериментах по секвенированию и экспрессии. Полученная ДНК может быть использована для ПЦР, реал-тайм ПЦР, NGS секвенирования, генотипирования. Белки могут быть использованы для SDS-PAGE, Westertn Blotting, 2-D гелей, масс-спектрометрии.

Заключение
Мы надеемся, что новая альтернатива представленным на рынке методам и продуктам для выделения РНК (и микроРНК) позволит упросить и удешевить проведение экспериментов с использованием РНК. По всем возникающим вопросам, пожалуйста, обращайтесь по электронной почте info@skygen.com!



SkyGen 01.06.2015 16:22
Готовые двуцепочечные гены длиной до 5000 п.о. по доступным ценам от IDT DNA


Прикреплённое изображение

Данный обзор предназначен для всего широкого числа пользователей, которым для самых разных целей требуются протяженные двуцепопченые фрагменты генов, длиной до 200 до 5000 пар оснований, как в виде фрагментов цепи ДНК, так и в составе плазмиды.
Воспользуйтесь возможностью ускорить свои научные исследования уже сегодня, используя в работе готовые протяженные фрагменты генов, синтезированные с высочайшей точностью, по доступной цене, которые могу быть доставлены из США в течение 2-3 недель.

Научные группы, перед которыми стоят задачи конструирования генов, создания рекомбинантных антител, вакцин, работы с CRISPR-системой редактирования генома, и которым требуются контроли для ПЦР и реал-тайм ПЦР, сегодня могут не тратить время и силы на сшивку длинных фрагментов. Также, возможно избежать трудностей и ошибок при встраивании гена интереса в плазмидный вектор. Следовательно, все время и средства, сэкономленные на осуществление на данных этапов, возможно потратить на решение интересующей научной проблемы.

Данный обзор предназначен для всего широкого числа пользователей, которым необходимы протяженные двуцепопченые фрагменты генов, длиной от 200 до 5000 пар оснований, как в виде фрагментов двухцепочечной ДНК, так и в составе плазмиды.

1. Фрагменты двуцепочечных генов gBlocks

[b]gBlocks
- это двуцепочечные фрагменты генов от компании IDT DNA Technologies. В чем преимущество этого продукта по сравнению с другими предложениями на рынке?
Проверенное временем качество IDT DNA, лидера рынка США и мира в области синтеза ДНК и РНК
Сроки поставки из США от 2 до 3 недель, в зависимости от сложности последовательности и длины гена
Подтвержденная секвенированием последовательность генов и высокая точность синтеза
gBlocks могут быть использованы для конструкции и модификации генов, разработки антител и в исследованиях с использованием системы редактирования генома CRISP, а также быть как стандарты для qPCR и для решения многих других задач. некоторые направления возможных приложений таких генов приведены на рисунке 1.

Рисунок 1. Схема возможных направлений применения gBlocks от компании IDT DNA.

Прикреплённое изображение

Кроме генов с определенной последовательностью, мы предлагаем библиотеки фрагментов двуцепочечных генов gBlocks - это множество генов, у которых консервативные участки перемежаются с участками до 18 последовательных варьирующихся оснований (N или K), такие библиотеки могут использоваться для производства рекомбинантных антител и конструирования белков.

2. Какие форматы синтеза и доставки доступны в компании СкайДжин?
А. Вы можете заказать гены в виде протяженного фрагмента двухцепочечной ДНК - в виде gBlocks, который далее может использоваться для любого метода клонирования, включая сборку по Гибсону, методы клонирования по тупым концам и клонирования с липкими концами. gBlocks могут быть синтезированы с/без фосфатной группой на 5'-конце. Длина таких фрагментов может составлять от 12 до 2000 п.о. Такие гены доставляются в сухом виде, с количеством вещества 200 нг.

Б. Также возможно заказать двухцепочечный ген, клонированный в плазмидный вектор, уже готовый к введению в E.Coli. Такой вариант заказа гена называется Custom gene. Такой вектор может содержать участок устойчивости к ампициллину, канамицину или хлорамфениколу, а также сайты рестрикции на 3'- и 5'-концах. Также, для специальных задач по in vitro транскрипции можно выбрать вектор pIDTBlue для генов с длиной большей, чем 1500 п.о. Гены с длиной более чем 5000 п.о. поставляются в составе плазмид или бактериальных искусственных хромосом (BACs).
Гены, встроенные в плазмиду длиной более 5000 п.о., поставляются в количестве 4 мкг, в сухом виде. Гены длиной менее 5000 п.о., в составе бактериальных искусственных хромосом (BACs), доставляются в сухом виде, в количестве 1 мкг.

3. При выборе синтеза гена в векторе, какие варианты плазмид доступны?
Если вы приняли решение заказать ген в составе плазмиды, вы получите его в виде, готовом к трансформации в E. coli. При заказе гена с длиной менее чем 5000 п.о. вам предложат воспользоваться способом заказа Best-Fit.
В таком случае во время процесса клонирования, желаемый фрагмент ДНК будет встроен в наиболее подходящий вектор, что помогает избежать непредвиденных трудностей с клонировнаием или токсичностью. В таком случае не будет происходить задержек при синтезе.
Гены, длина которых не превышает 1500 п.о. могут быть заказаны в векторе pIDTBlue, если предполагается использование гена в in vitro транскрипции. Аналогично вектору pBluescript II, вектор pIDTBlue содержит большое количество сайтов клонирования в альфа фрагменте гена LacZи в промотерах T3 и T7, по краям сайта встраивания. PIDTBlue плазмида содержит устойчивость к ампициллину.
BACs и гены длиной более чем 5000 п.о.
Гены с длиной более 5000 п.о. поставляются в BAC с устойчивостью к хлорамфениколу. Инструкции по тому, как работать с BAC векторами, на английском языке, могут быть найдены здесь ( http://eu.idtdna.com/pages/docs/default-source/synthetic-biology/how-to-handle-bacs.pdf?sfvrsn=4 ). В таблице 1 представлены все возможные варианты векторов, в которые могут поставляться фрагменты генов.

Таблица 1. Возможные варианты векторов, в которых могут поставляться фрагменты генов.

Прикреплённое изображение

4. Какие шаги необходимо предпринять, чтобы заказать двухцепочечный ген в компании СкайДжин?

К тексту обзора прикреплены форма для заказа генов, которую можно заполнить и выслать на почту info@skygen.com.
При заполнении таблицы обратите внимание на то, что если ваш ген будет доставляться в плазмиде, необходимо указать сайты рестрикции на 3' и 5' концах и тип антибиотика, к которому должна быть резистентность.
После этого будет сформирована цена, вам будет прислан на проверку скан заказа который надо будет подписать с вашей стороны, и мы попросим заполнить форму безопасности гена, которая также прикреплена к данному обзору.
Для того, чтобы принять решение о возможности осуществить синтез и об его окончательной стоимости, принимаются во внимание следующие факторы:
Вторичная структура: шпильки длиной более 10 оснований, и GC-богатые участки
Повторы и гомополимерные участки: длинные повторы более чем 10 пар для G/C, или более чем 30 пар для A/T
Общее содержание GC более 65% и содержание GCболее 25% в отдельных частях гена
Повторы рестрикционных сайтов и сайт метилирования Dam/Dcm, которые могут влиять на разрезание эндонуклеазами рестрикции

5. Как правильно использовать полученные фрагменты генов gBlocks?
Чтобы облегчить работу наших клиентов, мы предлагаем ряд опробованных и оптимизированных протоколов для использования фрагментов генов gBlocks. Следующие протоколы (на английском языке) - рекомендуются для сборки и амплификации фрагментов gBlocks. Условия работы с фрагментами и инструкции по хранению также включены.
Метод сборки фрагментов генов по Гибсону ( http://eu.idtdna.com/pages/docs/default-source/user-guides-and-protocols/gibson-assembly.pdf?sfvrsn=12 )
В оригинальной статье, в которой был описан методв Гибсона [Gibson et al., 2009], были представлены рекомендации по сборке конструктов, размер которых варьируется от малых бактериальных геномов до миллиона п.о. при помощи этой методики. Тем не менее, IDT предлагает ограничить размер собираемых участков до 2300 п.о. с использованием 4-5 фрагментов. Для сборки рекомендуется использовать готовую смесь Gibson Assembly от компании New England Biolabs, которую также можно заказать в нашей компании.
Протокол можно найти в статье Gibson DG, Young L, et al. (2009)

Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19363495 ). Nature Methods 6 (5):343&ndash;345. doi:10.1038/nmeth.1318. PMID 19363495.

Амплификация фрагментов gBlocks ( http://eu.idtdna.com/pages/docs/default-source/user-guides-and-protocols/gblocks-amplification.pdf?sfvrsn=8 )

T/A клонирование фрагментов ( http://eu.idtdna.com/pages/docs/default-source/user-guides-and-protocols/gblocks-fragment-t-a-cloning.pdf?sfvrsn=4 )

Клонирование мегапраймеров без этапа рестрикции ( http://eu.idtdna.com/pages/docs/default-source/synthetic-biology/megaprimer-restriction-free-cloning.pdf?sfvrsn=0 )

В дополнение к приведенным протоколам, можно привести несколько советов по работе с gBlocks.
Клонирование с использованием gBlocks аналогично использованию очень чистого ПЦР-продукта. Для клонирования с рестриктазами важно добавить 6-8 нуклеотидов на концы фрагментов, за пределами рестрикционного сайта узнавания. Большинство ферментов будет терять эффективность, если фрагмент гена будет заканчиваться сайтом рестрикции.
Добавлять на 5&prime;-конце фосфатную модификацию необязательно для большинства задач. Добавление 5&prime; фосфата необходимо для традиционного клонирования по тупым концам. Нельзя добавлять фосфорилирование при использовании Zero Blunt TOPO клонирования.
6. Биологическая безопасность синтезируемых генов
Каждый синтезируемый ген контролируется для избежания содержания в них последовательности, кодирующей потенциально опасных патогенов, каждый пользователь должен подтвердить отсутствие таковых участков в составе заказываемого гена.

Заключение
Мы надеемся, что информация, представленная в этом обзоре, будет полезна и поможет Вам в ваших дальнейших исследованиях.



SkyGen 09.08.2017 11:03
СУПЕР АКЦИЯ от СкайДжин!
Закажите набор для выделения ДНК от Мачерей-Нагел с супер скидкой.

СКИДКА:
60%: 28 августа — 3 сентября 2017
50%: 4 сентября — 10 сентября 2017
40%: 11 сентября — 17 сентября 2017
30%: 18 сентября — 24 сентября 2017
20%: 25 сентября — 1 октября 2017
10%: 2 октября — 6 октября 2017

Сегодня у Вас есть уникальная возможность подготовиться к зиме и запастись наборами для выделения ДНК со скидкой 60%.
Наборы для выделения ДНК из тканей, крови, биологических жидкостей, почвы, микроорганизмов, насекомых найдут свое применение в Ваших лабораториях, а компания Мачерей-Нагел обеспечивает высокое немецкое качество с 1911 года!
Перед тем как предложить Вам данные решения, мы съездили в штаб-квартиру Мачерей-Нагел в город Дюрен (Германия), посетили их производство и руками попробовали каждый набор.
При оформлении заказа можно включить в него другую продукцию от Мачерей-Нагел с фиксированной скидкой 25%.
Указанная скидка сохраняется в течение 2-х недель после выставления коммерческого предложения в указанный период. В этот срок необходимо оплатить заказ или заключить договор, или предоставить официальное гарантийное письмо.
Свой заказ Вы можете отправить нашим менеджерам по продажам по адресу info@skygen.com ( http://www.info@skygen.com ), а также связаться с нами по телефону +7(495)215-02-22 или бесплатной линии 8(800)333-12-26.

info@skygen.com



Картинки:
Прикреплённое изображение

SkyGen 09.08.2017 15:26
Новый каталог NEB 2017/2018

Уже 40 лет каталоги NEB являются наглядным пособием для молодых учёных. Благодаря своему информационному наполнению, они помогут оптимизировать реакцию ПЦР, клонирование, пробоподготовку NGS. Таблица рестрикции прилагается к каждому каталогу.

Закажите каталог NEB и мы с ним доставим фирменные карандаш, сумку, плотик NEB или блокнот.

Внутри каталога вы также сможете найти стикеры на скидку в размере 5%, 10% или 15% на любой заказ NEB.*

При оформлении заказа NEB отправьте нам фото с вашим стикером на адрес: anastasia.markacheva@skygen.com и мы учтём вашу скидку.

Закажите новый каталог NEB, заполнив форму здесь ( https://docs.google.com/forms/d/e/1FAIpQLScDfmBO6-WeIbm0im5UID5ofcZTjDxc2HAgthFf4BPIP7pVSA/viewform ) .
Прикреплённое изображение
*скидка действует до 31.12.17




VanGogovih 10.08.2017 08:40
Круто ( https://rusalka.biz/ankets/metro/ )



Olescarold 16.08.2017 17:22
Красотка ( https://vipdosug.net/ankets/metro/ )



SkyGen 17.08.2017 12:44
Мы стали партнерами сайта "БИОМОЛЕКУЛА"!

jump.gif Мы рады сообщить, что теперь являемся партнером уникального проекта - научно-популярного сайта "БИОМОЛЕКУЛА"! Наше сотрудничество началось с самой интересной и близкой нам темой - секвенирования.

Ознакомиться со статьей под названием "Методы в картинках: cеквенирование нуклеиновых кислот" можно, перейдя по ссылке ( http://https://biomolecula.ru/articles/metody-v-kartinkakh-cekvenirovanie-nukleinovykh-kislot )



Картинки:
Прикреплённое изображение

SkyGen 18.08.2017 12:35
QIAGEN от SKYGEN – прямые поставки из Германии!

Дорогие друзья! Уважаемые коллеги!

Мы с гордостью сообщаем Вам, что в августе 2017 г. СкайДжин стал официальным дистрибьютором компании QIAGEN в России и Республике Казахстан!

Мы рады Вам предложить реагенты и оборудование QIAGEN для исследований Life Science по доступной цене и быстрыми сроками доставки.

Мы организуем доставку так, как мы это сделали с New England Biolabs, чтобы у Вас всегда были необходимые реагенты под рукой!

Уже сейчас у нас на складе есть продукция QIAGEN, которая будет регулярно пополняться.

Наши специалисты помогут Вам подобрать все необходимые компоненты для Вашего исследования. Все многообразие реагентов и оборудования QIAGEN – к Вашим услугам, выбор – только за Вами!

• Пробирки для сбора и хранения биообразцов PAXgene
• Решения стабилизации биообразцов
• Наборы реагентов для выделения ДНК, тотальной РНК, мРНК, мкРНК
• Готовые решения для жидкостной биопсии в онкологии и NIPT
• Решения для анализа одиночных клеток
• Мастер-миксы miScript и RT² Profiler для анализа мРНК и мкРНК
• Наборы реагентов для создания библиотек серии GeneRead и QIAseq для систем illumina и ION
• Наборы серии AdnaTest для онкологических исследований
• Станции для выделения ДНК и РНК QIAcube и QIAcube HT
• Станция для дозирования QIAgility
• Система капиллярного электрофореза QIAxcel Advanced
• Реал-тайм амплификаторы серии Rotor-Gene Q 2plex и 5plex HRM
• Пиросеквенатор с автоматизацией пробоподготовки PyroMark Q48 Autoprep
• Система секвенирования следующего поколения GeneReader
• Программное обеспечение для анализа данных CLC Bio
• Программное обеспечение для интерпретации данных Ingenuity Variant Analysis, Ingenuity Pathway Analysis, QCI Interpret
и многое другое! ( http://www.skygen.com/novosti/qiagen_ot_skygen__pryamye_postavki_iz_germanii/ )!
Прикреплённое изображение

Получить более подробную информацию о продуктах QIAGEN и ценах, а также сделать заказ, можно отправив запрос по электронной почте info@skygen.com, или позвонив по телефону +7 (495) 215 02 22 или по бесплатной линии 8 (800) 333 12 26.

Вы можете ознакомиться со списком ( http://www.skygen.com/upload/iblock/e80/e800648432b8506c45ab15a9fc1d07e8.pdf ) оборудования, принадлежностей и реагентов QIAGEN, которые находятся в наличии на складе в Москве.



SkyGen 07.09.2017 12:54
Идет вторая неделя нашей супер акции на продукцию Macherey-Nagel!
Успейте закупить наборы для выделения ДНК со скидкой 50% до 10 сентября. wink.gif

Подробности на нашем сайте: skygen ( http://http://www.skygen.com/novosti/_super_aktsiya__na_produktsiyu_macherey-nagel__ot_kompanii_skaydgin_/ )



Картинки:
Прикреплённое изображение

SkyGen 19.09.2017 12:10
С ДНЕМ РОЖДЕНИЯ СКАЙДЖИН! wink.gif
Нам 5 лет!
От всего сердца хотим поблагодарить наших сотрудников, клиентов и партнеров!Мы развиваемся и реализуем наши намеченные цели благодаря вам! Желаем всем отличного настроения,творческих успехов и процветания!
Спасибо, что вы с нами!




Картинки:
Прикреплённое изображение

SkyGen 26.09.2017 17:59
Клонируйте с удовольствием вместе с компанией «СкайДжин»!

С 26 сентября по 16 октября мы предоставляем скидку 35% (для разгадавших загадку)* и 25% (базовая скидка) на следующие продукты:

Все высокоточные эндонуклеазы рестрикции ( http://http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/endonukleazy_restriktsii/high_fidelity_hf_fermenty_restriktsii/ ) (HF®). Высокоточные рестриктазы - это гордость портфолио NEB, они не проявляют звездчатую активность даже после ночной инкубации, работают в едином буфере CutSmart®, поставляются вместе с краской для нанесения на гель.
Наборы для лигирования

1. Готовая смесь для лигирования субстратов с тупыми/липкими концами ( http://http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/reaktivy_dlya_modifikatsii_nk/ligazy/master_mix_dlya_ligirovaniya_substratov_s_tupymilipkimi_kontsami/ ), М0367. Смесь готова к использованию, лигирует как субстраты тупыми концами, так и субстраты с выступающим основанием, быстро и при комнатной температуре. Не требует размораживания после хранения в морозилке.

2. Готовая смесь для гновенного лигирования субстратов с липкими концами ( http://http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/reaktivy_dlya_modifikatsii_nk/ligazy/master_mix_dlya_mgnovennogo_ligirovaniya_substratov_s_lipkimi_kontsami/ ), M0370. Готовая к использованию смесь быстро и надежно лигирует субстрат с липкими концами (2-4 п.о.) Размораживать после хранения в морозилке не надо, инкубация не требуется. Фантастика!

3. Набр Quick Ligation для быстрого лигирования ( http://http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/reaktivy_dlya_modifikatsii_nk/ligazy/nabor_quick_ligation_dlya_bystrogo_ligirovaniya/ ), M2200. Набор позволяет лигировать субстраты с липкими концами, тупыми концами за 5 минут при температуре 25 градусов. Такое есть только у нас.

Набор для ПЦР–клонирования
1. E1203 ( http://http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/reaktivy_dlya_modifikatsii_nk/klonirovanie_i_mutagenez/nabor_neb_dlya_ptsr-klonirovaniya_bez_kompetentnyh_kletok/ ) (с некомпетентными клетками)

2.E1202 ( http://http://www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs/reaktivy_dlya_modifikatsii_nk/klonirovanie_i_mutagenez/nabor_neb_dlya_ptsr_i_klonirovaniya/ ) (с компетентными клетками)

С этими наборами вы сразу можете приступить к процессу клонирования. Для работы у вас будет все необходимое, включая контроль. Легкий старт.

С этими продуктами процесс клонирования пройдет на «УРА»!

*Теперь о загадке, которую надо разгадать, чтобы получить повышенную скидку 35%. cool.gif

Мы подготовили для Вас3 интереснейших обзора с картинками ( http://http://www.skygen.com/obzory/ ) jump.gif , в каждой из картинок спрятано слово, которое является частью фразы. Найдите все 3 слова, составьте фразу и отправьте ее нам на почту: info@skygen.com ( http://www.skygen.com/obzory/ ).

Указанная скидка сохраняется в течение 2-х недель после выставления коммерческого предложения в указанный период. В этот срок необходимо оплатить заказ или заключить договор, или предоставить официальное гарантийное письмо.

Свой заказ Вы можете отправить нашим менеджерам по продажам по адресу info@skygen.com ( http://www.skygen.com/obzory/ ), а также связаться с нами по телефону +7(495)215-02-22 или бесплатной линии [/u]8(800)333-12-26.



Картинки:
Прикреплённое изображение

SkyGen 24.10.2017 17:04
C 30 октября по 10 ноября мы дарим скидки до 50% на QIAGEN!*

Успей поймать самую большую скидку 30 октября!

При покупке любых реагентов и расходных материалов продукции Qiagen (кроме наборов, содержащих спирт) предоставляется скидка в следующий временной промежуток:

30 октября - 50% на продукцию Qiagen (при условии совместного заказа с продукцией New England Biolabs со скидкой 10%) и 45% на продукцию Qiagen (без New England Biolabs в заказе)

31 октября - 45% на продукцию Qiagen (при условии совместного заказа с продукцией New England Biolabs со скидкой 10%) и 40% на продукцию Qiagen (без New England Biolabs в заказе)

1 ноября - 40% на продукцию Qiagen (при условии совместного заказа с продукцией New England Biolabs со скидкой 10%) и 35% на продукцию Qiagen (без New England Biolabs в заказе)

2 ноября - 35% на продукцию Qiagen (при условии совместного заказа с продукцией New England Biolabs со скидкой 10%) и 30% на продукцию Qiagen (без New England Biolabs в заказе)

3 ноября - 30% на продукцию Qiagen (при условии совместного заказа с продукцией New England Biolabs со скидкой 10%) и 25% на продукцию Qiagen (без New England Biolabs в заказе)

6 ноября - 25% на продукцию Qiagen (при условии совместного заказа с продукцией New England Biolabs со скидкой 10%) и 20% на продукцию Qiagen (без New England Biolabs в заказе)

7 ноября - 20% на продукцию Qiagen (при условии совместного заказа с продукцией New England Biolabs со скидкой 10%) и 15% на продукцию Qiagen (без New England Biolabs в заказе)

8 ноября - 15% на продукцию Qiagen (при условии совместного заказа с продукцией New England Biolabs со скидкой 10%)и 10% на продукцию Qiagen (без New England Biolabs в заказе)

9 ноября - 10% на продукцию Qiagen (при условии совместного заказа с продукцией New England Biolabs со скидкой 10%) и 5% на продукцию Qiagen (без New England Biolabs в заказе)

10 ноября - 5% на продукцию Qiagen

Указанная скидка сохраняется в течение 3-х недель после выставления коммерческого предложения в указанный период. В этот срок необходимо оплатить заказ или заключить договор, или предоставить официальное гарантийное письмо.

Свой заказ Вы можете отправить нашим менеджерам по продажам по адресу info@skygen.com, а также связаться с нами по телефону +7(495)215-02-22 или бесплатной линии 8(800)333-12-26.

*Акция распространяется на реагенты и расходные материалы производства Qiagen, не содержащие спирт!

Доставка на товар не включена. Все цены указаны на сайте со склада в Москве.



Картинки:
Прикреплённое изображение

SkyGen 09.11.2017 11:28
umnik.gif 9 ноября в 16.00 состоится вебинар на тему "Собери свою плазмиду за раз!"

Мы несколько лет целенаправленно собирали в своем портфолио различные решения, для того чтобы вы быстро и просто собрали вашу плазмиду. Сегодня мы решили объединить разные подходы в один вебинар и поделиться с вами! Покупайте попкорн и присоединяйтесь к первой серии нового сезона вебинаров от компании СкайДжин!

Ведущий вебинара - Кермен Болаева, к.б.н., руководитель отдела научной поддержки "СкайДжин"
Зарегистрироваться на вебинар ( http://events.webinar.ru/2966963/494343 ) wink.gif



SkyGen 14.11.2017 17:09
Уважаемые коллеги!
smile.gif
Мы с радостью сообщаем, что набор реагентов QuantiFERON-TB Gold Plus (RUO) теперь стал доступен для заказа!

Прикреплённое изображение

Наборы реагентов Квантиферон (QuantiFERON-TB Gold Plus (RUO)) позволяют проводить исследования с целью выявления туберкулезной инфекции.
Квантифероновый тест основан на определении INF-γ (гамма-интерферона), высвобождаемого сенсибилизированными Т-клетками, стимулированными in vitro специфическими протеинами (ESAT-6, CFP-10, TB7.7 (p4)) микобактерий туберкулеза, входящих в комплекс Mycobacterium tuberculosis complex (M. tuberculosis, M. bovis, M. canettii, M. caprae, M. pinnipedii, M. mungi, M. microti, M. africanum и др.). Эти протеины отсутствуют в вакцинных штаммах M. bovis BCG и в большинстве нетуберкулезных микобактерий, за исключением M. kansasii, M. szulagai, M. marinum. В исследуемой крови пациента (из пробирки с ТВ-антигеном) определяется содержание INFγ, результат анализируется в совокупности с данными, полученными из 2-х других пробирок (выполняющих роль контролей).
Примерно 1/3 часть населения мира инфицирована микобактериями туберкулеза (МБТ), и только у 5-10% инфицированных лиц развивается заболевание. При наличии неблагоприятных факторов латентная туберкулезная инфекция (ЛТИ – состояние, когда микобактерии туберкулеза присутствуют в организме человека, но при этом отсутствуют клинические и рентгенологические признаки туберкулеза) может перейти в активную форму с развитием внелегочного туберкулеза (например, туберкулез почек).

rolleyes.gif Более подробную информацию о наборе QuantiFERON-TB Gold Plus вы можете найти на сайте QIAGEN ( http://www.quantiferon.com/products/quantiferon-tb-gold-plus/ )



SkyGen 04.12.2017 13:53
Вебинар "Преимущества использования набора QuantiFERON-TB Gold Plus (RUO) для in vitro тестов"

4 декабря в 16.00 состоится вебинар на тему:"Преимущества использования набора QuantiFERON-TB Gold Plus (RUO) для in vitro тестов"

Ведущий вебинара: Yannick Wendling, Market Development Manager Eastern Europe, Russia, Israel (Qiagen)
Язык: Английский
Время: московское

Зарегистрироваться на вебинар ( https://events.webinar.ru/2966963/768722 )

Наборы серии QuantiFERON-TB Gold Plus широко применяется зарубежом для исследований и диагностики туберкулеза и имеет ряд преимуществ перед кожными туберкулиновыми тестами.

Мы с радостью сообщаем, что набор реагентов QuantiFERON-TB Gold Plus (RUO) теперь стал доступен для заказа в России и Казахстане!



SkyGen 06.12.2017 16:28
Наши цены на ферменты согреют Вас! Перезимуем вместе!

Сегодня мы хотим предложить вам зафиксировать цены 2017 года на New England Biolabs и Qiagen с дополнительной скидкой для покупок до 28 февраля 2018 года.

Чтобы воспользоваться нашим предложением, вам надо в период с 1 по 31 декабря 2017 года запросить коммерческое предложение на продукцию New England Biolabs (со скидкой 25%), или прислать совместный запрос на продукцию New England Biolabs + Qiagen (получить скидку 30% на NEB и 10% на QIAGEN). Выставленные коммерческие предложения будут действительны до 28 февраля 2018 г.

Свой заказ Вы можете отправить нашим менеджерам по продажам на адрес электронной почты info@skygen.com, а также связаться с нами по телефону +7(495)215-02-22.
Все скидки действуют на цены со склада в Москве.

Чтобы помочь вам определиться, какие продукты потребуются для вашего протокола классического или бесшовного клонирования, мы рекомендуем воспользоваться брошюрой по молекулярному клонированию NEB ( http://www.skygen.com/upload/iblock/b38/b387319b816f1fb295e74473d8c2eb8a.pdf )
user posted image




SkyGen 26.12.2017 11:41
Дорогие друзья! Уважаемые партнеры! jump.gif

Сердечно поздравляем Вас с наступающим Новым годом и Рождеством!

Мы очень дорожим нашим сотрудничеством с Вами. Надеемся, что наша совместная работа будет залогом взаимного процветания и уверенности в Новом году!

Пусть наступающий новый год будет насыщен для Вас хорошими новостями, приятными знакомствами, удачными делами, а жизнь будет полна друзей, любви и тепла! Здоровья Вам и Вашим близким!


wink.gifВаша команда ООО «Скайджин»




Картинки:
Прикреплённое изображение

SkyGen 04.04.2018 17:04
user posted image
Вебинар от СкайДжин пройдет 10 апреля в 10.00 и 16.00 по московскому времени, чтобы его было удобно посетить, находясь в любых часовых поясах России.
Зарегистрироваться на вебинара ( http://events.webinar.ru/2966963/1057329 )



SkyGen 04.04.2018 17:11
Приглашаем всех на наш вебинар на тему: "Как провести любой эксперимент за один день с реагентами от NEB".
Вы хотите ставить эксперименты утром каждого дня, а вечером получать высокоточные результаты? Компания СкайДжин расскажет и покажет, как с помощью реагентов New England Biolabs можно всего за один день, используя новейшие разработки закончить любой эксперимент – начиная со сборки плазмиды, заканчивая подготовкой библиотеки для Illumina.
Вебинар пройдет 19 апреля в 10.00 и в 16.00 для вашего удобства.

Зарегистрироваться на вебинар ( https://events.webinar.ru/2966963/1057317 )

user posted image




SkyGen 07.05.2018 15:03
16 мая в 10:00 и в 16:00 пройдет наш новый вебинар: "Анализ экспрессии генов клеточной популяции с разрешение до одной клетки с использованием решения от 10x Genomics для платформы Illumina"

Сегодня исследователи не хотят как раньше получать усредненную информацию об экспрессии генов от всех клеток образца, и производители идут в этом навстречу! Компания 10x Genomics создала систему автоматической пробоподготовки Chromium, которая позволяет во время приготовления библиотек маркировать РНК каждой клетки и получать информацию об экспрессии генов. Все что от вас требуется - загрузить образец и готовый чип в систему.

Зарегистрироваться на вебинар в 10:00! ( https://events.webinar.ru/2966963/1146179 )

Зарегистрироваться на вебинар в 16:00! ( https://events.webinar.ru/2966963/1146081 )



Картинки:
Прикреплённое изображение

SkyGen 11.05.2018 11:00
Приглашаем на серию семинаров от компании SkyGen совместно с QIAGEN в городе Москве, Санкт-Петербурге и Казани! ( http://www.skygen.com/novosti/priglashaem_vseh_na_nashi_sovmestnye_seminary_s_kompaniey_qiagen/ )

Повестка дня:

Опыт секвенирования на платформе MinION от Oxford Nanopore Technologies в России из первых рук

Значение исследований метилирования генома на примере использования PyroMark Q48. Демонстрация прибора

Обзор автоматической пробоподготовки от компании 10x Genomics для платформы Illumina

Решения QIAGEN для работы со свободноциркулирующей ДНК, микро РНК, единичными клетками

Совместный курс по анализу данных нанопорового секвенирования от Skygen и Ksivalue

Обзор решений QIAGEN в области биоинформатики (CLC, HGMD, Ingenuity Variant Analysis)

Опытный пользователь расскажет о преимуществах работы с наборами NEBNext для создания библиотек для платформы Illumina


Дата и место:

28 мая 10.00-18.00, г. Москва, ул. Охотный ряд 2, подъезд 9, 5 этаж «Meeting Point»

31 мая 10.00-18.00, г. Казань, ул. Карла Маркса 6, гостиница "Center Hotel Kazan Kremlin"

6 июня 10.00-18.00, г. Санкт-Петербург, ул. Малая Морская 14, Отель "Petro Palace"

Зарегистрироваться на семинар и скачать программу можно на нашем сайте! ( http://www.skygen.com/novosti/priglashaem_vseh_na_nashi_sovmestnye_seminary_s_kompaniey_qiagen/ )



Картинки:
Прикреплённое изображение

yolo 11.04.2019 06:42
true religion jeans sale ( http://www.truereligion-jeanssale.us.com )
coach outlet store ( http://www.coachoutlet-stores.eu.com )
coach outlet online ( http://www.coachoutletonlinecoachoutlet.us.com )
cheap air jordans ( http://www.airjordans.us.com )
louis vuitton purses ( http://www.louis-vuitton-handbags.us.org )
kappa clothing ( http://www.kappaclothing.us )
polo ralph lauren outlet ( http://www.polooutlet.com.co )
louis vuitton outlet online ( http://www.louis-vuittonoutletus.us.com )
ugg outlet ( http://www.uggs--outlet.net )
coach outlet store ( http://www.coach-outletclearance.us.com )
louboutin outlet ( http://www.outletchristianlouboutin.us.com )
durant shoes ( http://www.kevindurantshoes.us )
ferragamo outlet ( http://www.ferragamooutletstore.net )
coach outlet online ( http://www.coachoutletonlinestore.ca )
fitflops ( http://www.fitflopssaleclearance.us.com )
moncler outlet online ( http://www.moncleroutlet.us.org )
cheap air jordans ( http://www.air-jordans.us.com )
pandora jewelry outlet ( http://www.pandorajewelryoutlet.name )
ralph lauren outlet ( http://www.ralphlaurenpolo-outlet.us.com )
air jordan ( http://www.cheap-jordans.us.com )
ubiq shoes ( http://www.ubiqshoes.us )
nike outlet store ( http://www.nikeoutlet.us.com )
adidas nmd r1 ( http://www.adidas-nmd.us.com )
adidas outlet online ( http://www.adidasoutlet.us.com )
michael kors outlet ( http://www.michaelkorsoutletclearance-online.us.com )
under armour shoes ( http://www.underarmouroutletclearance.com )
yankees jerseys ( http://www.newyorkyankeesjerseys.us )
kate spade outlet ( http://www.katespadeoutlets.net )
moncler ( http://www.moncleroutlets.us.org )
air jordan 3 ( http://www.jordan3.net )
phillies jerseys ( http://www.philadelphiaphilliesjerseys.us )
converse shoes ( http://www.converse-uk.me.uk )
louboutin outlet ( http://www.christianlouboutinoutletdiscount.us.com )
valentino ( http://www.valentinooutlet.us.com )
fivefingers shoes ( http://www.fivefingersshoes.us )
off white clothing ( http://www.offwhite.us.org )
ed hardy ( http://www.edhardy-clothing.us.com )
nike outlet ( http://www.nikeshoesoutlet.us.com )
adidas wings shoes ( http://www.adidas-wings.in.net )
celine outlet ( http://www.celine-outlet.us.com )
moncler pas cher ( http://www.monclerdoudounepascher.fr )
kendra scott ( http://www.kendrascottjewelrys.com )
coach outlet store ( http://www.coachoutletstoreclearance.us.com )
true religion outlet ( http://www.true-religionoutletstore.us.com )
hermes bags ( http://www.hermesbirkin.in.net )
juicy couture ( http://www.juicycoutureoutlet.us.com )
supreme clothing ( http://www.supremeclothinguk.co.uk )
christian louboutin sale ( http://www.christianlouboutinshoes.us.org )
adidas ultra boost ( http://www.ultraboosts.us.com )
christian louboutin shoes ( http://www.christianlouboutinoutletshoes.us.com )
gymshark sale ( http://www.gymshark.us.com )
balenciaga shoes ( http://www.balenciagasneaker.us.com )
air jordan uk ( http://www.airjordan-uk.org.uk )
fila shoes ( http://www.filashoes.us.com )
uggs outlet ( http://www.uggsoutletstoress.us.com )
coach factory outlet ( http://www.coachoutletonlinecoachfactory-outlet.us.com )
supra shoes ( http://www.suprashoes.us.com )
fitflops outlet ( http://www.fitflopsoutletsale.com )
fitflops sale clearance ( http://www.clearancefitflopssale.com )
oakley sunglasses outlet ( http://www.cheapoakleysunglassesofficial.us.com )
pandora jewelry ( http://www.pandorajewelryoutlet.us.com )
moncler outlet online ( http://www.moncler-outlet.us.com )
curry 4 shoes ( http://www.curry-4shoes.us.com )
ravens jerseys ( http://www.baltimoreravens.us.com )
kate spade outlet online ( http://www.kate-spadeoutlet.us.com )
air max pas cher ( http://www.nike-airmaxpascher.fr )
air max ( http://www.2017nikeairmax.us )
coach outlet clearance ( http://www.coachoutletclearance.us.com )
ugg outlet ( http://www.uggs-outlet.in.net )
true religion outlet store ( http://www.outlettruereligion.in.net )
minnesota vikings jersey ( http://www.minnesotavikingsjerseys.us.com )
jordan shoes for sale ( http://www.jordan-shoes.us.com )
adidas ultra boost ( http://www.ultraboost.us )
fjallraven backpack ( http://www.fjallravenbackpack.us.com )
louboutin outlet ( http://www.christianlouboutinoutletcl.us.com )
coach factory outlet online ( http://www.coach-factoryoutlets.us.com )
air max shoes ( http://www.2017nikeairmax.us )
adidas superstars ( http://www.adadassuperstar.com )
adidas outlet online ( http://www.adidas.us.com )
hermes belt ( http://www.hermesoutlets.us.com )
north face outlet online ( http://www.northfacejacket.us.com )
ray ban sunglasses outlet ( http://www.raybansunglassesoutlet.net.co )
gucci outlet online ( http://www.guccioutlets.us.org )
cheap mlb jerseys ( http://www.cheapmlbjerseysshop.us.com )
seattle seahawks jersey ( http://www.seattleseahawksjerseys.us.com )
kate spade outlet online ( http://www.katespadeoutletonline.us )
air max 2015 ( http://www.nike-airmax2015.us )
true religion outlet ( http://www.truereligionjeansoutlet.us.com )
fitflops ( http://www.clearancefitflopssale.com )
nfl jerseys ( http://www.cheapnfljerseysnike.us.com )
coach outlet store online ( http://www.coachoutlet-stores.us.org )
michael kors outlet clearance ( http://www.michaelkorsoutletfactorystore.us.com )
coach outlet online ( http://www.coach-onlineoutlet.us.com )
yeti tumbler ( http://www.yeticup.us.com )
coach outlet online ( http://www.coachoutletonline.us.org )
christian louboutin ( http://www.christianlouboutin-uk.co.uk )
true religion outlet store ( http://www.truereligionoutletclearance.us.com )
houston texans jerseys ( http://www.texansjerseys.us )
coach outlet online ( http://www.coachfactoryoutletonlinesale.us.com )
true religion jeans ( http://www.true-religion.org.uk )
true religion ( http://www.truereligionjeans-outlet.us.com )
mac cosmetics ( http://www.maccosmetics-uk.co.uk )
yeezy shoes ( http://www.adidas-yeezyshoes.us.com )
pandora charms outlet ( http://www.pandoracharms.us.com )
rolex watches ( http://www.rolexwatchesoutlet.us.com )
ugg outlet ( http://www.uggbootsoutlet.ca )
ferragamo belts ( http://www.ferragamobelts.com )
asics outlet ( http://www.asics.us.com )
nike sneakers ( http://www.nike-shoes.us.com )
christian louboutin outlet ( http://www.christianlouboutinoutlet.us.org )
uboutin shoes ( http://www.christianlouboutinshoes.org )
ugg ( http://www.ugg.co.nl )
chrome hearts outlet store ( http://www.chromeheartsoutletstore.com.co )
nike air max 2018 ( http://www.airmax-2018.com )
fila ( http://www.fila.us.com )
mbt shoes ( http://www.mbtoutlet.us.com )
coach outlet ( http://www.coachoutlet-store.us.org )
adidas neo shoes ( http://www.adidas-neo.us.com )
cheap jordan shoes ( http://www.jordan-shoes.us.com )
cheap nike shoes ( http://www.nikeshoes.us.com )
ralph lauren outlet ( http://www.poloralph.org )
kobe 12 ( http://www.kobe12.org )
coach factory outlet online ( http://www.coachfactoryoutletofficials.us.com )
revolution 3 ( http://www.nikerevolution3.us )
cheap air max ( http://www.airmaxoutletsaleus.com )
kobe shoes ( http://www.kobeshoes.us.com )
michael kors outlet online ( http://www.michaelkorsoutletshopping.us.com )
coach outlet store ( http://www.coachoutletstores.eu.com )
jets jersey ( http://www.newyorkjetsjersey.us )
coach factorty outlet online ( http://www.wwwcoachoutlet.us.com )
christian louboutin shoes ( http://www.christianlouboutinshoessale.org.uk )
yeezy boost 350 ( http://www.yeezyboost350sale.us.com )
lacoste outlet ( http://www.lacosteoutlet.us.org )
nike outlet store ( http://www.nike-store.us.com )
kate spade ( http://www.katespade-outlet.in.net )
coach outlet sale ( http://www.coachoutletclearancesale.us.com )
pandora charms sale clearance ( http://www.pandora-charms.us.org )
kate spade outlet online ( http://www.kate-spade.us.com )
versace clothing ( http://www.versaceclothing.com )
coach factory outlet online ( http://www.coachfactoryoutlet-onlinestore.us.com )
cubs jerseys ( http://www.chicagocubsjerseys.us )
pandora charms ( http://www.pandorajewelry.in.net )
coach handbags ( http://www.coachhandbagsoutlets.us.com )
true religion jeans ( http://www.true-religionjeans.in.net )
canada goose outlet ( http://www.canadagoose.name )
broncos jerseys ( http://www.denverbroncosjerseys.us )
giuseppe zanotti outlet store ( http://www.giuseppe-zanotti-outlet.org )
le coq sportif ( http://www.lecoqsportifshoes.us.com )
prada outlet ( http://www.pradaoutlet-store.us.com )
adidas yeezy boost ( http://www.yeezyboost.us.org )
salvatore ferragamo shoes ( http://www.ferragamoshoes.us )
converse shoes ( http://www.converseuk.org.uk )
columbia outlet store ( http://www.columbiaoutlet-store.com )
giuseppe zanotti shoes ( http://www.giuseppe-zanotti.us.com )
nike air force ( http://www.nikeairforce1.net )
ed hardy outlet ( http://www.edhardyoutlet.us )
ralph lauren outlet ( http://www.pololaurenoutlet.us.com )
coach outlet online ( http://www.coach-outletonlines.us.com )
coach outlet online ( http://www.coach.us.com )
snapback hats ( http://www.snapbackhats.us.com )
coach factory outlet ( http://www.coach.us.com )
coach outlet online ( http://www.coachoutlet.us )
kyrie 2 ( http://www.nikekyrie2.com )
nike outlet ( http://www.nikeoutletfactory.us.com )
coach handbags outlet ( http://www.coachhandbagsoutlets.us.com )
canada goose ( http://www.canadasgooseoutlet.us.com )
philipp plein outlet ( http://www.philipppleinshirt.com )
oakley sunglasses wholesale ( http://www.oakley-sunglasseswholesale.us.com )
pandora sale clearance ( http://www.pandoracharmssale-clearance.us.com )
hermes outlet store ( http://www.hermesoutletstore.us.com )
coach outlet online ( http://www.coachoutletstoreonlineofficial.us.com )
ralph lauren outlet online ( http://www.ralphlaurenoutletonlinestore.us.com )
pandora charms outlet ( http://www.pandora-charms.us.org )
coach outlet online ( http://www.coachoutletsaleonline.us.com )
ralph lauren outlet ( http://www.poloralphlaurensoutlet.us.com )
celine outlet ( http://www.outlet-celine.com )
coach factory outlet ( http://www.coachoutlet-factory.us.com )
prada outlet ( http://www.pradaoutlets.com )
coach outlet ( http://www.coachoutletonlinecoachfactory-outlet.us.com )
the north face jackets ( http://www.northfacejacket.us.com )
louboutin outlet ( http://www.louboutinshoes.in.net )
yeezy shoes ( http://www.yeezyboost.us.com )
cheap maui jim sunglasses ( http://www.maujimsunglasses.us.com )
cheap mlb jerseys ( http://www.mlbjerseyscom.us.com )
ugg boots sale ( http://www.uggbootssale.ca )
adidas slides ( http://www.adidasslides.us.com )
persol sunglasses sale ( http://www.persolsunglasses.us )
moncler jackets ( http://www.us-coatsjackets.com )
moncler jacka ( http://www.monclerdunjacka.se )
cardinals jerseys ( http://www.arizonacardinalsjersey.us )
ralph lauren uk ( http://www.ralphlauren-outlet.me.uk )
stone island sale ( http://www.stoneisland.us.com )
moncler jackets ( http://www.moncler.eu.com )
hydro flask sale ( http://www.hydroflask.us.com )
louboutin shoes ( http://www.christianlouboutinoutlet.us )
coach factory outlet online ( http://www.coachfactory-outlet.us.com )
moncler outlet online ( http://www.moncleroutlets.us.org )
coach factory outlet online ( http://www.coachfactory-outletonline.in.net )
nike outlet store ( http://www.nikestores.us )
cheap snapbacks ( http://www.cheapsnapbacks.us )



fsdfsdffag 19.11.2019 11:55
дасфасфдсфф



Roger G Nelms 27.12.2019 15:14
Found your post interesting to read. I cant wait to see your post soon. Good Luck for the upcoming update.This article is really very interesting and effective. WE have developed this Timer Digital Clock ( https://www.gamerlaunch.com/community/users/blog/5326073/1924456/the-10-best-workout-apps-to-get-in-shape/?gid=535 ) for setting countdown



guest: melisa 06.02.2020 07:37
http://revistas.uned.es/index.php/accionps...69/19392/182821 ( http://revistas.uned.es/index.php/accionpsicologica/comment/view/22169/19392/182821 )

https://bandaronlineterpercaya.landen.co ( https://bandaronlineterpercaya.landen.co )
http://pastiuntung88.us.com/ ( http://pastiuntung88.us.com/ )
http://liveresultsgphk.xyz/ ( http://liveresultsgphk.xyz/ )
http://blogaudy.xyz ( http://blogaudy.xyz )
http://infodewi.xyz ( http://infodewi.xyz )
http://poker007.us.com ( http://poker007.us.com )
http://www.pastiuntung99.us.com ( http://www.pastiuntung99.us.com )
http://pasangtogelwap.xyz ( http://pasangtogelwap.xyz )
http://carapasangnomor.xyz ( http://carapasangnomor.xyz )
https://dewauno.com ( https://dewauno.com )



joanmelda 06.02.2020 11:02
Custom Writing Services has become a significant challenge owing to the complexity of these Custom Research Paper Writing Services and in other cases lack of time and knowledge needed to complete Custom Coursework Writing Services.
https://topessaywriting.com/ ( https://topessaywriting.com/ )



frangky 23.02.2020 15:46
http://bit.ly/2STb4l2 ( http://bit.ly/2STb4l2 )
http://bit.ly/39PJ3Rg ( http://bit.ly/39PJ3Rg )
http://bit.ly/3c2GVri ( http://bit.ly/3c2GVri )
http://bit.ly/3c3QLJc ( http://bit.ly/3c3QLJc )
http://bit.ly/2vbrXOV ( http://bit.ly/2vbrXOV )
http://bit.ly/3c1jlLp ( http://bit.ly/3c1jlLp )
http://bit.ly/2SRRVjC ( http://bit.ly/2SRRVjC )
http://bit.ly/32lwbzN ( http://bit.ly/32lwbzN )
http://bit.ly/2vVx8CI ( http://bit.ly/2vVx8CI )
http://bit.ly/3bYYVTj ( http://bit.ly/3bYYVTj )
http://bit.ly/37QWAqb ( http://bit.ly/37QWAqb )
http://bit.ly/2T43P8W ( http://bit.ly/2T43P8W )
http://bit.ly/38VWr68 ( http://bit.ly/38VWr68 )
http://bit.ly/2T6NsIO ( http://bit.ly/2T6NsIO )
http://bit.ly/3bXVbBr ( http://bit.ly/3bXVbBr )
http://bit.ly/37SgVeS ( http://bit.ly/37SgVeS )
http://bit.ly/2VehjSj ( http://bit.ly/2VehjSj )
http://bit.ly/39YWFK4 ( http://bit.ly/39YWFK4 )
http://bit.ly/2SQSr19 ( http://bit.ly/2SQSr19 )
http://bit.ly/2TelkUi ( http://bit.ly/2TelkUi )
http://bit.ly/3c3YaIz ( http://bit.ly/3c3YaIz )
http://bit.ly/2vXpM1w ( http://bit.ly/2vXpM1w )
http://bit.ly/32irFlH ( http://bit.ly/32irFlH )
http://bit.ly/2HRNWgs ( http://bit.ly/2HRNWgs )
http://bit.ly/2wFJuzj ( http://bit.ly/2wFJuzj )
http://bit.ly/37QX5k3 ( http://bit.ly/37QX5k3 )
http://bit.ly/2T6FUpw ( http://bit.ly/2T6FUpw )
http://bit.ly/3a1Mswb ( http://bit.ly/3a1Mswb )
http://bit.ly/2VbbdlH ( http://bit.ly/2VbbdlH )
http://bit.ly/32ids8a ( http://bit.ly/32ids8a )



цукен 15.04.2020 17:45
цукенр


เร่ง การทำงานของระบบเผาผลาญไขมัน ( http://keone.instbroker.com ).
Лучшие ПАРФЮМЫ ( http://parfumes-ru.instbroker.com ).

ELIMINA LE TOSSINE E LE SCORIE DOPO 1 CICLO, CONSERVANDO VITAMINE E MICROELEMENTI BENEFICHE ( http://detoxionis-italy.discountsale.xyz ).
L’ALITOSI E’ CAUSATA DALLA PRESENZA DI PARASSITI NEL CORPO! ( http://detoxionis-italy-pr.discountsale.xyz ).

Zad ( http://testoultra-za.discountsale.xyz ).
ผลิตภัณฑ์เพื่อผู้ชายรักสุขภาพและ ใส่ใจในสมรรถภาพ เพื่อสร้างความประทับใจให้คนที่คุณรัก ( http://fun.denisyakovlev.moscow/ace/1/?lnk=67880 ).

ลดน้ำหนัก ได้เป็น 2 เท่า ( http://slimingo-thailand.discountsale.xyz ).
สาวออฟฟิศโดนล้อว่าอ้วน จนน้ำหนักลด 22.6 กิโล!! ( http://slimingo-thailand-pr.discountsale.xyz ).

Prost Performex ( http://prostperformex.instbroker.com ).


Поиск и бронирование дешёвых авиабилетов и отелей ( http://aviasales.polyannka.ru ).
GEL ÎMPOTRIVA DURERII ARTICULARE ( http://kma.betaholding.ru/5uIuLL/?PageSpeed=off&channel=5uIuLL&click=286576111&lang=ro ).

ГЕЛ СРЕЩУ СТАВНИ БОЛКИ ( http://kma.betaholding.ru/5uIuLL/ ).
Дрон ( https://www.youtube.com/watch?v=BaRjkINFZqk ).

Умный квадрокоптер управляемый жестами ( http://handoperated.instbroker.com ).
Евгений Черняк ( https://www.instagram.com/p/B9YogxhIAfW/ ).

Aroma único de cáñamo reduce el apetito y mejora el estado de ánimo ( http://kanabialica-es.instbroker.com ).
Complesso brucia grassi con CBD ( http://kanabialica-it.instbroker.com ).

+

Духи ( http://dyhi.instbroker.com ).
КуМит видеочат с девушками онлайн ( https://coomeet.com/?id=15832446993318 ).

LAS VARICES LA SALUD Y LA BELLEZA Y LA SALUD DE SUS PIERNAS ( http://variconis-spain.official-variconis.com ).
Cómo deshacerse de las varices en una semana ( http://variconis-spain.clicksoffers.com ).

+

Eco Calm - Chữa trị dứt điểm vẩy nến, chàm, viêm da tiếp xúc ( http://ecocalm-vn.instbroker.com ).
Купить Набор для отбеливания зубов Luma Smile ( http://lumasmile.instbroker.com ).

Онлайн ( http://polyannka.online ).
Polyannka ( https://polyannka.ru ).
Блог ( https://blog.polyannka.ru ).

partner ( http://salon68.ru/partner.html ).
Партнерская программа Альфа-Банка ( https://alfapartners.alfabank.ru/ref/7992 ).
Capitalist - все платежные системы под одной крышей ( https://capitalist.net/site/registration/from/0c529b4b41 )

Умный кошелек ( http://smartwalleet.instbroker.com ).
Умный ортез для лечения колена ( http://genutrain.instbroker.com ).

Передовая американская технология при диабете 2 типа ( http://diaprin.ev.nickyfora.ru ).
Диета при сахарном диабете ( http://diaprin-pr.ev.nickyfora.ru ).

+

Helmina ฟื้นฟูจุลินทรีย์ในลำไส้ ช่วยในการขับถ่ายพยาธิ และ ลดหน้าท้อง ( http://helmina.discountsale.xyz ).
ชาวไทยหลายพันคนต้องทุกข์ทรมาณกับโรคพยาธิในทุกๆวัน จะมีใครยื่นมือเข้าช่วย ( http://helmina-pr.discountsale.xyz ).

ผลิตภัณฑ์อาหาร เสริมลดน้ำหนัก ( http://bionica-thailand.rocket.denisyakovlev.moscow ).

ฉันลดน้ำหนักได้ 34 กิโลกรัมในสองเดือนได้ยังไง ( http://bionica-thailand22.ev.nickyfora.ru ).
สูตรการรักษานวัตกรรมใหม่เพื่อการลดน้ำหนัก ( http://bionica-thailand22-pr.ev.nickyfora.ru ).

ช่วยให้การลดน้ำหนักเป็นเรื่องง่าย ( http://bionica-thailand.ev.nickyfora.ru ).
ธีการลดน้ำหนักอย่างง่ายดาย ลด ( http://bionica-thailand-pr.ev.nickyfora.ru ).

+


Creme zur Beseitigung der Papillome ( http://keraderm-de.ev.nickyfora.ru ).
Creme zur Beseitigung der Papillome ( http://keraderm-de-pr.ev.nickyfora.ru ).

Привет ( http://webxlove.ru ).
Web x love online ( http://webxlove.online ).

อันดับหนึ่ง ช่วยในการ ต้านพยาธิ ฟื้นฟูจุลชีพที่ดีในลำไส้ ( http://verantel-th.rocket.denisyakovlev.moscow ).
กลิ่นปากเป็นสัญญาณแรกของปรสิต ( http://verantel-th-pr.rocket.denisyakovlev.moscow ).

История дня ( https://www.youtube.com/watch?v=czkR6dlrSHs ).
Кофейня Тамбов ( http://coffee.salon68.ru ).

Получайте кэшбэк с покупок в мобильном приложении ( https://backit.me/ru/cashback/app?inviter=a8d68 ).
Кэшбэк за покупки ( https://backit.me/ru/cashback?inviter=a8d68 ).

+

Pokud Vás trápí bolest v kloubech, zbavte se ji za 30 dní pomocí Arthrolon ( http://arthrolon-cz.ev.nickyfora.ru ).
Jak jsem se zbavil osteochondrózy a běžel jsem maraton ( http://arthrolon-cz-pr.ev.nickyfora.ru ).

Купить руны ( http://amulet-runy.ev.nickyfora.ru ).
Экстрасенс Хаял Алекперов ( http://amulet-runy-pr.ev.nickyfora.ru ).

Лечение вальгусной деформации большого пальца стопы ( http://valgulex-ru.ev.nickyfora.ru ).
Косточка больше не проблема ( http://valgulex-ru-pr.ev.nickyfora.ru ).

Psorilin ( http://psorilin-lithuania.official-psorilin.com ).
Psorilin ( http://psorilin-lithuania-pr.clicksoffers.com ).

SOLLI - การลดน้ำหนักที่ประสบความสำเร็จ ( http://solli1.discountsale.xyz ).
สูตรการรักษานวัตกรรมใหม่เพื่อการลดน้ำหนัก ลด 15 กก ( http://solli-pr.discountsale.xyz ).

Агентство недвижимости ( http://realty.betaholding.ru ).
Недвижимость в Москве покупка продажа ( http://realty.realityboy.ru ).

MILK SKIN krim pemutih muka ( http://milkskin-id.ev.nickyfora.ru ).
Cara memutihkan kulit dan menjadikannya SEMPURNA ( http://milkskin-id-pr.ev.nickyfora.ru ).

Penyembuhan total dari varises dalam 30 hari ( http://varius-id.ev.nickyfora.ru ).
Caraku Melenyapkan Varises Dalam 1 Bulan ( http://varius-id-pr.ev.nickyfora.ru ).

++

Odstraňuje komplikace a usnadňuje život diabetikům ( http://dialine-cz.ev.nickyfora.ru ).
Diabetes je vražedná nemoc ( http://dialine-cz-pr.ev.nickyfora.ru ).

Elimina le complicazioni e facilita la vita con il diabete ( http://dialine-it.ev.nickyfora.ru ).
Ragazze, aiutatemi, mi hanno diagnosticato il diabete ( http://dialine-it-pr.ev.nickyfora.ru ).

Подводная видеокамера ( http://calypso.otzyv-dostavka.ru ).

Портативные проекторы ( http://cinemood.otzyv-dostavka.ru ).
Kanabialica ( http://kma.betaholding.ru/qUF2Af/ ).
เสริมสมรรถภาพเพศชายด้วย Hooligan ( http://hooligan19.rocket.denisyakovlev.moscow ).
อายุ 65 แต่สมรรถภาพบนเตียงยังแข็งแรงเหมือนเด็ ( http://hooligan19pr20.rocket.denisyakovlev.moscow ).

Keto Garcinia Pure Diet ( http://ketogarcinia.lead.denisyakovlev.ru ).

การปฏิวัติการรักษาโรคระบบประสาทอักเส ( https://vk.com/video-81273376_456239017 ).
Uretroactive ( http://uretroactive-thailand.discountsale.xyz ).
Uretroactive ( http://uretroactive-thailand-pr.discountsale.xyz ).
Подписаться Козерог ( https://s.likee.video/live/share/profile_60334282_593157148?c=cp&b=377523122&l=ru&t=0 ).


Fórmula exclusiva Para la salud y belleza de tus piernas ¡ADIÓS VARICES! ( http://nicetofit.online/varius-es/ ).
una toccasana per le vene varicose prodotta seguendo le antiche ricette ( http://nicetofit.online/varius-it/ ).
Schmerzen in den Gelenken ( http://nicetofit.online/artrolon/ ).

Intoxic - una solucion fiable contra los parasitos y helmintos ( http://nicetofit.online/intoxic-es/ ).
Intoxic - é uma solução segura contra parasitas e vermes ( http://nicetofit.online/intoxic-pt/ ).
Az Intoxic - megbízható készítmény az élősködők ellen ( http://nicetofit.online/intoxic-hu/ ).

++

цукено



juragan 25.04.2020 12:25
Even for some special cases, there are websites
https://bit.ly/2KybecO ( https://bit.ly/2KybecO ) that successfully appear on the first page of Google, with (only) regularly publishing articles written SEO friendly.



Granite Male Enhancement - By Us 29.07.2020 09:30
Granite Male Enhancement In spite of the fact that there's no ensured sheltered and viable approach to broaden your penis, there are a couple of things you can do in case you're worried about your penis size. Speak with your accomplice. It might be difficult to end old propensities or to talk about sexual inclinations with your accomplice. Be that




https://www.offer4cart.com/granite-male-enhancement/ ( https://www.offer4cart.com/granite-male-enhancement/ )



http://www.advisoroffer.com ( http://www.advisoroffer.com )


http://myfitnessclubb.com ( http://myfitnessclubb.com )



Alia 19.09.2020 08:48
My rather long internet look up has at the end of the day been compensated with pleasant insight to talk about with my family and friends. service web design ( https://www.just99webdesign.com )



guest: Harish 28.09.2020 13:54
http://civilwhore.com ( http://civilwhore.com )
http://tiamargaritasf.com ( http://tiamargaritasf.com )
http://toysfromthe90s.com ( http://toysfromthe90s.com )
http://yarbroughandpeoples.com ( http://yarbroughandpeoples.com )
http://mcafeesupports.org ( http://mcafeesupports.org )
http://ipinewsinnovation.org ( http://ipinewsinnovation.org )
http://bayoccupride.com ( http://bayoccupride.com )
http://supermarioremix.com ( http://supermarioremix.com )
http://igalaxys8samsung.com ( http://igalaxys8samsung.com )
http://crogansmontclair.com ( http://crogansmontclair.com )



Nilan 28.09.2020 14:09
enteratecaracas.com
saveamericascinemas.org
independent-candidate.org
wallpaperzhd.com
supportemailservice.com
flickeringcolours.net
sillyplace.net
progressivenationwnc.org
emptylungs.com
noelsmoviereviews.com
alhamrarestaurant.net
jezebelsoho.com
commonsensenms.com



Nilan 28.09.2020 14:13
http://enteratecaracas.com ( http://enteratecaracas.com )
http://saveamericascinemas.org ( http://saveamericascinemas.org )
http://independent-candidate.org ( http://independent-candidate.org )
http://wallpaperzhd.com ( http://wallpaperzhd.com )
http://supportemailservice.com ( http://supportemailservice.com )
http://flickeringcolours.net ( http://flickeringcolours.net )
http://sillyplace.net ( http://sillyplace.net )
http://progressivenationwnc.org ( http://progressivenationwnc.org )
http://emptylungs.com ( http://emptylungs.com )
http://noelsmoviereviews.com ( http://noelsmoviereviews.com )
http://alhamrarestaurant.net ( http://alhamrarestaurant.net )
http://jezebelsoho.com ( http://jezebelsoho.com )
http://commonsensenms.com ( http://commonsensenms.com )



Sanjay 28.09.2020 14:22
https://saveamericascinemas.org ( https://saveamericascinemas.org )
http://www.progressivenationwnc.org ( http://www.progressivenationwnc.org )
http://olbermann.org ( http://olbermann.org )
https://vinhomesnguyentraicity.com ( https://vinhomesnguyentraicity.com )
https://tr4ceflow.com ( https://tr4ceflow.com )
https://beartrapcafe.com ( https://beartrapcafe.com )



