Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
Galya4595 |
Картинки: ___________2.JPG — (149.21к) ___________1.JPG — (156.94к) |
MMM Постоянный участник |
Надо было не концентрацию зонда понижать, а уменьшать их длину. |
ksm Постоянный участник |
что на кривой плавления или на электрофорезе? |
Carbon Copy Постоянный участник So close no matter how far |
|
Galya4595 |
Пипетки проверяли, всё в норме. После электрофореза продукт был одного размера, без шмира. В данном эксперименте мы не оцениваем уровень экспрессии, конкретно занимаемся анализом делеций/дупликаций в целевом гене. Завтра как раз планируем большее разбавление ДНК. |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
В принципе можно изменить эффективность и за счет температурных режимов цикла, но не зная природу фермента или зонда трудно что-то советовать. |
semi Постоянный участник Москва |
(Galya4595 @ 20.06.2018 19:21) .... Температуру отжига повышали, чтобы снизить количество неспецифики, к тому же, при повышении температуры эффективность действительно снизилась в сторону приемлемых значений (первый прикрепленный рисунок). .... Во второй раз у вас снизился выход продукта реакции, но эффективность реакции по прежнему выше 110%. Сравните RFU. Мне кажется, дело в разведении стандартов. Мне кажется, шаг разбавления в 2 раза не годится для построения калибровочной кривой. Тут дело даже не в криворукости, а в том, что двукратная разница слишком близка к порогу разрешающей способности для real-time PCR. Вот ваши разведения, если считать реакцию 100% эффективной: 1,65 1,87 1,91 2,01 2,51 1,28 2,05 1,81 1,98 В первом эксперименте, если убрать первую самую плохую точку, то slope снизится до -3,1, т.е, эффективность чуть снизится - до 107%. Во втором эксперименте, убрать вторую точку и slope станет равным 3,01, и эффективность снизится с 121% до 113%. Лучше все-таки провести серийные десятикратные разведения. Десятикратные разведения более устойчивы к ошибкам пипетирования и ошибок самих пипеток. Заодно увидите предел чувствительности для вашей системы. Не забывать менять носики и хорошо перемешивать растворы. И надо вернуться к первому варианту температурных режимов и концентрации пробы. Сообщение было отредактировано semi - 16.09.2018 22:01 |
semi Постоянный участник Москва |
Ну и ладно. |
Galya4595 |
|
watchesonline89 Постоянный участник |
|
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |