Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(arndt @ 18.10.2013 13:00) Хлебом не корми, дай человеку поиграться. Мы все, во главе с Генсеком, будем рады результатам твоих испытаний! |
genseq Постоянный участник |
2011–2013 Контракт № 1 от 01.02.2009 г. между ИБХ РАН и ООО "Амбер" (г. Санкт-Петербург) в рамках выполненияГосударственного контракта № 9411.1003702.13.031 ("Разработка и оптимизация высокоэффективной комплексной системы одноэтапного выделения, очистки и концентрирования нуклеиновых кислот для ПЦР-анализа с целью выявления и идентификации микроорганизмов и ДНК-маркеров», шифр "Биопроба") - Ответственный исполнитель. Синтез сорбентов, разработка биосепарирующих элеиентов. Ведение технической и финансовой документации.
|
arndt Постоянный участник |
(-Ъ- @ 18.10.2013 16:57) Хлебом не корми, дай человеку поиграться. Мы все, во главе с Генсеком, будем рады результатам твоих испытаний! с чем сравнить - могу с ЗимоКвик |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(genseq @ 18.10.2013 16:58) 2011–2013 Контракт № 1 от 01.02.2009 г. между ИБХ РАН и ООО "Амбер" (г. Санкт-Петербург) в рамках выполненияГосударственного контракта № 9411.1003702.13.031 ("Разработка и оптимизация высокоэффективной комплексной системы одноэтапного выделения, очистки и концентрирования нуклеиновых кислот для ПЦР-анализа с целью выявления и идентификации микроорганизмов и ДНК-маркеров», шифр "Биопроба") - Ответственный исполнитель. Синтез сорбентов, разработка биосепарирующих элеиентов. Ведение технической и финансовой документации. Силика, покрытая полианилином, пористая (70А)... нет, не знаком с такой фишкой. Да и мало ли модифицированных силикагелей используется для узкоспецифического применения. в хроматографии. |
arndt Постоянный участник |
(-Ъ- @ 18.10.2013 17:45) Силика, покрытая полианилином, пористая (70А)... нет, не знаком с такой фишкой. Да и мало ли модифицированных силикагелей используется для узкоспецифического применения. в хроматографии.
|
arndt Постоянный участник |
|
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(arndt @ 18.10.2013 17:16) Вот нашел, надеюсь, речь об этом методе:
|
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(arndt @ 18.10.2013 18:04) Иишо круче - асфальт с черноземом в смеси с кровью Недастатки (основные и навсидку) метода выд. ДНК с сорбентом, покрытым полианилином: 1. Лизис клеток придется проводить с использованием традиционных растворов с детергентами и Протеиназой К и, в связи с этим, еще больше разбавляешь исходный анализируемый образец. 2. ВсЁ задерживается на сорбенте, в том числе низкомолекулярные компоненты, детергенты и Протеиназа К (в чем очень сомневаюсь), а чистая ДНК, но уже сильно разбавленная пролетает сорбент и собирается в пробирке-приемнике. А если ДНК мало в образце, придется концентрировать. Но как ???? Методов конц-рования конечно много, но Меня волнует следы Протеиназы К, но больше всего - возможные и вечно сопутствующие выделению ДНК полисахариды, типа гепарина и т.д Сообщение было отредактировано -Ъ- - 18.10.2013 18:04 |
avial Постоянный участник |
|
-Ъ- Постоянный участник Москва |
|
Guest IP-штамп: frlHGMHi8Zz/M гость |
|
kloun IP-штамп: frfmrU8oUAU2w гость |
Мне бы пригодились колонки или 96-чашки, как у Zymo, но чтобы связывали всего 500нг - 1 мкг РНКи и можно было сконцентрировать в 3-5мкл воды всего - такая типа мини-плашки для РНКи. Тогда ОД не нужно было бы мерить) |
arndt Постоянный участник |
(kloun @ 19.10.2013 07:29) Про РНКу для сиквенса. Мне бы пригодились колонки или 96-чашки, как у Зымо, но чтобы связывали всего 500нг - 1 мкг РНКи и можно было сконцентрировать в 3-5мкл воды всего - такая типа мини-плашки для РНКи. Тогда ОД не нужно было бы мерить) вроде ест ПЦРные 96 плашки покрытые стеклом там связывание неболшое но одинаковое хотя можно шарики с адаптерами |
arndt Постоянный участник |
(kloun @ 19.10.2013 07:29) Про РНКу для сиквенса. Мне бы пригодились колонки или 96-чашки, как у Зымо, но чтобы связывали всего 500нг - 1 мкг РНКи и можно было сконцентрировать в 3-5мкл воды всего - такая типа мини-плашки для РНКи. Тогда ОД не нужно было бы мерить) надоело нормализоват мултиплекс библиотеки для Иллумины ? |
arndt Постоянный участник |
(kloun @ 19.10.2013 07:29) Про РНКу для сиквенса. Мне бы пригодились колонки или 96-чашки, как у Zymo, но чтобы связывали всего 500нг - 1 мкг РНКи и можно было сконцентрировать в 3-5мкл воды всего - такая типа мини-плашки для РНКи. Тогда ОД не нужно было бы мерить) |
kloun IP-штамп: frtsd0eQyf7/o гость |
(arndt @ 20.10.2013 10:47) Не совсем - мы можем сделать сотни и тысячи библиотек для РНК-сика даже руками за 2 дня - стоит несколько баксов на лунку - но нужно вносить образцы с малой разницей по массе - ну или мерить массу - что геморно. А вот если пронормализовать все РНКи даже с потерей по массе - то можно тысячи в день варить. |
arndt Постоянный участник |