Kavi 05.10.2020 14:15
http://www.nude-celebs.info/ ( http://www.nude-celebs.info/ )
http://healmyass.com/ ( http://healmyass.com/ )
http://www.apostoliccm.com/ ( http://www.apostoliccm.com/ )
http://www.yumenokuni.net/ ( http://www.yumenokuni.net/ )
http://www.so-sexy.net/ ( http://www.so-sexy.net/ )
http://www.sexyspiritualrelationships.com/ ( http://www.sexyspiritualrelationships.com/ )
http://www.adult-sex-pictures.org/ ( http://www.adult-sex-pictures.org/ )
http://www.directory-porno.net/ ( http://www.directory-porno.net/ )
http://www.community-mysexbay.net/ ( http://www.community-mysexbay.net/ )
http://www.incestpornxxx.com/ ( http://www.incestpornxxx.com/ )
http://www.milfsodomie.com/ ( http://www.milfsodomie.com/ )
http://www.sexentrenous.com/ ( http://www.sexentrenous.com/ )
http://www.stepbystepbiggerpenis.com/ ( http://www.stepbystepbiggerpenis.com/ )
http://cinemasecondsexe.com/ ( http://cinemasecondsexe.com/ )
http://www.x-nudism.net/ ( http://www.x-nudism.net/ )



guest: Vini 05.10.2020 14:41
http://www.blondegrosseins.net/ ( http://www.blondegrosseins.net/ )
http://www.hot-kiev.com/ ( http://www.hot-kiev.com/ )
http://www.freeporntubex.net/ ( http://www.freeporntubex.net/ )
http://www.sexshopsepeti.biz/ ( http://www.sexshopsepeti.biz/ )
http://www.xpornofilmm.org/ ( http://www.xpornofilmm.org/ )
http://calderosex.com/ ( http://calderosex.com/ )
http://www.freesexjapanda.com/ ( http://www.freesexjapanda.com/ )
http://www.phimsexmienphi.com/ ( http://www.phimsexmienphi.com/ )
http://www.sexmoviesgalleries.com/ ( http://www.sexmoviesgalleries.com/ )
http://www.adult-engine-search.com/ ( http://www.adult-engine-search.com/ )
http://www.adult-erotic-guide.net/ ( http://www.adult-erotic-guide.net/ )
http://sexvideos-japanese.com/ ( http://sexvideos-japanese.com/ )
http://www.sexylizard.org/ ( http://www.sexylizard.org/ )
http://www.adultfilmcrew.org/ ( http://www.adultfilmcrew.org/ )
http://www.adultxxxdaily.com/ ( http://www.adultxxxdaily.com/ )



guest: sam 05.10.2020 15:00
http://www.freemyforumadult.com/ ( http://www.freemyforumadult.com/ )
http://www.pornwiththemostlikes.com/ ( http://www.pornwiththemostlikes.com/ )
http://www.blacksfatswomensex.net/ ( http://www.blacksfatswomensex.net/ )
http://www.pornvideoclips.net/ ( http://www.pornvideoclips.net/ )
http://www.blueporncorner.com/ ( http://www.blueporncorner.com/ )
http://www.fucktubesex.net/ ( http://www.fucktubesex.net/ )
http://www.idealmaturesex.com/ ( http://www.idealmaturesex.com/ )
http://www.sexythumbnailgalleries.com/ ( http://www.sexythumbnailgalleries.com/ )
http://www.sexondisco.com/ ( http://www.sexondisco.com/ )
http://www.sexyslutgirls.com/ ( http://www.sexyslutgirls.com/ )
http://www.jamievalentine.org/ ( http://www.jamievalentine.org/ )
http://www.mes-pornos.com/ ( http://www.mes-pornos.com/ )
http://12pornosites.com/ ( http://12pornosites.com/ )
http://9buckteensex.com/ ( http://9buckteensex.com/ )
http://airsex.info/ ( http://airsex.info/ )



Kalai 06.10.2020 07:50
http://all-porn-review.com/ ( http://all-porn-review.com/ )
http://elena-sex-player.info/ ( http://elena-sex-player.info/ )
http://european-sex.info/ ( http://european-sex.info/ )
http://freesexlinkexchange.com/ ( http://freesexlinkexchange.com/ )
http://milfspornfree.com/ ( http://milfspornfree.com/ )
http://mybeautifulsexlife.com/ ( http://mybeautifulsexlife.com/ )
http://pornsitetips.com/ ( http://pornsitetips.com/ )
http://porno-filmovi24.com/ ( http://porno-filmovi24.com/ )
http://pspporntube.com/ ( http://pspporntube.com/ )
http://mister-sexe-gratuit.com/ ( http://mister-sexe-gratuit.com/ )
http://wildpornreview.com/ ( http://wildpornreview.com/ )
http://wildpornreview.com/ ( http://wildpornreview.com/ )
http://black-sex-links.net/ ( http://black-sex-links.net/ )
http://www.candidladies.com/ ( http://www.candidladies.com/ )



Somu 12.10.2020 14:49
I ‘d mention that most of us visitors are endowed to exist in a fabulous place with very many wonderful individuals with very helpful things. ufa ( http://1ufabet.com )



guest: Peter 26.10.2020 13:18
I am commenting to let you know what a terrific experience my daughter enjoyed reading through your web page. She noticed a wide variety of pieces, with the inclusion of what it is like to have an awesome helping style to have the rest without hassle grasp some grueling matters.fashion blog ( http://www.luxehappens.com/ )



Looney 27.10.2020 09:26
great site. glad i found this. who here is interested in fence company lubbock ( https://fencecompanylubbock.com/ )??



Geek 29.10.2020 15:36
I’d love to be a part of group where I can get advice from other experienced people that share the same interest. If you have any recommendations, please let me know. Thank you.hunting ( https://outdoorfiend.com/ )



seoGeek 16.11.2020 08:16
You truly did more than visitors’ expectations. Thank you for rendering these helpful, trusted, edifying and also cool thoughts on the topic to Kate.Patco Construction Services in Maine ( https://patco.com/ )



Guest 17.11.2020 11:48
You truly did more than visitors’ expectations. Thank you for rendering these helpful, trusted, edifying and also cool thoughts on the topic to Kate.Money Management Tips ( https://www.weblogright.com/ )



Guest 24.11.2020 12:03
Some us know all relating to the compelling medium you present powerful steps on this blog and therefore strongly encourage contribution from other ones on this subject while our own child is truly discovering a great deal. Have fun with the remaining portion of the year.hundfein ( https://www.hundfein.com )



thomaslist 20.12.2020 12:21
Поло Ралпх Лаурен Нещ Ёрк Дисцоунт ( https://www.poloralphlaurenbusiness.com )
Голден Гоосе Хи Стар ( https://www.goldengoosesshoessale.com )
Ралпх Лаурен Дощн Яцкетс Фацторы Оутлет ( https://www.ralphlaurenponyoutlet.com )
Нике Аир Мах Плус УСА Фашион ( https://www.airmax-97.us.com )
Оутлет Нике Аир Ёрдан 1 УСА ( https://www.specialairshoes.com )
УК Онлине Ралпх Лаурен ( https://www.poloralphlaurenpolo.uk.com )
Нике Аир Ёрдан УСА ( https://www.airjordan4.us.com )
Цоач Щаллетс Оутлет УСА ( https://www.bestcoach.top )
Голден Гоосе Хи Стар Сале Италы ( https://www.ggdbitaly.com )
Онлине Адидас Ултра Сторе ( https://www.newboostoutlet.com )
Кате Спаде Хандбагс ( https://www.katespademore.com )
Лощест Прице ЕД Харды Т Ширтс ( https://www.deepedhardy.com )
Еуропе Соццер Эрсейс ( https://www.atlanticsoccerjersey.com )
Пандора Рингс ( https://www.bestpandoraoutlet.com )
Ралпх Лаурен Оутлет Онлине УСА ( https://www.ralphlaurenworldwide.com )
Ралпх Лаурен Поло оутфит фор щомен ( https://www.atlanticpolo.co.uk )
Цоач Оутлет финест селецтион ( https://www.coachoutlet-handbags.com )
Ралпх Лаурен Цлассиц Полос ( https://www.poloralphlaurenproducts.com )
Цоач Хандбагс Щхолесале УК ( https://www.coachoutlet.org.uk )
Буы Чеап Поло Ралпх Лаурен Хоодиес Онлине ( https://www.polorlpony.com )
Нещ Ёрк Адидас Боост Сале ( https://www.adidasmix.com )
Ед Харды Тигер Татто Хоодиес ( https://www.edhardy.us.org )
Топ Бранд НФЛ Эрсейс ( https://www.nfljerseybrand.com )
Саве Уп Пандора Брацелетс ( https://www.pandoralovely.com )
УС Менс Нике Кобе Шоес ( https://www.pacificsneakers.com )
Ралпх Лаурен Щхите Блацк ( https://www.ralphlaurenpopular.com )
Нике СБ Шоес Цоол Блацк ( https://www.buynicenike.com )
Бест Щоменьс Хоган Шоес Онлине ( https://www.scarpehogans.it )
Дисцоунт Адидас НМД Оутлет ( https://www.bestadidasstore.com )
Дисцоунт Кате Спаде Сатчел ( https://www.katespadeoriginals.com )
Супреме Оутлет Сингапоре ( https://www.supremeny.us.com )
чеап биг Поло Ралпх Лаурен ( https://www.polooutlets.uk )
Щхолесале онлине Саломон Руннинг Шоес ( https://www.salomonfrance.com )
цоач цроссбоды десигнер ( https://www.coach-factoryoutletstore.com )
Онлине Саломон Сторе ( https://www.salomonshoes.top )
Нике Аир Ёрдан 1 ( https://www.nikediscount.top )
Адидас Продуцтс Ин Щхите Блацк ( https://www.adidasrealboost.com )
Палаце Скатебоард Хоодиес Щхите ( https://www.palace.us.com )
щхолесале прице цоач ( https://www.coachfactory-outlet.com )
Хоме Нике Аир Ёрдан Лощ УК ( https://www.airjordanshoes.in.net )
Лове Киллс Слощлы Т Ширтс ( https://www.edhardys.us )
Нике Аир Форце 1 Гифт ( https://www.justinairmax.com )
Чампион Яцкетс Лого ( https://www.championoutlet.us.com )
Пандора Промотионс ( https://www.pandorashine.net )
Цоач Хандбагс УК Шоп ( https://www.coachfactory.uk )
Пандора Рингс Оутлет ( https://www.usapandorauk.com )
Поло Ралпх Лаурен Хот Сале ( https://www.atlanticralphlauren.com )
Аутхентиц Адидас Дисцоунт Оутлет ( https://www.adidas.in.net )
Пинк Адидас Суперстар ( https://www.authentic-boost.com )
Аир Ёрдан Хигх Ред Буле ( https://www.airjordanmid.com )
Буы Хигх Яуалиты Нике Аир Мах ( https://www.airmaxsurprise.com )
Ед Харды Т Ширтс УСА ( https://www.lovekillsslowly.us )
Аир Ёрдан Мид Онлине ( https://www.cheap-jordansshoes.us.com )
Ралпх Лаурен Ыеллощ Ред ( https://www.polooutlet.us.com )
Бест Адидас НМД Боост Онлине ( https://www.authenticadidas.com )
Денмарк Адидас НМД Боост ( https://www.adidas-nmds.us.com )
Аир Ёрдан Блацк Анд Ыеллощ ( https://www.usaairshoesuk.com )
Пандора Блацк Фридаы Оутлет Онлине Сторе ( https://www.atlanticpandora.com )
Поло Ралпх Лаурен Аутхоризед Сите ( https://www.polooutletstore.us.org )
пинк Цоач Щоменс ( https://www.coach-bags.org )
Денмарк Адидас НМД Боост ( https://www.topadidasoutlet.com )
Нещ Ёрк Нике Аир Ёрдан ( https://www.atlanticairjordan.com )
Адидас Немезиз Сторе Онлине ( https://www.multigroundboots.com )
Голден Гоосе Хи Старс ( https://www.goldengoosesneakers.top )
Супреме Сторе Но Тах ( https://www.supremeclothingonline.us.com )
Щхите УК Пандора Еаррингс ( https://www.pandoraclassic.com )
НФЛ Эрсейс 0 ( https://www.atlanticjerseys.com )
Голден Гоосе Щоменс Сале ( https://www.goldengoosestar.net )
УС Оутлет Голден Гоосе Суперстар ( https://www.authenticgoldengoose.com )
Пандора Гифтс Амазинг Селецтион ( https://www.pandorahearts.us.com )
Нике Аир Мах Щхолесале Онлине УСА ( https://www.atlanticairmax.com )
Чампион Фрее Шиппинг ( https://www.champions.us.com )
Поло Ралпх Лаурен Менс Цлотхинг ( https://www.bestpoloralphlauren.org )
Ед Харды Беач Пантс Дисцоунт ( https://www.edhardy.org.uk )
ЕД Харды Шоппинг ( https://www.edhardysoriginals.com )
Чина Нике Аир Мах 90 Чеап ( https://www.nikeoutletsfactory.us.com )
Ларге Дисцоунт Поло Ралпх Лаурен ( https://www.polooutletsfactorystore.us.com )
Саломон Спеедцросс Фашион Десигнс ( https://www.salomonshoes.in.net )
Блацк Щхите ОФФ Щхите ( https://www.offwhitetshirt.us.com )
Ралпх Лаурен Сале Ретаилер ( https://www.ralphlaurencolourful.com )
Саломон Руннинг Шоес ( https://www.salomon-speedcross.com )
Хоган Платформс Италы Фацторы Оутлет ( https://www.atlantichogan.com )
Ед Харды Хоодиес ( https://www.edhardyoriginals.top )
Нике Блазер Буы Щхите ( https://www.jordanshoesforsale.us.com )
Нике Аир Ёрдан Блацк ( https://www.topairjordan.net )
Цоач Щаллетс оутлет онлине оффициал ( https://www.coachclassic.net )
Дисцоунт ЕД Харды ( https://www.edhardysurprise.com )
Кате Спаде Хандбагс ( https://www.katespadestyle.com )
Чеапест Ралпх Лаурен Дрессес ( https://www.ralphlaurenorder.com )
Офф Щхите Хоодиес Топ Десигнер ( https://www.off-whiteitaly.com )
Нике Аир Мах 97 Онлине Шоппинг ( https://www.nike-factory.us.com )
Ларгест Адидас Ыеезы Боост Цоллецтион ( https://www.superstaradidas.us.com )
Поло Ралпх Лаурен Оффициал Щебсите Дисцоунт ( https://www.poloralphlaurensport.com )
Поло Ралпх Лаурен Бы Фрее Шиппинг ( https://www.prloutletclothing.com )
Эрсей Соццер ( https://www.soccerjerseyspecial.com )
Нике Аир Мах Щхите Блацк ( https://www.air-max2018.us.com )
Поло Ралпх Лаурен Плус Сизе ( https://www.poloralphoutlet.us.com )
Цоач Шоулдер Фор Щомен ( https://www.atlanticcoach.co.uk )
Пандора Еаррингс ( https://www.pandorabrand.us )
Нике Кырие Шоес УС Саве Офф ( https://www.nikeshoesoutlet.us.org )
Поло Ралпх Лаурен Плус Сизе ( https://www.poloralphlaurenbrand.com )
Адидас Ыеезы Боост Фор Мен ( https://www.adidasyeezyboost-350.us.com )
Кате Спаде Бацкпацк ( https://www.katespadenew.com )
Оффициал Адидас Ыеезы Боост Онлине Щебсите ( https://www.adidasoriginals.in.net )
Нике Шоес Юст Фор Ёу ( https://www.jordanshoes.in.net )



thomaslist 20.12.2020 12:22
wink.gif wink.gif wink.gif wink.gif wink.gif wink.gif wink.gif



guest: gogoanime 03.01.2021 13:17
watch all anime only on gogoanime ( https://gogoanimeapp.net/ )gogoanime



kissanime 03.01.2021 13:18
You can also watch anime at kissanime



kissanime 03.01.2021 13:19
watch anime at kissanime ( https://kissanime9.net/ )kissanime



안전놀이 05.01.2021 04:06
I saw your writing very well. It seems like there is a lot of useful information. I want to give you good information, so I hope you visit my website and get good information. Please make sure to visit us. Thank you.
안전놀이터 ( https://strackattack.com )



메이저놀 05.01.2021 04:06
I happened to read your article today. It's a very good article, and it must be very helpful. As a token of appreciation, I would like to inform you of information that can help you. I hope you can go here and get some information that will help you. Thank you. I wish you luck.
메이저놀이터 ( https://bergoogleo.com )



토토사이 05.01.2021 04:06
I read your article well. I think it's very informative. It helped me a lot after reading your article. Thank you very much for all the information. I'm going to let you know good information, too. I hope you visit my website and get good information. Always good luck. I wish you all the best.
꽁머니홍보 ( https://rafinha18.com )



servisemaster 18.01.2021 12:03
Делаем Ремонт стиральных машин в Москве ( http://servisemaster.ru/ ) Нужны реактивы для прочистки корпусов стиральных машинок внутри и снаружи. Скажите есть такие у вас.



dramacool 21.01.2021 19:21
Watch All Korean Dramas Online HD High Quality Videos....!

<a href="https://dramacoolapp.net">dramacool</a>



dramacool 21.01.2021 19:25
Watch All Korean Dramas Online On <a href="https://dramacoolapp.net">dramacool</a>app.net
<a href="https://dramacoolapp.net">dramacool</a>



먹튀검증 08.03.2021 14:33
That's a really well-organized article! Your writing is really interesting. Please continue to write a lot in the future. 먹튀검증커뮤니티 ( https://www.nuestra-cocina.com ) supports you.



안전놀이 08.03.2021 14:34
That's a really great post. This article will surely be of great help to many people. I would like to share it on my website 안전공원 ( https://www.nuestra-cocina.com ) and see it with many people.



gareemagoyal 15.03.2021 23:11
On the off chance that you are looking for we can help you by offering the most amazing in call and outcall independent Bangalore escorts.
https://bangalorevipescorts.in/ ( https://bangalorevipescorts.in/ )
https://chennaiescortsservices.in/ ( https://chennaiescortsservices.in/ )
https://jaipurescortsgirls.in/ ( https://jaipurescortsgirls.in/ )
https://mumbaieescortsgirls.com/ ( https://mumbaieescortsgirls.com/ )
https://goaescortsservices.in/ ( https://goaescortsservices.in/ )
https://hotdelhiescort.in/ ( https://hotdelhiescort.in/ )
https://hyderabadescortsgirls.in/ ( https://hyderabadescortsgirls.in/ )
https://bangalorevipescorts.in/nagpur-escorts-service.html ( https://bangalorevipescorts.in/nagpur-escorts-service.html )
https://bangalorevipescorts.in/kochi-escorts-service.html ( https://bangalorevipescorts.in/kochi-escorts-service.html )
https://bangalorevipescorts.in/ulsoor-escorts-service.html ( https://bangalorevipescorts.in/ulsoor-escorts-service.html )
https://bangalorevipescorts.in/bellandur-es...ts-service.html ( https://bangalorevipescorts.in/bellandur-escorts-service.html )
https://bangalorevipescorts.in/banaswadi-es...ts-service.html ( https://bangalorevipescorts.in/banaswadi-escorts-service.html )
https://bangalorevipescorts.in/domlur-escorts-service.html ( https://bangalorevipescorts.in/domlur-escorts-service.html )
https://bangalorevipescorts.in/hsr-layout-e...ts-service.html ( https://bangalorevipescorts.in/hsr-layout-escorts-service.html )
https://bangalorevipescorts.in/electronic-c...ts-service.html ( https://bangalorevipescorts.in/electronic-city-escorts-service.html )
https://bangalorevipescorts.in/whitefield-e...ts-service.html ( https://bangalorevipescorts.in/whitefield-escorts-service.html )
https://bangalorevipescorts.in/indiranagar-...ts-service.html ( https://bangalorevipescorts.in/indiranagar-escorts-service.html )
https://bangalorevipescorts.in/jp-nagar-escorts-service.html ( https://bangalorevipescorts.in/jp-nagar-escorts-service.html )
https://bangalorevipescorts.in/jayanagar-es...ts-service.html ( https://bangalorevipescorts.in/jayanagar-escorts-service.html )
https://bangalorevipescorts.in/jalahalli-es...ts-service.html ( https://bangalorevipescorts.in/jalahalli-escorts-service.html )
https://bangalorevipescorts.in/koramangala-...ts-service.html ( https://bangalorevipescorts.in/koramangala-escorts-service.html )
https://bangalorevipescorts.in/malleswaram-...ts-service.html ( https://bangalorevipescorts.in/malleswaram-escorts-service.html )
https://bangalorevipescorts.in/yelahanka-es...ts-service.html ( https://bangalorevipescorts.in/yelahanka-escorts-service.html )
https://bangalorevipescorts.in/mahadevapura...ts-service.html ( https://bangalorevipescorts.in/mahadevapura-escorts-service.html )
https://bangalorevipescorts.in/marathahalli...ts-service.html ( https://bangalorevipescorts.in/marathahalli-escorts-service.html )
https://bangalorevipescorts.in/rajajinagar-...ts-service.html ( https://bangalorevipescorts.in/rajajinagar-escorts-service.html )
https://bangalorevipescorts.in/shivaji-naga...ts-service.html ( https://bangalorevipescorts.in/shivaji-nagar-escorts-service.html )
https://bangalorevipescorts.in/rt-nagar-escorts-service.html ( https://bangalorevipescorts.in/rt-nagar-escorts-service.html )
https://bangalorevipescorts.in/vijay-nagar-...ts-service.html ( https://bangalorevipescorts.in/vijay-nagar-escorts-service.html )
https://bangalorevipescorts.in/mg-road-escorts-service.html ( https://bangalorevipescorts.in/mg-road-escorts-service.html )
https://bangalorevipescorts.in/air-hostess-...-bangalore.html ( https://bangalorevipescorts.in/air-hostess-escorts-in-bangalore.html )
https://bangalorevipescorts.in/celebrity-es...-bangalore.html ( https://bangalorevipescorts.in/celebrity-escorts-in-bangalore.html )
https://bangalorevipescorts.in/model-escort...-bangalore.html ( https://bangalorevipescorts.in/model-escorts-in-bangalore.html )
https://bangalorevipescorts.in/college-call...-bangalore.html ( https://bangalorevipescorts.in/college-call-girls-in-bangalore.html )
https://bangalorevipescorts.in/high-profile...-bangalore.html ( https://bangalorevipescorts.in/high-profile-escorts-in-bangalore.html )
https://bangalorevipescorts.in/russian-esco...-bangalore.html ( https://bangalorevipescorts.in/russian-escorts-in-bangalore.html )
https://bangalorevipescorts.in/housewife-es...-bangalore.html ( https://bangalorevipescorts.in/housewife-escorts-in-bangalore.html )
https://bangalorevipescorts.in/mallu-escort...-bangalore.html ( https://bangalorevipescorts.in/mallu-escorts-in-bangalore.html )
https://bangalorevipescorts.in/vip-escorts-in-bangalore.html ( https://bangalorevipescorts.in/vip-escorts-in-bangalore.html )
https://bangalorevipescorts.in/mumbai-escorts-service.html ( https://bangalorevipescorts.in/mumbai-escorts-service.html )
https://bangalorevipescorts.in/delhi-escorts-service.html ( https://bangalorevipescorts.in/delhi-escorts-service.html )
https://bangalorevipescorts.in/jaipur-escorts-service.html ( https://bangalorevipescorts.in/jaipur-escorts-service.html )
https://bangalorevipescorts.in/indore-escorts-service.html ( https://bangalorevipescorts.in/indore-escorts-service.html )
https://bangalorevipescorts.in/chandigarh-e...ts-service.html ( https://bangalorevipescorts.in/chandigarh-escorts-service.html )
https://bangalorevipescorts.in/gurgaon-escorts-service.html ( https://bangalorevipescorts.in/gurgaon-escorts-service.html )
https://bangalorevipescorts.in/noida-escorts-service.html ( https://bangalorevipescorts.in/noida-escorts-service.html )
https://bangalorevipescorts.in/dehradun-escorts-service.html ( https://bangalorevipescorts.in/dehradun-escorts-service.html )
https://bangalorevipescorts.in/ludhiana-escorts-service.html ( https://bangalorevipescorts.in/ludhiana-escorts-service.html )
https://bangalorevipescorts.in/agra-escorts-service.html ( https://bangalorevipescorts.in/agra-escorts-service.html )
https://bangalorevipescorts.in/jalandhar-es...ts-service.html ( https://bangalorevipescorts.in/jalandhar-escorts-service.html )
https://bangalorevipescorts.in/kanpur-escorts-service.html ( https://bangalorevipescorts.in/kanpur-escorts-service.html )
https://bangalorevipescorts.in/nainital-escorts-service.html ( https://bangalorevipescorts.in/nainital-escorts-service.html )
https://bangalorevipescorts.in/patna-escorts-service.html ( https://bangalorevipescorts.in/patna-escorts-service.html )
https://bangalorevipescorts.in/raipur-escorts-service.htm ( https://bangalorevipescorts.in/raipur-escorts-service.htm )
https://bangalorevipescorts.in/hyderabad-es...ts-service.html ( https://bangalorevipescorts.in/hyderabad-escorts-service.html )
https://bangalorevipescorts.in/ahmedabad-es...ts-service.html ( https://bangalorevipescorts.in/ahmedabad-escorts-service.html )
https://bangalorevipescorts.in/chennai-escorts-service.html ( https://bangalorevipescorts.in/chennai-escorts-service.html )
https://bangalorevipescorts.in/faridabad-es...ts-service.html ( https://bangalorevipescorts.in/faridabad-escorts-service.html )
https://bangalorevipescorts.in/udaipur-escorts-service.html ( https://bangalorevipescorts.in/udaipur-escorts-service.html )
https://bangalorevipescorts.in/jodhpur-escorts-service.html ( https://bangalorevipescorts.in/jodhpur-escorts-service.html )
https://bangalorevipescorts.in/shimla-escorts-service.html ( https://bangalorevipescorts.in/shimla-escorts-service.html )
https://bangalorevipescorts.in/surat-escorts-service.html ( https://bangalorevipescorts.in/surat-escorts-service.html )
https://bangalorevipescorts.in/rajkot-escorts-service.html ( https://bangalorevipescorts.in/rajkot-escorts-service.html )
https://bangalorevipescorts.in/vadodara-escorts-service.html ( https://bangalorevipescorts.in/vadodara-escorts-service.html )
https://bangalorevipescorts.in/daman-escorts-service.html ( https://bangalorevipescorts.in/daman-escorts-service.html )
https://bangalorevipescorts.in/jamshedpur-e...ts-service.html ( https://bangalorevipescorts.in/jamshedpur-escorts-service.html )
https://bangalorevipescorts.in/bhubaneswar-...ts-service.html ( https://bangalorevipescorts.in/bhubaneswar-escorts-service.html )
https://bangalorevipescorts.in/kolkata-escorts-service.html ( https://bangalorevipescorts.in/kolkata-escorts-service.html )
https://bangalorevipescorts.in/pune-escorts-service.html ( https://bangalorevipescorts.in/pune-escorts-service.html )
https://bangalorevipescorts.in/lucknow-escorts-service.html ( https://bangalorevipescorts.in/lucknow-escorts-service.html )
https://bangalorevipescorts.in/nashik-escorts-service.html ( https://bangalorevipescorts.in/nashik-escorts-service.html )
https://bangalorevipescorts.in/mysore-escorts-service.html ( https://bangalorevipescorts.in/mysore-escorts-service.html )
https://bangalorevipescorts.in/rishikesh-es...ts-service.html ( https://bangalorevipescorts.in/rishikesh-escorts-service.html )
https://bangalorevipescorts.in/ajmer-escorts-service.html ( https://bangalorevipescorts.in/ajmer-escorts-service.html )
https://bangalorevipescorts.in/bhopal-escorts-service.html ( https://bangalorevipescorts.in/bhopal-escorts-service.html )
https://bangalorevipescorts.in/haldwani-escorts-service.html ( https://bangalorevipescorts.in/haldwani-escorts-service.html )
https://bangalorevipescorts.in/haridwar-escorts-service.html ( https://bangalorevipescorts.in/haridwar-escorts-service.html )
https://bangalorevipescorts.in/varanasi-escorts-service.html ( https://bangalorevipescorts.in/varanasi-escorts-service.html )
https://bangalorevipescorts.in/mangalore-es...ts-service.html ( https://bangalorevipescorts.in/mangalore-escorts-service.html )
https://bangalorevipescorts.in/trivandrum-e...ts-service.html ( https://bangalorevipescorts.in/trivandrum-escorts-service.html )
https://bangalorevipescorts.in/ghaziabad-es...ts-service.html ( https://bangalorevipescorts.in/ghaziabad-escorts-service.html )
https://bangalorevipescorts.in/meerut-escorts-service.html ( https://bangalorevipescorts.in/meerut-escorts-service.html )



안전놀이 16.03.2021 08:44
Jaguar Land Rover Korea sold 5,676 units in the domestic market, down 44.3% year-on-year. So Jaguar Land Rover also replaced it.
</a>안전놀이터 ( https://www.newsblock.io/ )



먹튀검증 16.03.2021 08:46
On the 15th, Jaguar Land Rover Korea CEO Robin Colegan held a press conference at Grand Hyatt Seoul and announced the “4P” strategy for re-leaping the Korean market and the “Reimagine” global strategy for a sustainable future. 먹튀검증 ( https://www.asus-uk.com/ )



havi 17.03.2021 03:25
take me home laser hair removal lubbock texas ( https://laserhairremovallubbock.com/ )



Guest 13.04.2021 17:05
토토사이트 ( https://www.fknapredak.com/ttst/ )

Hey this blog is not really bad. I were going to see what else you possess but I don???t have the time I’ll have to look later.



Guest 13.04.2021 17:05
먹튀검증 ( https://www.dmodaenvzla.com/ )

I discovered your blog site internet site on the internet and appearance many of your early posts. Keep in the really good operate. I just now extra up your Feed to my MSN News Reader. Looking for toward reading more of your stuff down the line!…



Guest 13.04.2021 17:05
카지노쿠폰지급 ( https://adoagt.com/casinocoupon/ )

Very good written story. It will be helpful to everyone who usess it, including yours truly Smile. Keep doing what you are doing – i will definitely read more posts.



Guest 13.04.2021 17:05
(https://astrolabetv.com/merit ( https://astrolabetv.com/merit/ ))

I really like what you guys tend to be up too. This type of clever work and reporting! Keep up the superb works guys I’ve included you guys to blogroll.



Guest 13.04.2021 17:06
(https://polaris-ed.com ( https://polaris-ed.com/ ))

A very informative story and lots of really honest and forthright comments made! This certainly got me thinking about this issue, cheers all.



Guest 13.04.2021 17:06
해외문자 ( https://www.megakr.com/ )

Hiya, I’m really glad I’ve found this information. Nowadays bloggers publish only about gossips and web and this is actually frustrating. A good blog with interesting content, this is what I need. Thank you for keeping this website, I will be visiting it.



Guest 13.04.2021 17:06
먹튀검증 ( https://z-news.xyz/food-verification-benefits-of-using-safe-food-verification-toto-site/ )

When I originally commented I clicked the “Notify me when new comments are added” checkbox and now each time a comment is added I get several e-mails with the same comment. Is there any way you can remove me from that service?



Guest 13.04.2021 17:06
토토사이트 ( https://www.calas-fr.net/ )

I have learn some just right stuff here. Certainly value bookmarking for revisiting. I wonder how a lot effort you put to make this sort of fantastic informative site.



Guest 13.04.2021 17:07
안전바카라사이트 ( https://adoagt.com/ )

When do you think this Real Estate market will go back in a positive direction? Or is it still too early to tell? We are seeing a lot of housing foreclosures in Lake Mary Florida. What about you?



Guest 13.04.2021 17:07
먹튀검증 ( https://www.picturethisent.com/ )

An intriguing discussion is worth comment. There’s no doubt that that you simply write much more about this topic, may possibly not become a taboo topic but.



Guest 13.04.2021 17:07
안전놀이터 ( https://nakedemperornews.com/ )

What your declaring is entirely genuine. I know that everyone need to say the exact same factor, but I just believe that you put it in a way that all of us can comprehend. I also enjoy the photographs you set in right here. They in shape so well with what youre trying to say. Im sure youll achieve so numerous men and women with what youve got to say.



Guest 13.04.2021 17:07
카지노사이트 ( https://astrolabetv.com/ )

This information is magnificent. I understand and respect your clear-cut points. I am impressed with your writing style and how well you express your thoughts.



Guest 13.04.2021 17:08
메이저놀이터 ( https://poly-prepas.com/ )

I am glad that I noticed this site , just the right information that I was looking for! .



Guest 13.04.2021 17:08
먹튀검증사이트 ( https://lunapark6.com/ )

I discovered your site website on bing and appearance many of your early posts. Preserve within the really good operate. I just now extra increase Rss to my MSN News Reader. Seeking forward to reading much more of your stuff afterwards!…



Guest 13.04.2021 17:08
먹튀폴리스 ( https://www.fknapredak.com/ )

I am glad that I noticed this web blog, precisely the right info that I was looking for!



mshmsh 22.05.2021 00:18
شركة تعقيم بجازان ( https://www.m-aka.com/jazan-sterilization-company/ )
شركة تنظيف شقق بجازان ( https://www.m-aka.com/%d8%b4%d8%b1%d9%83%d8%a9-%d8%aa%d9%86%d8%b8%d9%8a%d9%81-%d8%b4%d9%82%d9%82-%d8%a8%d8%ac%d8%a7%d8%b2%d8%a7%d9%86/ )
شركة تنظيف منازل بجازان ( https://www.m-aka.com/%d8%b4%d8%b1%d9%83%d8%a9-%d8%aa%d9%86%d8%b8%d9%8a%d9%81-%d9%85%d9%86%d8%a7%d8%b2%d9%84-%d8%a8%d8%ac%d8%a7%d8%b2%d8%a7%d9%86/ )
شركة تنظيف فلل بجازان ( https://www.m-aka.com/%d8%b4%d8%b1%d9%83%d8%a9-%d8%aa%d9%86%d8%b8%d9%8a%d9%81-%d9%81%d9%84%d9%84-%d8%a8%d8%ac%d8%a7%d8%b2%d8%a7%d9%86/ )
شركة تنظيف مجالس بجازان ( https://www.m-aka.com/%d8%b4%d8%b1%d9%83%d8%a9-%d8%aa%d9%86%d8%b8%d9%8a%d9%81-%d9%85%d8%ac%d8%a7%d9%84%d8%b3-%d8%a8%d8%ac%d8%a7%d8%b2%d8%a7%d9%86/ )
شركة تنظيف كنب بجازان ( https://www.m-aka.com/%d8%b4%d8%b1%d9%83%d8%a9-%d8%aa%d9%86%d8%b8%d9%8a%d9%81-%d9%83%d9%86%d8%a8-%d8%a8%d8%ac%d8%a7%d8%b2%d8%a7%d9%86/ )
شركة تنظيف سجاد وموكيت بجازان ( https://www.m-aka.com/%d8%b4%d8%b1%d9%83%d8%a9-%d8%aa%d9%86%d8%b8%d9%8a%d9%81-%d8%b3%d8%ac%d8%a7%d8%af-%d9%88%d9%85%d9%88%d9%83%d9%8a%d8%aa-%d8%a8%d8%ac%d8%a7%d8%b2%d8%a7%d9%86/ )


شركة مكافحة النمل الابيض بجازان ( https://www.m-aka.com/%d8%b4%d8%b1%d9%83%d8%a9-%d9%85%d9%83%d8%a7%d9%81%d8%ad%d8%a9-%d8%a7%d9%84%d9%86%d9%85%d9%84-%d8%a7%d9%84%d8%a7%d8%a8%d9%8a%d8%b6-%d8%a8%d8%ac%d8%a7%d8%b2%d8%a7%d9%86/ )

شركة مكافحة حشرات بجازان ( https://www.m-aka.com/%d8%b4%d8%b1%d9%83%d8%a9-%d9%85%d9%83%d8%a7%d9%81%d8%ad%d8%a9-%d8%ad%d8%b4%d8%b1%d8%a7%d8%aa-%d8%a8%d8%ac%d8%a7%d8%b2%d8%a7%d9%86/ )
شركة رش دفان بجازان ( https://www.m-aka.com/jazan-spraying-company/ )
شركة مكافحة بق الفراش بجازان ( https://www.m-aka.com/%d8%b4%d8%b1%d9%83%d8%a9-%d9%85%d9%83%d8%a7%d9%81%d8%ad%d8%a9-%d8%a8%d9%82-%d8%a7%d9%84%d9%81%d8%b1%d8%a7%d8%b4-%d8%a8%d8%ac%d8%a7%d8%b2%d8%a7%d9%86/ )
شركة مكافحة صراصير بجازان ( https://www.m-aka.com/%d8%b4%d8%b1%d9%83%d8%a9-%d9%85%d9%83%d8%a7%d9%81%d8%ad%d8%a9-%d8%b5%d8%b1%d8%a7%d8%b5%d9%8a%d8%b1-%d8%a8%d8%ac%d8%a7%d8%b2%d8%a7%d9%86/ )


شركة رش مبيدات بجازان ( https://www.m-aka.com/%d8%b4%d8%b1%d9%83%d8%a9-%d8%b1%d8%b4-%d9%85%d8%a8%d9%8a%d8%af%d8%a7%d8%aa-%d8%a8%d8%ac%d8%a7%d8%b2%d8%a7%d9%86/ )


شركة اعمال لياسة بجازان ( https://www.m-aka.com/%d8%b4%d8%b1%d9%83%d8%a9-%d8%a7%d8%b9%d9%85%d8%a7%d9%84-%d9%84%d9%8a%d8%a7%d8%b3%d8%a9-%d8%a8%d8%ac%d8%a7%d8%b2%d8%a7%d9%86/ )
شركة اعمال سباكة بجازان ( https://www.m-aka.com/%d8%b4%d8%b1%d9%83%d8%a9-%d8%a7%d8%b9%d9%85%d8%a7%d9%84-%d8%b3%d8%a8%d8%a7%d9%83%d8%a9-%d8%a8%d8%ac%d8%a7%d8%b2%d8%a7%d9%86/ )
شركة جلي بلاط بجازان ( https://www.m-aka.com/%d8%b4%d8%b1%d9%83%d8%a9-%d8%ac%d9%84%d9%8a-%d8%a8%d9%84%d8%a7%d8%b7-%d8%a8%d8%ac%d8%a7%d8%b2%d8%a7%d9%86/ )
شركة غسيل مكيفات بجازان ( https://www.m-aka.com/%d8%b4%d8%b1%d9%83%d8%a9-%d8%ba%d8%b3%d9%8a%d9%84-%d9%85%d9%83%d9%8a%d9%81%d8%a7%d8%aa-%d8%a8%d8%ac%d8%a7%d8%b2%d8%a7%d9%86/ )
مؤسسة قص وتخريم الخرسانة بجازان ( https://www.m-aka.com/%d9%85%d8%a4%d8%b3%d8%b3%d8%a9-%d9%82%d8%b5-%d9%88%d8%aa%d8%ae%d8%b1%d9%8a%d9%85-%d8%a7%d9%84%d8%ae%d8%b1%d8%b3%d8%a7%d9%86%d8%a9-%d8%a8%d8%ac%d8%a7%d8%b2%d8%a7%d9%86/ )
شركة مقاولات بجازان ( https://www.m-aka.com/%d8%b4%d8%b1%d9%83%d8%a9-%d9%85%d9%82%d8%a7%d9%88%d9%84%d8%a7%d8%aa-%d8%a8%d8%ac%d8%a7%d8%b2%d8%a7%d9%86/ )
شركة كشف تسربات المياة بجازان ( https://www.m-aka.com/%d8%b4%d8%b1%d9%83%d8%a9-%d9%83%d8%b4%d9%81-%d8%aa%d8%b3%d8%b1%d8%a8%d8%a7%d8%aa-%d8%a8%d8%ac%d8%a7%d8%b2%d8%a7%d9%86/ )
شركة عزل اسطح بجازان ( https://www.m-aka.com/%d8%b4%d8%b1%d9%83%d8%a9-%d8%b9%d8%b2%d9%84-%d8%a7%d8%b3%d8%b7%d8%ad-%d8%a8%d8%ac%d8%a7%d8%b2%d8%a7%d9%86/ )
شركة عزل خزانات بجازان ( https://www.m-aka.com/%d8%b4%d8%b1%d9%83%d8%a9-%d8%b9%d8%b2%d9%84-%d8%ae%d8%b2%d8%a7%d9%86%d8%a7%d8%aa-%d8%a8%d8%ac%d8%a7%d8%b2%d8%a7%d9%86/ )
شركة تنظيف خزانات بجازان ( https://www.m-aka.com/%d8%b4%d8%b1%d9%83%d8%a9-%d8%aa%d9%86%d8%b8%d9%8a%d9%81-%d8%ae%d8%b2%d8%a7%d9%86%d8%a7%d8%aa-%d8%a8%d8%ac%d8%a7%d8%b2%d8%a7%d9%86/ )
شركة تسليك مجاري بجازان ( https://www.m-aka.com/%d8%b4%d8%b1%d9%83%d8%a9-%d8%aa%d8%b3%d9%84%d9%8a%d9%83-%d9%85%d8%ac%d8%a7%d8%b1%d9%8a-%d8%a8%d8%ac%d8%a7%d8%b2%d8%a7%d9%86/ )
شركة صيانة وغسيل مكيفات بجازان ( https://www.m-aka.com/%d8%b4%d8%b1%d9%83%d8%a9-%d8%aa%d9%86%d8%b8%d9%8a%d9%81-%d8%b5%d9%8a%d8%a7%d9%86%d8%a9-%d9%85%d9%83%d9%8a%d9%81%d8%a7%d8%aa-%d8%a8%d8%ac%d8%a7%d8%b2%d8%a7%d9%86/ )
شركة نقل عفش بجازان ( https://www.m-aka.com/%d8%b4%d8%b1%d9%83%d8%a9-%d9%86%d9%82%d9%84-%d8%b9%d9%81%d8%b4-%d8%a8%d8%ac%d8%a7%d8%b2%d8%a7%d9%86/ )
شركة تنظيف مكيفات بجازان ( https://www.m-aka.com/%d8%b4%d8%b1%d9%83%d8%a9-%d8%aa%d9%86%d8%b8%d9%8a%d9%81-%d9%85%d9%83%d9%8a%d9%81%d8%a7%d8%aa-%d8%a8%d8%ac%d8%a7%d8%b2%d8%a7%d9%86-0533862196/ )
شركة ترميم اسفلت بجازان ( https://www.m-aka.com/%d8%b4%d8%b1%d9%83%d8%a9-%d8%aa%d8%b1%d9%85%d9%8a%d9%85-%d8%a7%d8%b3%d9%81%d9%84%d8%aa-%d8%a8%d8%ac%d8%a7%d8%b2%d8%a7%d9%86/ )
شركة ترميم أسقف بجازان ( https://www.m-aka.com/%d8%b4%d8%b1%d9%83%d8%a9-%d8%aa%d8%b1%d9%85%d9%8a%d9%85-%d8%a3%d8%b3%d9%82%d9%81-%d8%a8%d8%ac%d8%a7%d8%b2%d8%a7%d9%86/ )



watchesbiz 31.05.2021 14:37
http://replicarolexwatches.simpsite.nl/ ( http://replicarolexwatches.simpsite.nl/ )
https://www.smore.com/rj7kh-best-replica-watches ( https://www.smore.com/rj7kh-best-replica-watches )
https://www.athleticsnation.com/users/Replicarolexwatches ( https://www.athleticsnation.com/users/Replicarolexwatches )
https://pastebin.pl/view/ab0e458a ( https://pastebin.pl/view/ab0e458a )
https://mix.com/watcheshutukcom ( https://mix.com/watcheshutukcom )
https://www.woddal.com/post/359216_tiny-acc...nybody-039.html ( https://www.woddal.com/post/359216_tiny-accessories-such-as-jewelry-and-watch-go-quite-a-way-to-specify-anybody-039.html )
https://share.naturalnews.com/posts/3904099 ( https://share.naturalnews.com/posts/3904099 )
https://demo.wowonder.com/post/214429_the-i...-producers.html ( https://demo.wowonder.com/post/214429_the-imitation-watch-commerce-isn-039-t-a-doubt-one-large-reason-watch-producers.html )
https://rapichat.com/post/5369_our-purpose-...ible-there.html ( https://rapichat.com/post/5369_our-purpose-is-to-make-searching-for-replica-watches-as-simple-as-possible-there.html )
https://dashburst.com/replicarolexwatches/1 ( https://dashburst.com/replicarolexwatches/1 )
https://sway.office.com/KifcQvn36MK821G8 ( https://sway.office.com/KifcQvn36MK821G8 )
https://flipboard.com/@replicarolex24 ( https://flipboard.com/@replicarolex24 )
https://getpocket.com/redirect?url=https%3A...eshut.uk.com%2F ( https://getpocket.com/redirect?url=https%3A%2F%2Fwww.watcheshut.uk.com%2F )
https://www.openstreetmap.org/user/Hints%20...20Rolex%20Watch ( https://www.openstreetmap.org/user/Hints%20on%20Choice%20of%20a%20High%20Quality%20Employed%20Ladies%20Replica%20Rolex%20Watch )



admin121 01.06.2021 11:17
Patek Philippe replica rolex è <a href="https://www.falsorolexorologi.it/categorie/franck-muller-replica/">Franck Muller replica</a> ampiamente considerato come uno dei più rispettati orologiai al mondo. Ci sono molti esempi eccellenti di orologi creati da questo marchio e uno dei più notevoli è il riferimento Patek Philippe. 5970. Questo non è <a href="https://www.falsorolexorologi.it/categorie/hublot-replica/">Hublot replica</a> solo un perfetto esempio del maestro di questo orologiaio, ma anche un punto importante nella storia di Patek Philippe, e questo rende tutto ancora più desiderabile.



admin121 01.06.2021 11:17
https://tinyurl.com/3rff8c8w ( https://tinyurl.com/3rff8c8w )



admin121 01.06.2021 11:19
Patek Philippe replica rolex è Franck Muller replica ( https://www.falsorolexorologi.it/categorie/franck-muller-replica/ ) ampiamente considerato come uno dei più rispettati orologiai al mondo. Ci sono molti esempi eccellenti di orologi creati da questo marchio e uno dei più notevoli è il riferimento Patek Philippe. 5970. Questo non è solo Hublot replica ( https://www.falsorolexorologi.it/categorie/hublot-replica/ ) un perfetto esempio del maestro di questo orologiaio, ma anche un punto importante nella storia di Patek Philippe, e questo rende tutto ancora più desiderabile.



Winston857Becker 30.07.2021 06:17
Santa Ana Concrete believe in offering customers incomparable service. ( https://www.concretecontractorsantaana.com/stamped-concrete-santa-ana )



gipastekstil 31.07.2021 15:38
toptan ic giyim ( https://www.gipastekstil.com ) tercih etmenizin sebebi kaliteyi ucuza satın alabilmektir. Ürünler yine orjinaldir ve size sorun yaşatmaz. Yine de bilinen tekstil markalarını tercih etmelisiniz.

Digiturk paketler ( https://digiturkpaketler.com ) güncel olarak burada listelenmektedir. Hemen başvuru yaparsanız anında kurulum yapmaktayız.

tutku ( https://www.toptantutkuicgiyim.com ) Türkiye'nin önde gelen iç giyim markalarından birisi olmasının yanı sıra en çok satan markalardan birisidir. Ürünleri hem çok kalitelidir hem de pamuk kullanımı daha fazladır.

nbb sutyen ( https://nbbsutyen.com ) hem kaliteli hem de uygun fiyatlı sütyenler üretmektedir. Sütyene ek olarak sütyen takımı ve jartiyer gibi ürünleri de mevcuttur. Özellikle Avrupa ve Orta Doğu'da çokça tercih edilmektedir.

yeni inci sutyen ( https://yeniincisutyen.com ) kaliteyi ucuz olarak sizlere ulaştırmaktadır. Çok çeşitli sütyen varyantları mevcuttur. iç giyime damga vuran markalardan biridir ve genellikle Avrupa'da ismi sıklıkla duyulur.

ic giyim ( https://icgiyimi.com ) ürünlerine her zaman dikkat etmemiz gerekmektedir. Üretimde kullanılan malzemelerin kullanım oranları, kumaşın esnekliği, çekmezlik testi gibi birçok unsuru aynı anda değerlendirerek seçim yapmalıyız.

ic giyim ( https://icgiyimi.com.tr ) bayanların erkeklere göre daha dikkatli oldukları bir alandır. Erkeklere göre daha özenli ve daha seçici davranırlar. Biliyorlar ki iç giyimde kullandıkları şeyler kafalarındaki ve ruhlarındaki özellikleri dışa vururlar.



jad12 02.08.2021 13:13
Pretty good post. I have just stumbled upon your blog and enjoyed reading your blog posts very much. I am looking for new posts to get more precious info. Big thanks for the useful info.사설토토 ( https://www.poptoto.net/ ) jump.gif



bov12 13.08.2021 17:57
Pretty good post. I have just stumbled upon your blog and enjoyed reading your blog posts very much. I am looking for new posts to get more precious info. Big thanks for the useful info.비아그라 판매 ( https://bit.ly/2VNq0Fq )



watchesbiz 26.08.2021 04:23
https://www.uptrennd.com/post-detail/hints-...-watch~ODY3MDU2 ( https://www.uptrennd.com/post-detail/hints-on-choice-of-a-high-quality-employed-ladies-replica-rolex-watch~ODY3MDU2 )
https://anotepad.com/note/read/mqg8p5jm ( https://anotepad.com/note/read/mqg8p5jm )
https://www.crokes.com/replicarolexwatches/profile/ ( https://www.crokes.com/replicarolexwatches/profile/ )
https://ko-fi.com/post/Watches-Shopping-Gui...-Watc-E1E13PZV9 ( https://ko-fi.com/post/Watches-Shopping-Guide--Finding-a-Fake-Rolex-Watc-E1E13PZV9 )
https://www.merchantcircle.com/blogs/replic...x-Watch/1966540 ( https://www.merchantcircle.com/blogs/replicawatches24-longview-tx/2021/2/Watches-Shopping-Guide-Finding-a-Fake-Rolex-Watch/1966540 )
https://www.nairaland.com/6427528/watches-s...de-finding-fake ( https://www.nairaland.com/6427528/watches-shopping-guide-finding-fake )
https://www.vingle.net/posts/3587193 ( https://www.vingle.net/posts/3587193 )
https://fortunetelleroracle.com/sport/replica-watches-280478 ( https://fortunetelleroracle.com/sport/replica-watches-280478 )
https://www.goodreads.com/story/show/132736...ake-rolex-watch ( https://www.goodreads.com/story/show/1327369-watches-shopping-guide---finding-a-fake-rolex-watch )
https://www.diigo.com/item/note/85twz/phwr?...2395edb2dac07ea ( https://www.diigo.com/item/note/85twz/phwr?k=d4af0c0700f1447812395edb2dac07ea )
https://github.com/ReplicawatchesUK/Replica...ake-Rolex-Watch ( https://github.com/ReplicawatchesUK/ReplicawatchesUK/wiki/Watches-Shopping-Guide---Finding-a-Fake-Rolex-Watch )
https://www.reddit.com/user/Bestreplicawatc...ke_rolex_watch/ ( https://www.reddit.com/user/Bestreplicawatches24/comments/lpizhp/watches_shopping_guide_finding_a_fake_rolex_watch/ )
https://slashdot.org/submission/13306958/wa...ake-rolex-watch ( https://slashdot.org/submission/13306958/watches-shopping-guide---finding-a-fake-rolex-watch )
https://www.wattpad.com/1030107359-replica-...guide-finding-a ( https://www.wattpad.com/1030107359-replica-watches-watches-shopping-guide-finding-a )
https://www.instructables.com/member/Fakero...licPreview=true ( https://www.instructables.com/member/Fakerolexwatches/?publicPreview=true )



Situs Judi Slot Online 08.09.2021 08:24
<a href="https://mylink.la/pragmatic-play">прагматицплаы</a>
линк алтернатиф сбобет ( https://msha.ke/linkalternatifsbobet/ )
https://mylink.la/jokergaming ( https://mylink.la/jokergaming )
http://msha.ke/toptrendgaming/ ( http://msha.ke/toptrendgaming/ )



Situs Judi Slot Online 08.09.2021 08:25
https://many.link/sbobet88 ( https://many.link/sbobet88 )
https://many.link/bet88 ( https://many.link/bet88 )
https://many.link/88bet ( https://many.link/88bet )
https://many.link/bola88 ( https://many.link/bola88 )
https://many.link/slot88 ( https://many.link/slot88 )
https://heylink.me/bet88/ ( https://heylink.me/bet88/ )
https://linklist.bio/bet88 ( https://linklist.bio/bet88 )
https://linklist.bio/88bet ( https://linklist.bio/88bet )
https://linklist.bio/sbobetwap ( https://linklist.bio/sbobetwap )
https://linklist.bio/sbobetmobile ( https://linklist.bio/sbobetmobile )
https://msha.ke/judionlineterbaik/ ( https://msha.ke/judionlineterbaik/ )
https://msha.ke/linkalternatifsbobet/ ( https://msha.ke/linkalternatifsbobet/ )
https://msha.ke/loginsbobet/ ( https://msha.ke/loginsbobet/ )
https://msha.ke/linksbobetalternatif/ ( https://msha.ke/linksbobetalternatif/ )
https://msha.ke/linksbobetmobile/ ( https://msha.ke/linksbobetmobile/ )
https://msha.ke/ionslot/ ( https://msha.ke/ionslot/ )
https://msha.ke/toptrendgaming/ ( https://msha.ke/toptrendgaming/ )
https://msha.ke/spadegaming/ ( https://msha.ke/spadegaming/ )
https://joy.link/klik4d ( https://joy.link/klik4d )
https://joy.link/slotonline ( https://joy.link/slotonline )
https://joy.link/pragmaticplay ( https://joy.link/pragmaticplay )
https://joy.link/tembakikan ( https://joy.link/tembakikan )
https://joy.link/bola88 ( https://joy.link/bola88 )
https://joy.link/88bet88 ( https://joy.link/88bet88 )
https://joy.link/365bet ( https://joy.link/365bet )
https://mylink.la/linkalternatifsbobet ( https://mylink.la/linkalternatifsbobet )
https://mylink.la/daftarsbobet ( https://mylink.la/daftarsbobet )
https://mylink.la/linksbobet ( https://mylink.la/linksbobet )
https://mylink.la/loginsbobet ( https://mylink.la/loginsbobet )
https://mylink.la/sbobetmobile ( https://mylink.la/sbobetmobile )
https://mylink.la/situsjudi ( https://mylink.la/situsjudi )
https://mylink.la/situsbola ( https://mylink.la/situsbola )
https://mylink.la/bandarbola ( https://mylink.la/bandarbola )
https://mylink.la/agenjudi ( https://mylink.la/agenjudi )
https://mylink.la/pragmaticplay ( https://mylink.la/pragmaticplay )
https://mylink.la/habanero ( https://mylink.la/habanero )
https://mylink.la/cq9 ( https://mylink.la/cq9 )
https://mylink.la/spadegaming ( https://mylink.la/spadegaming )
https://mylink.la/jokergaming ( https://mylink.la/jokergaming )
https://mylink.la/cmd368 ( https://mylink.la/cmd368 )
https://mylink.la/368bet ( https://mylink.la/368bet )
https://mylink.la/pokeronline ( https://mylink.la/pokeronline )
https://mylink.la/poker ( https://mylink.la/poker )
https://mylink.la/qqslot88 ( https://mylink.la/qqslot88 )
https://mylink.la/pragmatic-play ( https://mylink.la/pragmatic-play )
https://mylink.la/spade-gaming ( https://mylink.la/spade-gaming )
https://mylink.la/joker-gaming ( https://mylink.la/joker-gaming )
https://linkfly.to/klik555 ( https://linkfly.to/klik555 )
https://linkfly.to/agensbobet ( https://linkfly.to/agensbobet )
https://linkfly.to/linkbola88 ( https://linkfly.to/linkbola88 )
https://linkfly.to/linkbet88 ( https://linkfly.to/linkbet88 )
https://linkfly.to/bandarjudicasino ( https://linkfly.to/bandarjudicasino )
https://linkfly.to/casinoonline ( https://linkfly.to/casinoonline )
https://linkfly.to/sbobetalternatif ( https://linkfly.to/sbobetalternatif )
https://linkfly.to/gameslotonline ( https://linkfly.to/gameslotonline )
https://linkfly.to/situsjudionline ( https://linkfly.to/situsjudionline )
https://linkfly.to/klik4d ( https://linkfly.to/klik4d )
https://linkfly.to/qqslot88 ( https://linkfly.to/qqslot88 )
https://linkfly.to/loginsbobet ( https://linkfly.to/loginsbobet )
https://linkfly.to/togelonline ( https://linkfly.to/togelonline )
https://linkfly.to/judibola ( https://linkfly.to/judibola )
https://linkfly.to/agenbola ( https://linkfly.to/agenbola )
https://linkfly.to/sbobetcasino ( https://linkfly.to/sbobetcasino )
https://linkfly.to/linkslot88 ( https://linkfly.to/linkslot88 )
https://klik555slot.online/ ( https://klik555slot.online/ )
https://klik555slot.online/ ( https://klik555slot.online/ )
https://qqgo368bet.com/ ( https://qqgo368bet.com/ )
https://agenbetting.online/ ( https://agenbetting.online/ )
https://agenjudicasino.online/ ( https://agenjudicasino.online/ )
https://bandarjudi.casino/ ( https://bandarjudi.casino/ )
https://bandartogel.fun/ ( https://bandartogel.fun/ )
https://agenbola.fun/ ( https://agenbola.fun/ )
https://judibola.site/ ( https://judibola.site/ )
https://situsbola.co/ ( https://situsbola.co/ )
https://livecasino.tech/ ( https://livecasino.tech/ )
https://agencasino.fun/ ( https://agencasino.fun/ )
https://taruhanbola.co/ ( https://taruhanbola.co/ )
https://gameslot.fun/ ( https://gameslot.fun/ )
https://agenbolaterpercaya.site/ ( https://agenbolaterpercaya.site/ )
https://agenbolaterpercaya.space/ ( https://agenbolaterpercaya.space/ )
https://bandarbolaterpercaya.co/ ( https://bandarbolaterpercaya.co/ )
https://bandarbolaterpercaya.online/ ( https://bandarbolaterpercaya.online/ )
https://mesinslot.fun/ ( https://mesinslot.fun/ )
https://gameslotonline.website/ ( https://gameslotonline.website/ )
https://taruhanbolaonline.co/ ( https://taruhanbolaonline.co/ )
https://taruhanbolaonline.site/ ( https://taruhanbolaonline.site/ )
https://taruhanbolaonline.fun/ ( https://taruhanbolaonline.fun/ )
https://judionlineterpercaya.online/ ( https://judionlineterpercaya.online/ )
https://judionlineterpercaya.space/ ( https://judionlineterpercaya.space/ )
https://agentogel.website/ ( https://agentogel.website/ )
https://moondoge.co.in/ ( https://moondoge.co.in/ )
https://linklist.bio/pokerqq ( https://linklist.bio/pokerqq )
https://linklist.bio/bandar-q ( https://linklist.bio/bandar-q )
https://linklist.bio/qq-online ( https://linklist.bio/qq-online )
https://linklist.bio/situs-qq ( https://linklist.bio/situs-qq )
https://linklist.bio/pkv-games-online ( https://linklist.bio/pkv-games-online )



luodalin 09.09.2021 12:55
<H1><a href="http://www.baidu.com" title="百度"><strong>百度</strong></a></H1>
<a href="http://www.baidu.com" title="百度"><strong>百度</strong></a>
<H1><a href="http://www.baidu.com"><strong>百度</strong></a></H1>
<a href="http://www.baidu.com"><strong>百度</strong></a>
百度 ( http://www.baidu.com )
百度 ( http://www.baidu.com )
http://www.baidu.com ( http://www.baidu.com )



guest: sbobet88 12.09.2021 05:28
https://www.sbobet88.pw/ ( https://www.sbobet88.pw/ )

agen sbobet88 ( https://www.sbobet88.pw/ )



Situs Judi Slot Online 13.09.2021 11:45
https://klik555slot.online/ ( https://klik555slot.online/ )
https://klik555slot.com/ ( https://klik555slot.com/ )
https://ninja368.com/ ( https://ninja368.com/ )
https://165.232.182.143/ ( https://165.232.182.143/ )
https://gobet88.online/ ( https://gobet88.online/ )
https://duta555slot.online/ ( https://duta555slot.online/ )
https://duta555slot.com/ ( https://duta555slot.com/ )
https://ninja368bet.com/ ( https://ninja368bet.com/ )
https://qqgo368bet.com/ ( https://qqgo368bet.com/ )
https://rumahbet88.online/ ( https://rumahbet88.online/ )
https://agenbetting.online/ ( https://agenbetting.online/ )
https://agenjudicasino.online/ ( https://agenjudicasino.online/ )
https://bandarjudi.casino/ ( https://bandarjudi.casino/ )
https://bandartogel.fun/ ( https://bandartogel.fun/ )
https://agenbola.fun/ ( https://agenbola.fun/ )
https://judibola.site/ ( https://judibola.site/ )
https://situsbola.co/ ( https://situsbola.co/ )
https://livecasino.tech/ ( https://livecasino.tech/ )
https://agencasino.fun/ ( https://agencasino.fun/ )
https://taruhanbola.co/ ( https://taruhanbola.co/ )
http://gameslot.fun/ ( http://gameslot.fun/ )
https://agenbolaterpercaya.site/ ( https://agenbolaterpercaya.site/ )
https://agenbolaterpercaya.space/ ( https://agenbolaterpercaya.space/ )
https://bandarbolaterpercaya.co/ ( https://bandarbolaterpercaya.co/ )
https://bandarbolaterpercaya.online/ ( https://bandarbolaterpercaya.online/ )
https://mesinslot.fun/ ( https://mesinslot.fun/ )
https://gameslotonline.website/ ( https://gameslotonline.website/ )
https://taruhanbolaonline.co/ ( https://taruhanbolaonline.co/ )
https://taruhanbolaonline.site/ ( https://taruhanbolaonline.site/ )
https://taruhanbolaonline.fun/ ( https://taruhanbolaonline.fun/ )
https://judionlineterpercaya.online/ ( https://judionlineterpercaya.online/ )
https://judionlineterpercaya.space/ ( https://judionlineterpercaya.space/ )
https://agentogel.website/ ( https://agentogel.website/ )
https://many.link/ ( https://many.link/ )
https://linklist.bio/ ( https://linklist.bio/ )
https://linkfly.to/ ( https://linkfly.to/ )
https://joy.link/k ( https://joy.link/k )
https://linkfly.to/ ( https://linkfly.to/ )
https://linklist.bio/ ( https://linklist.bio/ )



guest: King 21.09.2021 11:08
https://makeyourpresence.net/ ( https://makeyourpresence.net/ )
https://printempsdesphotographes.com/ ( https://printempsdesphotographes.com/ )
https://publickitchen.org/ ( https://publickitchen.org/ )
https://kaushalenterprise.com/ ( https://kaushalenterprise.com/ )
https://cheapyeezyboots.com/ ( https://cheapyeezyboots.com/ )
https://apchess.net/ ( https://apchess.net/ )
https://apparelpunch.net/ ( https://apparelpunch.net/ )
https://monikadentalclinic.com/ ( https://monikadentalclinic.com/ )
https://folksoundsrecords.net/ ( https://folksoundsrecords.net/ )
https://bratkovic.info/ ( https://bratkovic.info/ )



rossss 12.11.2021 19:08
Ехцеллент информатион ёу хаве шаред, тханкс фор такинг тхе тиме то шаре щитх ус суч а греат артицле. И реаллы аппрециате ёур щорк. И хаве реад тхис,итис реаллы цоол .Тхис ис веры информативе анд кнощледгеабле. Плеасе кееп шаринг суч информативе кнощледге.
Тханкс фор шаринг суч греат информатион щитх ус. Ёур Пост ис бенефициал анд тхе информатион ис релиабле фор нещ реадерс. Тханкс агаин фор шаринг
суч а усефул пост.
висит он ус:-
https://ijstart-cannon.com/ ( https://ijstart-cannon.com/ )
https://officesetup.help/ ( https://officesetup.help/ )
https://www.nortoncomsetup-norton.com/ ( https://www.nortoncomsetup-norton.com/ )



Guest 27.11.2021 16:11
안전놀이터 Hanwha completed the contract with FA catcher Choi Jae-hoon (32) early. He became the main character of the 2022 KBO League FA 1st contract.



Guest 27.11.2021 16:13
안전놀이터 ( https://politicadeverdade.com ) Hanwha completed the contract with FA catcher Choi Jae-hoon (32) early. He became the main character of the 2022 KBO League FA 1st contract.



Guest 27.11.2021 16:14
메이저놀이터 ( https://politicadeverdade.com/majn ) Hanwha signed an FA contract with Choi Jae-hoon on the 27th for a total of up to 5.4 billion won (down payment of 1.6 billion won, annual salary of 3.3 billion won, and option



Guest 27.11.2021 16:15
먹튀검증 ( https://scottchasserot.com ) Hanwha quickly negotiated with internal FA Choi Jae-hoon to lead the contract, judging that he was an essential player considering his position and influence in the team as a key



Guest 27.11.2021 16:16
안전놀이터 ( https://scottchasserot.com/anjuntoto/ ) Sands entered Asian baseball in 2018 by signing a simple $90,000 contract with the Kiwoom Heroes as a substitute foreign player. After impressive performance with a batting



Guest 27.11.2021 16:17
먹튀폴리스 ( https://politicadeverdade.com/mtpolice/ ) Last year, after negotiations with Kiwoom broke down, he signed an annual salary contract of $1.1 million with Hanshin of Japan and began a new challenge.



Guest 27.11.2021 16:18
온라인카지노 ( https://shopthehotdeals.com ) In 2020, he recorded a batting average of.3001 for the first time since his debut, and this year, he recorded a batting average of.400 (405) for the first time since his debut and 72



Guest 27.11.2021 16:19
메이저사이트 ( https://politicadeverdade.com/major-site ) Coach Carlos Subero praised Choi Jae-hoon's on-base ability and appointed him as the second batter. Since the middle of the season, head coach Subero has asked for



Guest 27.11.2021 16:20
먹튀검증 ( https://scottchasserot.com ) Japanese media Sports Hochi is known to have Hanshin Sands stepping down on the 27th. "Sans has deviated from Hanshin's plan as infielder Jeffrey Marte (30), who was told



Guest 29.11.2021 12:54
안전놀이터 ( https://politicadeverdade.com ) Manchester United defender Phil Jones (29) was named on the Premier League day squad in 650 days. However, as he failed to play in the end, only the bench heated up.



Guest 29.11.2021 12:55
메이저놀이터 ( https://politicadeverdade.com/majn ) Jones left Blackburn Rovers in the summer of 2011 to join Manchester United. At that time, he played well, raising expectations as a defender who would lead the next



Guest 29.11.2021 12:56
먹튀검증 ( https://scottchasserot.com ) However, as time passed, he often left due to frequent injuries. Hamstring injuries are basic, and they had a hard time hurting various parts such as knees, shins, ankles,



Guest 29.11.2021 12:57
안전놀이터 ( https://scottchasserot.com/anjuntoto/ ) As a result, there was a high possibility that he would leave this summer, and fans should also be released. However, Jones has a strong will to stay, so he will continue to



Guest 29.11.2021 12:58
먹튀폴리스 ( https://politicadeverdade.com/mtpolice/ ) Jones was included in the Premier League day squad for the first time in 650 days. Jones was on the substitute list at 1:30 a.m. on the 29th (Korea Standard Time) in the 13th



Guest 29.11.2021 12:59
온라인카지노 ( https://shopthehotdeals.com ) British media The Sun said, "Jones appeared on the bench while Manchester United tied Chelsea. He was included in the squad on the day of the Premier League match in 650



Guest 29.11.2021 13:00
메이저사이트 ( https://politicadeverdade.com/major-site ) "ESPN" Jeff Bankruptcy reporter said on his personal Twitter account on the 29th (Korea Standard Time), "Right-hander Gaussman has agreed to a five-year, $110 million



Guest 29.11.2021 13:02
먹튀검증 ( https://scottchasserot.com ) Gaussman wore a San Francisco Giants uniform this season and played 192 innings in 33 games, recording 14 wins, 6 losses, and 2.81 227 strikeouts. 14 wins were the most wins



Guest 30.11.2021 18:29
안전놀이터 ( https://politicadeverdade.com ) Britain's "The Athletic" said on the 29th (Korea Standard Time), "Carroll, who signed with Reading in early November, is performing well at the club. Still, Reading is a club with strict



Guest 30.11.2021 18:30
메이저놀이터 ( https://politicadeverdade.com/majn ) proposals for team salary spending due to violations of financial rules. As a result of the investigation, Carol signed a contract for (1,000 (about 1.58 million won) per week, he



Guest 30.11.2021 18:31
먹튀검증 ( https://scottchasserot.com ) Carol was a striker who valued her potential throughout England when she was young. His strength was his high RBI and shooting power from his tremendous physical condition of



Guest 30.11.2021 18:32
안전놀이터 ( https://scottchasserot.com/anjuntoto/ ) Even after coming to EPL, Carol showed a good performance of 11 goals and 10 assists in 19 games. Less than a year after being promoted, Carol chose to transfer, resulting in a career



Guest 30.11.2021 18:33
먹튀폴리스 ( https://politicadeverdade.com/mtpolice/ ) At that time, Liverpool needed a substitute as Fernando Torres suddenly left for Chelsea. Liverpool decided to bring Carol and invested 41 million euros (about 55.1 billion won).



Guest 30.11.2021 18:34
온라인카지노 ( https://shopthehotdeals.com ) On the verge of losing his career as a player, Carol surprised fans by signing a contract with Reading, a second-division team. Even the contract was an ultra-short-term contract until



Guest 30.11.2021 18:35
메이저사이트 ( https://politicadeverdade.com/major-site ) Even if he has been sluggish for a long time, it doesn't make sense for Carol, who once received a lot of attention, to play for only 1.58 million won per week. "The Athletic" said,



Guest 30.11.2021 18:37
먹튀검증 ( https://scottchasserot.com ) In the upcoming transfer market, Reading may propose a contract that can keep Carol after January depending on the size of the release. In the future, Carol's performance and



Guest 01.12.2021 21:33
안전놀이터 ( https://politicadeverdade.com ) Makanday is a young prospect born in 2001 and has grown up through Tottenham Youth Academy since childhood. He joined the U-18 team from the 2017-18 season and has been promoted



Guest 01.12.2021 21:34
메이저놀이터 ( https://politicadeverdade.com/majn ) He can play in all positions in the second line, but he mainly plays as a right winger. Macanday started playing in Premier League 2 in the 2018-19 season, showing his best performance



Guest 01.12.2021 21:35
먹튀검증 ( https://scottchasserot.com ) Tottenham is trying to renew its contract with Markanday, who showed excellent potential, but it is difficult because Markanday wants to play in the first division. It is a time when Antonio



Guest 01.12.2021 21:36
안전놀이터 ( https://scottchasserot.com/anjuntoto/ ) The problem is that Makanday's contract period is until this season. From January, you can freely negotiate with other teams as a free agent. Some teams have already shown interest



Guest 01.12.2021 21:37
먹튀폴리스 ( https://politicadeverdade.com/mtpolice/ ) The mentioned teams are teams that can recruit Macanday in the winter transfer market and allow him to play as a key player immediately. If the two sides are unable to renew their



Guest 01.12.2021 21:38
온라인카지노 ( https://shopthehotdeals.com ) KBO announced a list of candidates for the 2021 Shinhan Bank SOL KBO Golden Glove award on the 1st. 84 players will compete until the 7th for the 10 Golden Gloves given to the best



Guest 01.12.2021 21:39
메이저사이트 ( https://politicadeverdade.com/major-site ) The most fierce battleground every year is the outfield. With three players honored with the award, players with big records are already competing indefinitely this year.



Guest 01.12.2021 21:40
먹튀검증 ( https://scottchasserot.com ) Lee Jung-hoo is a strong candidate for the Golden Glove award in the outfield category. In 123 games this season, he left a batting average of 0.360, seven home runs, 84 RBIs, 78 runs, and



Guest 02.12.2021 18:00
안전놀이터 ( https://politicadeverdade.com ) An official from Suwon FC said on the 2nd, "We have been in fierce negotiations with Lee Seung-woo. As a result, an agreement was reached in a large framework for recruiting Lee Seung-woo.



Guest 02.12.2021 18:01
메이저놀이터 ( https://politicadeverdade.com/majn ) Lee Seung-woo, a native of FC Barcelona's Hubenille, played for Hellas Verona from 2017 to 2019 following Barcelona B. After moving to Sintrawiden in 2019, he was not given a chance to play.



Guest 02.12.2021 18:02
먹튀검증 ( https://scottchasserot.com ) Last season, Lee Seung-woo, who was on loan for Portimonens, Portugal, suffered more from recent rumors of a transfer. With the remaining contract period remaining, Sint-Truidan played Mongni



Guest 02.12.2021 18:04
안전놀이터 ( https://scottchasserot.com/anjuntoto/ ) because of the news of a sudden transfer negotiation with the K League club in Korea. However, after fierce negotiations with the club, Lee Seung-woo terminated his contract and made a light start.



Guest 02.12.2021 18:05
먹튀폴리스 ( https://politicadeverdade.com/mtpolice/ ) Recently, he showed interest in Lee Seung-woo in various leagues. Multiple clubs in the U.S. Major League Baseball (MLS) and Japan's J League tried to recruit Lee Seung-woo. He also sought



Guest 02.12.2021 18:06
온라인카지노 ( https://shopthehotdeals.com ) The source said, "The contract between Suwon FC and Lee Seung-woo is almost completed. Lee Seung-woo also thanked Suwon FC's active interest, including head coach Kim Do-kyun, he



Guest 02.12.2021 18:08
메이저사이트 ( https://politicadeverdade.com/major-site ) Romero paid for the meal. Romero, who was selected as Italy's Serie A best defender last season, signed a five-year contract with Tottenham this summer. He inherited the No. 4 uniform worn by



Guest 02.12.2021 18:09
먹튀검증 ( https://scottchasserot.com ) According to the statistical media "Hus Score Dotcom" standard, Romero's average rating this season is 6.75. Among center backs, Davinson Sanchez (6.71 points), Eric Dier (6.70 points), and Joe



Guest 03.12.2021 18:57
안전놀이터 ( https://politicadeverdade.com ) Coach Langnick, who has a lot of experience on the German stage, prefers soccer based on pressure. The media explained, "After the appointment of coach Langnick, the word 'gegen pressing' or



Guest 03.12.2021 18:58
메이저놀이터 ( https://politicadeverdade.com/majn ) Ronaldo is a style of playing with explosive power, concentration, and off-the-ball with his accumulated stamina instead of pressure. Therefore, some predicted that Ronaldo would not be appointed



Guest 03.12.2021 18:58
먹튀검증 ( https://scottchasserot.com ) The media said, "Ronaldo didn't put pressure even when he was much younger. Ferguson said, "I saw Ronaldo's ability to attack by dribbling and creating opportunities," adding, "Ronaldo's pressure



Guest 03.12.2021 18:59
안전놀이터 ( https://scottchasserot.com/anjuntoto/ ) The San Diego Padres are aiming for FA slugger Nick Casteyanos (29). Although all work has been suspended due to the closure of the workplace, it has emerged as the No. 1 recruitment of San



Guest 03.12.2021 19:00
먹튀폴리스 ( https://politicadeverdade.com/mtpolice/ ) Bob Nightingale, a reporter for USA Today Sports, said on the 3rd (Korea Standard Time) that San Diego is showing strong interest in FA outfielder Casteyanos. However, he added that the contract is



Guest 03.12.2021 19:01
온라인카지노 ( https://shopthehotdeals.com ) Uta big gun Casteyanos made his big league debut with the Detroit Tigers in 2013. Castejanos, who signed a four-year, $64 million FA contract with the Cincinnati Reds in January 2020 after passing



Guest 03.12.2021 19:02
메이저사이트 ( https://politicadeverdade.com/major-site ) Casteyanos, who has consistently recorded double-digit home runs for eight consecutive years since 2014, had his best season this year. With a batting average of .39 with 34 home runs and 100 RBIs



Guest 03.12.2021 19:04
먹튀검증 ( https://scottchasserot.com ) The three players, who were sanctioned for three years, played for the national team by age and tried to maintain their sense of play. He played the 2014 AFC U16 Championship, the 2015 Suwon JS



Guest 04.12.2021 23:15
안전놀이터 ( https://politicadeverdade.com ) In 2022, "Deft" Kim Hyuk-kyu and "Beryl" Cho Kun-hee, who have won many championships, will work together for the first time as bot duos. Along with veteran bot duo, "Zeka" Kim Gun-woo, who



Guest 04.12.2021 23:16
메이저놀이터 ( https://politicadeverdade.com/majn ) "Deft" Kim Hyuk-kyu returned to DRX for the first time in a year. At the end of 2018, Kim Hyuk-kyu joined King Zone Dragon X, the predecessor of DRX, and led the team for two years, and later



Guest 04.12.2021 23:17
먹튀검증 ( https://scottchasserot.com ) Hanwha Life e-Sports. Kim Hyuk-kyu has maintained his best skills with thorough self-management for eight years, and is a living legend with the most kills in LoL history. DRX welcomed Kim Hyuk



Guest 04.12.2021 23:19
안전사이트 ( https://politicadeverdade.com ) Kim Hyuk-kyu's partner was decided to be "Beryl" Cho Kun-hee. Cho Kun-hee is one of the world's best supporters with excellent situational design skills, unrivaled meta-interpretation, and orders



Guest 04.12.2021 23:20
먹튀검증 ( https://politicadeverdade.com/mtgeomjung ) He made his debut in 2017, won the 2020 LoL World Championship, and also finished second at the 2021 LoL World Championship, and is scheduled to start a new challenge at DRX in 2022.



Guest 04.12.2021 23:21
온라인카지노 ( https://shopthehotdeals.com ) "Zeka" Kim Kun-woo is a promising mid-liner since he was a trainee, and is expected to be a key player at the center of the team. Kim Gun-woo made his debut in China's Vish Gaming in 2020



Guest 04.12.2021 23:23
메이저사이트 ( https://politicadeverdade.com/major-site ) Choi Byung-hoon, head of DRX, said, "We expect synergy to be maximized when veteran players and potential players who have experienced a number of championships meet. DRX will not stop



Guest 04.12.2021 23:24
먹튀검증업체 ( https://politicadeverdade.com/mtgeomjung ) Meanwhile, DRX is doing its best to form the best team, investing more than 2 billion won in a player to repay fans for their unwavering support with their best performance and challenge in 2022.



Guest 05.12.2021 10:09
안전놀이터 ( https://politicadeverdade.com ) On the 13th of last month, Cho Song-hwa expressed her discord with former coach Seo Nam-won through action. After being scolded by former coach Seo with former coach Kim Sani during



Guest 05.12.2021 10:10
메이저놀이터 ( https://politicadeverdade.com/majn ) Later, under the direction of a top official, he drove down to Gwangju on the 16th of last month when the Pepper Savings Bank AI Peppers match was held, and left the accommodation



Guest 05.12.2021 10:11
먹튀검증 ( https://scottchasserot.com ) Public opinion was raging over Cho Song-hwa, who often left the team even when he was in Heungkuk Life Insurance. The lack of professional consciousness cultivation was a serious situation.



Guest 05.12.2021 10:12
안전사이트 ( https://politicadeverdade.com ) At that time, the Industrial Bank of Korea decided to terminate Cho Song-hwa and voluntarily. And he asked Cho Song-hwa, who had left the team, for verbal consent and applied for voluntary



Guest 05.12.2021 10:14
먹튀검증 ( https://politicadeverdade.com/mtgeomjung ) The Industrial Bank of Korea violated the part of the Ministry of Culture, Sports and Tourism's upgrade of standard contracts since June to protect the rights and interests of



Guest 05.12.2021 10:15
온라인카지노 ( https://shopthehotdeals.com ) In the end, the Industrial Bank of Korea asked KOVO for a helping hand. If the conflict with the player is not resolved, KOVO can be asked to hold a reward and punishment committee. There were no



Guest 05.12.2021 10:19
메이저사이트 ( https://politicadeverdade.com/major-site ) Usually, when a player who fails to fulfill such a contract issues it, the club steps out of its own disciplinary action or finishes the situation. This is because the stakeholders



Guest 05.12.2021 10:21
먹튀검증업체 ( https://politicadeverdade.com/mtgeomjung ) The KOVO Reward and Punishment Committee is also difficult. It is an issue that has drawn public attention. Various opinions, including the interpretation of the legal principles of reward and



Guest 05.12.2021 21:41
안전놀이터 ( https://politicadeverdade.com ) KBO announced the list of suspended players (532 players) in 2022 at the end of November. A total of 610 players were registered in the KBO League in 2021, 58 free agents and



Guest 05.12.2021 21:41
메이저놀이터 ( https://politicadeverdade.com/majn ) In the first half alone, as many as six goals were scored. It was Freiburg's unilateral score, not a slugfest. In the second minute of the first half, Chade broke down the left side and crossed it.



Guest 05.12.2021 21:42
먹튀검증 ( https://scottchasserot.com ) Immediately, an additional goal came out. In the 4th minute of the first half, Chade scored Günter's left cross with a header shot. The goal firecracker exploded. In the 12th minute of the first half,



Guest 05.12.2021 21:42
안전사이트 ( https://politicadeverdade.com ) The gap widened further. In the 19th minute of the first half, in a corner kick situation, the hooper cut forward and returned it. The ball went straight into the opposite goal.



Guest 05.12.2021 21:42
먹튀검증 ( https://politicadeverdade.com/mtgeomjung ) A catastrophe has occurred. A free-kick was given from a long distance in the 25th minute of the first half. Hoppler put the ball inside, and Wheeler scored with a header.



Guest 05.12.2021 21:43
온라인카지노 ( https://shopthehotdeals.com ) Kim Kun-woo, who joined DRX, was famous for his solo rank ID "I am Junil" and worked at KT Rolster Academy in 2019. Kim Gun-woo, who liked head coach Kim Jung-kyun enough to have



Guest 05.12.2021 21:43
메이저사이트 ( https://politicadeverdade.com/major-site ) Kim Kun-woo, who had only 2 wins and 8 losses in the 2020 LPL Springer, developed into 17 wins and 17 losses in the summer season. Kim Kun-woo, who later left Vish Gaming and moved to



Guest 05.12.2021 21:43
먹튀검증업체 ( https://politicadeverdade.com/mtgeomjung ) Kim Kun-woo, who broke up with BLG after the 2021 season, made his LCK debut when he joined DRX. He will face Lee Joo-hyun, a rib sandbox "Closer" who debuted at the same time.



Guest 06.12.2021 10:23
안전놀이터 ( https://politicadeverdade.com ) Son Heung-min's goal in the 32nd minute of the second half was the peak of his strong performance against Norwich. He received Davis' pass and sealed the 3-0 victory with a right-footed shot



Guest 06.12.2021 10:23
메이저놀이터 ( https://politicadeverdade.com/majn ) All three goals scored on the day were decided at Son Heung-min's feet. He exchanged passes with Lucas Moura in the 10th minute of the first half and scored Moura's fantastic mid-range



Guest 06.12.2021 10:23
먹튀검증 ( https://scottchasserot.com ) first goal with a sensational back pass. Sanchez's goal in the 21st minute of the second half was also possible because it started with Son Heung-min's sharp corner kick and Ben Davis' header



Guest 06.12.2021 10:23
안전사이트 ( https://politicadeverdade.com ) Son Heung-min chose Spider-Man's web as a ceremony. It started for the first time after scoring in the 14th round with Brentford, and continued this time. In addition to Son Heung-min, Moura



Guest 06.12.2021 10:24
먹튀검증 ( https://politicadeverdade.com/mtgeomjung ) It started with Tom Holland, the main actor of the "Spider-Man" Holland said he was a fan of Tottenham and Son Heung-min. Son Heung-min responded with a Spider-Man ceremony, and Holland



Guest 06.12.2021 10:24
온라인카지노 ( https://shopthehotdeals.com ) However, this is likely to be the last. Son Heung-min revealed on his Instagram that it was the last Spider-Man ceremony after the game. Fans were also disappointed by the news of Son Heung-



Guest 06.12.2021 10:24
메이저사이트 ( https://politicadeverdade.com/major-site ) Baek Seung-ho's knees in the picture were covered with blood. It was a glimpse of his determination and dedication in the final round of the 2021 season Final A against Jeju United.



Guest 06.12.2021 10:24
먹튀검증업체 ( https://politicadeverdade.com/mtgeomjung ) Thanks to Baek Seung-ho's dedication from the back, Jeonbuk's front line was able to set fire. Han Kyo-won and Song Min-kyu scored consecutive goals in the second half and won 2-0.



bts4d 04.01.2022 19:16
Daftar Situs Judi Slot Online Paling Gacor di Situs Slot Online Resmi BTS4D

<a href="https://dewawd.com/" title="BTS4D - AGEN BOLA TOGEL SLOT ONLINE TERPERCAYA">https://dewawd.com/</a>

<a href="https://heylink.me/Slot.Gacor.VIP/" title="BTS4D - GAME SLOT PULSA PALING GACOR">https://heylink.me/Slot.Gacor.VIP/</a>

Nikmati layanan deposit pulsa dan berbagai jenis taruhan dari slot online terpercaya, Supaya bisa menikmati pilihan game judi slot gacor BTS4D.



에볼루션 28.01.2022 11:43
all the technical KINGDOM777 solutions and staff we need for operators who provide world
EVOBENCH [ http://www.evobench.com/ ( http://www.evobench.com/ ) ]



에볼루션 28.01.2022 11:43
all the technical KINGDOM777 solutions and staff we need for operators who provide world
EVOBENCH [ http://www.evobench.com/ ( http://www.evobench.com/ ) ]



에볼루션 28.01.2022 11:43
all the technical KINGDOM777 solutions and staff we need for operators who provide world
EVOBENCH [ http://www.evobench.com/ ( http://www.evobench.com/ ) ]



에볼루션 28.01.2022 11:46
all the technical KINGDOM777 solutions and staff we need for operators who provide world
EVOBENCH [ http://www.evobench.com/ ( http://www.evobench.com/ ) ]



에볼루션 29.01.2022 04:12
all the technical solutions and staff we need for operators who provide world-class live kingdom777
<a href="http://www.evobench.com/에볼루션-카지노" title="에볼루션-카지노" rel="nofollow ugc">에볼루션카지노</a>
<a href="http://www.evobench.com/에볼루션-바카라" title="에볼루션-바카라" rel="nofollow ugc">에볼루션바카라</a>
<a href="http://www.evobench.com/에볼루션-블랙잭" title="에볼루션-블랙잭" rel="nofollow ugc">에볼루션블랙잭</a>
<a href="http://www.evobench.com/에볼루션-룰렛" title="에볼루션-룰렛" rel="nofollow ugc">에볼루션룰렛</a>
<a href="http://www.evobench.com/" title="에볼루션" rel="nofollow ugc">에볼루션</a>
<a href="http://www.evobench.com/" title="에볼루션코리아" rel="nofollow ugc">에볼루션코리아</a>
<a href="http://www.evobench.com/" title="에볼루션온라인" rel="nofollow ugc">에볼루션온라인</a>



에볼루션 29.01.2022 04:12
all the technical KINGDOM777 solutions and staff we need for operators who provide world
EVOBENCH [ http://www.evobench.com/ ( http://www.evobench.com/ ) ]



에볼루션 29.01.2022 04:21
all the technical KINGDOM777 solutions and staff we need for operators who provide world
EVOBENCH [ http://www.evobench.com/ ( http://www.evobench.com/ ) ]



에볼루션 29.01.2022 04:21
all the technical KINGDOM777 solutions and staff we need for operators who provide world
EVOBENCH [ http://www.evobench.com/ ( http://www.evobench.com/ ) ]



에볼루션 29.01.2022 04:21
all the technical KINGDOM777 solutions and staff we need for operators who provide world
EVOBENCH [ http://www.evobench.com/ ( http://www.evobench.com/ ) ]



에볼루션 29.01.2022 08:56
all the technical KINGDOM777 solutions and staff we need for operators who provide world
EVOBENCH [ http://www.evobench.com/ ( http://www.evobench.com/ ) ]



메이저토 16.03.2022 06:54
Buying a business does not have to be a complicated endeavor when the proper process and methodology is followed. In this article, we outline eleven specific steps that should be adhered to when buying a business and bank financing is planned to be utilized. 메이저토토사이트추천
https://kipu.com.ua/ ( https://kipu.com.ua/ )



site860 26.03.2022 11:53
site860 ( https://maps.google.ee/url?q=https%3A%2F%2Fsite789.com )



guest: apollo 07.04.2022 13:58
slot online ( https://www.marion-cotillard.org )
judi slot online ( https://www.marion-cotillard.org )
situs slot online terpercaya ( https://www.marion-cotillard.org )



Guest 09.05.2022 15:13
(SkyGen @ 17.10.2012 17:24)
Ссылка на исходное сообщение  Прикреплённое изображениереклама ( http://molbiol.ru/wiki/Zbio:%D0%A0%D0%B5%D0%BA%D0%BB%D0%B0%D0%BC%D0%B0_%D0%BD%D0%B0_molbiol.ru#.D0.B3.D0.BB.D0.B0.D0.B2.D0.BD.D0.B0.D1.8F_.D1.81.D1.82.D1.80.D0.B0.D0.BD.D0.B8.D1.86.D0.B0 )
C сентября мы (компания SkyGen) являемся эксклюзивным дистрибьютором реактивов NEB в России и СНГ.

Сейчас мы формируем второй октябрьский заказ!
Мы рассчитываем его разместить до 29 октября 2012, в Москву заказ придет сразу после ноябрьских праздников.

Звоните!

+7 (495) 215-02-22
info@skygen.com

ICQ 616631519
Skype skygen-llc




Guest 09.05.2022 15:13
(SkyGen @ 18.10.2012 15:16)
Ссылка на исходное сообщение  Увы, это так. Поставка реагентов за 24 часа из Европы логистически возможна (DHL), но сделать это экономно и в белую, заплатив все пошлины и налоги, почти невозможно.
Поэтому мы  формируем склад, чтобы охватить 80% всех самых основных реагентов NEB. Этот заказ как раз и направлен, чтобы заполнить наши морозильники основными реагентами.
И тогда доставка за 24-48 часов в любой крупный город России будет возможна!




토토사이 09.05.2022 15:14
https://mukoff.com/ ( https://mukoff.com/ )
However, Woo now has to wait at least another year for his possible coronation as the new Asiad king.



토토커뮤 09.05.2022 15:16
Still a few days from his 19th birthday, Hwang is already one of the top freestyle swimmers in Asia. Hwang first announced his arrival at the Tokyo Olympics, where he set an Asian record in the 100m freestyle semifinals and pushed for a stunning medal before losing steam in the 200m freestyle final.
https://totooff.com/ ( https://totooff.com/ )



메이저놀 09.05.2022 15:25
https://tototimez.com/ ( https://tototimez.com/ )
These performances came on the heels of Woo's fourth-place finish at the Tokyo Olympics last summer. It was the highest placement by a Korean track and field athlete at any Olympics.



안전놀이 09.05.2022 15:26
https://mukclean.com/ ( https://mukclean.com/ )
At the national team trials held in late March, Hwang handily won the 100m and 200m freestyle finals. Hwang posted competitive times that would have put him among the world leaders, if the meet had been recognized by FINA, the world swimming governing body.



사설토토 09.05.2022 15:26
https://scoretvs.com/ ( https://scoretvs.com/ )
Woo, 26, has not yet won an Asian Games gold, having finished 10th in his debut in 2014 and then having taken silver in 2018. Given his recent form, Woo looked poised to become the first Korean high jumper since Lee Jin-taek in 2002 to top the Asian Games podium.



먹튀검증 09.05.2022 15:26
https://mtpolice999.com/ ( https://mtpolice999.com/ )
The camp was arranged to help Hwang prepare for his Asian Games debut, which has been put on hold until further notice.



보증업체 09.05.2022 15:27
http://sureman999.com/ ( http://sureman999.com/ )
Nothing is guaranteed in sports. Woo's string of impressive jumps may not continue in 2023, when the Asian Games will likely be held. An extra year of training and competing may also expose athletes to injury risks.



hokicuan78 09.05.2022 16:53
slot hoki ( http://maucaricuan.bravesites.com/ )

Agen slot ( http://maucaricuan.blogspot.com/2022/05/ciri-agen-slot-bonafit-dan-cara-daftar.html )

Daftar slot ( http://site-7517905-3524-752.mystrikingly.com/ )

slot pragmatic ( http://62690f5bc904b.site123.me/ )

Slot online ( http://slothokicaricuan.blogspot.com/2022/04/keuntungan-besar-daftar-situs-slot.html )

Judi online ( http://id.quora.com/profile/Ellen-Yuliani/CARA-DAFTAR-SITUS-SLOT-ONLINE-PASTI-MENANG-HOKICUAN78-Bagaimana-Cara-Daftar-Situs-Slot-Online-https-hokicuan78-net )

Daftar judi online ( http://qr.ae/pv22Xf )

Hoki 77 ( http://dribbble.com/shots/18112144-TUTORIAL-DAFTAR-SITUS-SLOT-ONLINE-PASTI-MENANG-HOKICUAN78 )

Cuan 78 ( http://id.pinterest.com/pin/949626271400858268/ )

slot gacor ( http://medium.com/@ellenyuliana/informasi-tentang-permainan-situs-hokicuan78-slot-online-terpercaya-bdb5cbab8d6 )

RTP Slot ( http://seru.vip/HOKICUAN78 )
daftar slot hoki ( http://ellenyu0.blog5.net/51431182/daftar-situs-slot-hoki-77-taruhan-gratis-depo-via-emoney-pulsa-telkomsel-tanpa-potongan )

slot hoki ( https://hokicuan78.net/ )
hoki78 ( https://hokicuan78.net/ )
hokicuan78 ( https://hokicuan78.net/ )
hoki cuan 78 ( https://hokicuan78.net/ )
daftar slot hoki ( https://hokicuan78.net/ )
cuan78 ( https://hokicuan78.net/ )
hokicuan ( https://hokicuan78.net/ )
hoki 77 ( https://hokicuan78.net/ )
hoki77 ( https://hokicuan78.net/ )
hoki 78 ( https://hokicuan78.net/ )



Guest 10.05.2022 11:30
It’s a good idea to choose บาคาร่าออนไลน์ ( https://123goal.app/%E0%B8%AA%E0%B8%A3%E0%B9%89%E0%B8%B2%E0%B8%87%E0%B8%A3%E0%B8%B2%E0%B8%A2%E0%B9%84%E0%B8%94%E0%B9%89%E0%B8%A1%E0%B8%AB%E0%B8%B2%E0%B8%A8%E0%B8%B2%E0%B8%A5-%E0%B8%9A%E0%B8%B2%E0%B8%84%E0%B8%B2%E0%B8%A3/ ) your target journal before slot xo ( https://123goal.app/slotxo-%E0%B8%AA%E0%B8%A5%E0%B9%87%E0%B8%AD%E0%B8%95/ ) you start writing your paper. 11hilo ( https://123goal.app/11hilo/ ) Then you can tailor your สล็อต ( https://123goal.app/category/%E0%B8%AA%E0%B8%A5%E0%B9%87%E0%B8%AD%E0%B8%95%E0%B8%AD%E0%B8%AD%E0%B8%99%E0%B9%84%E0%B8%A5%E0%B8%99%E0%B9%8C/ ) writing to the journal’s 123GOAL ( https://123goal.app/ ) requirements and readership

Once you’ve chosen nigoal ( https://nigoal123.org/ ) your target journal ลิงค์รับทรัพย์ ( https://nigoal123.org/%E0%B8%A5%E0%B8%B4%E0%B8%87%E0%B8%84%E0%B9%8C%E0%B8%A3%E0%B8%B1%E0%B8%9A%E0%B8%97%E0%B8%A3%E0%B8%B1%E0%B8%9E%E0%B8%A2%E0%B9%8C/ ) take the time to read a พ ริ ต ตี้ เกม มิ่ง ( https://nigoal123.org/pretty-gaming/ ) particularly those that ราคา บอล ( https://www.nigoal123.org/%E0%B8%A3%E0%B8%B2%E0%B8%84%E0%B8%B2%E0%B8%9A%E0%B8%AD%E0%B8%A5/ ) If you’re writing an opinion Hotgraph ( https://nigoal123.org/hotgraph/ ) are relevant to your own research.



betflix789 11.05.2022 10:41
Which mobile online slots are good? Introducing a new camp game like
Allows players to try slots games for free. free of charge Just easy to apply for membership. just a few steps
betflix789 ( https://superslot159.com/betflix789/ )



jiuer7845 20.05.2022 04:05
Jordan AJ 1 ( https://www.jordan-aj1.com/ )
Jordan 1 ( https://www.jordan-aj1.com/ )
Jordans ( https://www.jordansuk.uk.com/ )
Jordans Shoes ( https://www.jordansuk.uk.com/ )
Jordan 4 ( https://www.jordan4.uk.com/ )
Air Jordan 4 ( https://www.jordan4.uk.com/ )
Yeezy ( https://www.yeezy-s.us/ )
Yeezy Shoes ( https://www.yeezy-s.us/ )
Yeezy Boost ( https://www.yeezyboosts.us/ )
Yeezy Boost 350 ( https://www.yeezyboosts.us/ )
Yeezy Slides ( https://www.yeezyslidess.us/ )
Yeezy ( https://www.yeezyslidess.us/ )
Yeezy Shoes ( https://www.yeezysshoess.us/ )
Yeezy ( https://www.yeezysshoess.us/ )
Yeezy Boots ( https://www.yeezy-boots.us/ )
Yeezy ( https://www.yeezy-boots.us/ )
Birkin Bag ( https://www.birkinbags.us.com/ )
Yeezy Crocs ( https://www.yeezycrocs.us/ )
Pandora ( https://www.pandora-s.us/ )
Pandora Jewelry ( https://www.pandora-s.us/ )
Pandora Jewelry Official Site ( https://www.pandora-jewelryofficialsite.com/ )
Pandora Jewelry ( https://www.pandora-jewelryofficialsite.com/ )
Pandora Charms ( https://www.pandoracharmss.com/ )
Pandora Jewelry ( https://www.pandoracharmss.com/ )
Birkin Bag ( https://www.birkinbag.us/ )
Birkin Bags ( https://www.birkinbags.us.com/ )
Birkin Bag ( https://www.birkinbags.us/ )
Birkin Bags ( https://www.birkinbags.us/ )
Yeezy Slides ( https://www.yeezysslides.com/ )
Fake Yeezys ( https://www.fakeyeezys.us/ )
Michael Kors Handbags ( https://www.michaelkors-handbags.com/ )
Michael Kors ( https://www.michaelkors-s.us.com/ )
Michael Kors Handbags ( https://www.michaelkors-s.us.com/ )
Michael Kors Outlet ( https://www.michaelkorsoutletsonline.com/ )
Michael Kors Outlet Online ( https://www.michaelkorsoutletsonline.com/ )
Jordan 1 ( https://www.jordan-1.de/ )
Ray Ban Outlet ( https://www.raybans-outlet.us.com/ )
Ray Bans Outlet ( https://www.raybans-outlet.us.com/ )
Ray Bans ( https://www.raybans-outlet.us.com/ )
Rolex Watches ( https://www.rolexswatches.us.com/ )
Adidas Yeezy ( https://www.adidasyeezyonlinestore.us/ )
Adidas Yeezy ( https://www.adidasyeezy-shoes.com/ )
Yeezy Shoes ( https://www.adidasyeezy-shoes.com/ )
New Yeezys ( https://www.newyeezys.us/ )
Ray Bans ( https://www.raybans.uk.com/ )
Ray Bans UK ( https://www.raybans.uk.com/ )
Ray Ban Glasses ( https://www.raybansglasses.com/ )
Ray Ban Sunglasses ( https://www.raybansglasses.com/ )
Ray Ban Outlet ( https://www.ray-banoutlets.com/ )
Ray Bans Outlet ( https://www.ray-banoutlets.com/ )
Nike Outlet ( https://www.nike-factorys.us.com/ )
Ray-Ban Sunglasses ( https://www.raybans-sunglasses.us/ )
Nike Factory ( https://www.nike-factorys.us.com/ )
Yeezys ( https://www.newyeezys.us/ )
Ray Ban Sunglasses ( https://www.raybans-sunglasses.us/ )
Nike Outlet Online ( https://www.nikeonlienoutlet.com/ )
Nike Outlet ( https://www.nikeonlienoutlet.com/ )
Yeezy Shoes ( https://www.yeezysshoes.com/ )
Nike Trainers ( https://www.niketrainers.uk.com/ )
Nike UK ( https://www.niketrainers.uk.com/ )
Yeezy ( https://www.yeezysshoes.com/ )
Rolex ( https://www.rolexs.us.com/ )
Rolex Watches ( https://www.rolexwatches.uk.com/ )
Pandora Jewelry ( https://www.pandorajewelrys.us/ )
Pandora Charms ( https://www.pandoracharmss.us/ )
Pandora Jewelry ( https://www.pandorajewelryusa.us.com/ )
Travis Scott Jordan 1 ( https://www.travisscott-jordan1.com/ )
Air Jordans ( https://www.airsjordans.com/ )
Jordan 11 ( https://www.jordan-11s.com/ )



guest: pgslot 27.05.2022 09:44
<a href="https://pg-slot.game/pg-slot/slot168/">slot168</a> Online slots The bonus is easy to get real money. A lot of promotions. <a href="https://pg-slot.game/">pg slot</a> games only. The more you play, the more money you get. Definitely worth the investment That is the most popular



guest: pgslot 27.05.2022 09:45
slot168 ( https://pg-slot.game/pg-slot/slot168/ ) Online slots The bonus is easy to get real money. A lot of promotions. PG SLOT games only. The more you play, the more money you get. Definitely worth the investment That is the most popular pg slot ( https://pg-slot.game/ )



mild 29.05.2022 15:34
การเล่นสล็อต เว็บตรง MEGA GAME เปรียบเหมือนเพื่อนๆ [url=https:// mega-game.io/] MEGA GAME [/url] ได้เดินทางไปเล่นที่ต่างประเทศให้เสียเวลาเลยจริง ๆ เลยทีเดียว แตกต่างกันตรงที่เราเล่นผ่านโทรศัพท์มือ[url=https:// mega-game.io/mega-game-สล็อตสำหรับคนทุนน้อย/] สล็อตสำหรับคนทุนน้อย [/url]



baccarat online 04.06.2022 12:24
Your article has answered the question I was wondering about! I would like to write a thesis on this subject, but I would like you to give your opinion once :D baccarat online ( http://google.com.br/url?sa=t&url=https%3A%2F%2Fvnshop24.com )



nigoal123 06.06.2022 10:10
Depending on the industry nigoal ( https://nigoal123.org/ ) of your business ลิงค์รับทรัพย์ ( https://nigoal123.org/%E0%B8%A5%E0%B8%B4%E0%B8%87%E0%B8%84%E0%B9%8C%E0%B8%A3%E0%B8%B1%E0%B8%9A%E0%B8%97%E0%B8%A3%E0%B8%B1%E0%B8%9E%E0%B8%A2%E0%B9%8C/ ) it’s possible you might sexy gaming ( https://nigoal123.org/sexy-gaming/ ) benefit from creating dream gaming ( https://nigoal123.org/dream-gaming/ ) quality content like blogs ka gaming ( https://nigoal123.org/ka-gaming/ ) and articles. Well-written

content can help you 123goal ( https://123goal.app/ ) attract an audience to 11hilo ( https://123goal.app/11hilo/ ) your brand by providing 123bets ( https://123goal.app/123-123bet/ ) them with helpful and insightful pggame123 ( https://123goal.app/pgslot-%E0%B8%9E%E0%B8%B5%E0%B8%88%E0%B8%B5%E0%B8%AA%E0%B8%A5%E0%B9%87%E0%B8%AD%E0%B8%95/ ) information. In turn big gaming ( https://123goal.app/big-gaming/ ) how to write an article.



guest: pgslot 10.06.2022 09:42
pg slot is an exciting pg slot ( https://pg-slot.game/ )game online on a mobile phone, and it's a lot of fun. Slots, a new website format, offer a basic play style that is stimulating and will not tire you as much as playing slots in the previous way.



putribebek 10.06.2022 16:05
<a href="https://164.92.183.175:9443/">MahkotaQQ</a>
<a href="https://gatotkaca123.com/">Gatotkaca123</a>
<a href="https://istanabet123.com/">Istana123</a>
Sukatoto ( https://direct.lc.chat/14118633/ )
Sukatoto ( https://secure.livechatinc.com/licence/14118633/v2/open_chat.cgi )
Sukatoto ( https://ohmy.bio/sukatoto )





Powered by Invision Power Board (http://www.invisionboard.com)
© Invision Power Services (http://www.invisionpower.com)