(kloun @ 21.10.2013 10:48) Не совсем - мы можем сделать сотни и тысячи библиотек для РНК-сика даже руками за 2 дня - стоит несколько баксов на лунку - но нужно вносить образцы с малой разницей по массе - ну или мерить массу - что геморно. А вот если пронормализовать все РНКи даже с потерей по массе - то можно тысячи в день варить. этож сколько нужно Хисеков 2000 на 1000 РНКаСеков |
arndt Постоянный участник |
(kloun @ 21.10.2013 10:48) Не совсем - мы можем сделать сотни и тысячи библиотек для РНК-сика даже руками за 2 дня - стоит несколько баксов на лунку - но нужно вносить образцы с малой разницей по массе - ну или мерить массу - что геморно. А вот если пронормализовать все РНКи даже с потерей по массе - то можно тысячи в день варить. |
kloun IP-штамп: frDDLWOzZTiAA гость |
(arndt @ 21.10.2013 11:10) Просто много разных сиквенсов РНКа существует. Тот же бактериальный, да есть и пара других методов у человека, которые уже посланы, но пока не вышли в печать - там достаточно 2-10М пар - что при выхлопе ХайСика в 2-3 ярда позволит сделать от 100 до 1000 образцов зараз. Сейчас сделать 1 библиотеку стоит в фасилити около 400 баксов - то есть, только сделать 1000 библиотек займёт почти пол-ляма грина - очень дорого. |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(Guest @ 19.10.2013 03:31) Вопрос ко мне или Генсеку? В том формате выделения, в каком используются магнитные шарики - сорбция в объеме - вряд ли, только суммарные НК. На микроколоночках - другое дело, но это уже из другой оперы. |
arndt Постоянный участник |
(-Ъ- @ 22.10.2013 11:02) почему оффтоп - генсек же главный пропагандист полупроводниковых РНК-сек |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(arndt @ 22.10.2013 11:51) почему оффтоп - генсек же главный пропагандист полупроводниковых РНК-сек Но песня все равно не о нем - Генсек сейчас делает магносорбент, может быть даже лучший и дешевый в мире! |
srcamb IP-штамп: frtrF6yHEF6zM гость |
|
srcamb IP-штамп: frtrF6yHEF6zM гость |
зы Про обороноспособность я пошутил, если что |
genseq Постоянный участник |
(genseq @ 23.10.2013 19:37) Насколько я понял, Вам желательно иметь магносорбенты с белками A или G. Ещё лучше - с теми же белками, но для повышения сорбционной ёмкости иммобилизоваными на агарозной оболочке магнетитных микросфер. Или ещё проще - смесь клеток стафилококка с частицами магнетита, заключенными в агарозные гранулы. В 80-е кто-то производил препараты формализированных стафилококковых клеток, предназначенных для иммуносорбции (лиофильно высушенные, в больших ампулах). По нынешним временам это, наверное, не катит. Может быть, кто-нибудь имеет продуценты A/G белков (или сами белки в неограниченных количествах)? |
srcamb IP-штамп: frtrF6yHEF6zM гость |
|
genseq Постоянный участник |
Сообщение было отредактировано genseq - 24.10.2013 12:40 |
srcamb |
|
E-Student |
Прошу совета у опытных людей. У меня диплом по магнитным частицам. Я синтезирую магнетит, а потом покрываю его силикагелем путем гидролиза ТЭОС в сильно щелочной среде. На полученные частицы я пытаюсь адсорбировать ДНК лосося и РНК дрожжей из раствора. Условия адсорбции - 5М раствор гуанидина тиоцианата и слабокислый рН (взято из литературы). Так вот ДНК адсорбируется отлично, а РНК совсем нет. Если кто-либо сталкивался в своей работе с подобной проблемой, подскажите в какую сторону копать. Буду очень признателен за любую помощь |
avial Постоянный участник |
|
distemper Постоянный участник |
(E-Student @ 25.11.2013 16:40) Здравствуйте! Прошу совета у опытных людей. У меня диплом по магнитным частицам. Я синтезирую магнетит, а потом покрываю его силикагелем путем гидролиза ТЭОС в сильно щелочной среде. На полученные частицы я пытаюсь адсорбировать ДНК лосося и РНК дрожжей из раствора. Условия адсорбции - 5М раствор гуанидина тиоцианата и слабокислый рН (взято из литературы). Так вот ДНК адсорбируется отлично, а РНК совсем нет. Если кто-либо сталкивался в своей работе с подобной проблемой, подскажите в какую сторону копать. Буду очень признателен за любую помощь а вы сорбируйте РНКу в 2М гуанидине:50% этанол, сядет как миленькая |
genseq Постоянный участник |
В кислой среде идёт химическая реакция образования связей P-O-Si, которые при защелачивании гидролизуются. Двунитевая ДНК из-за жёсткой вторичной структуры связывается силикатной поверхностью в отдельных точках, а РНК отличается повышенной гибкостью, связывается гораздо прочнее и смывается (гидролизуются все связи) медленнее. Если это правда, то смывать РНК нужно не спеша. Дайте сорбенту с ней постоять часок-другой в слабощелочном буфере (pH~9). Вы будете смеяться, но, судя по всему, ионная сила при смывании ДНК/РНК значения не имеет. Сообщение было отредактировано genseq - 28.11.2013 09:51 |
E-Student |
(distemper @ 26.11.2013 07:12) Спасибо, попробую! (genseq @ 26.11.2013 11:07) Подозреваю, что дело не в посадке РНК, а в её десорбции. В кислой среде идёт химическая реакция образования связей P-O-Si, которые при защелачивании гидролизуются. Двунитевая ДНК из-за жёсткой вторичной структуры связывается силикатной поверхностью в отдельных точках, а РНК отличается повышенной гибкостью, связывается гораздо прочнее и смывается (гидролизуются все связи) медленнее. Если это правда, то смывать РНК нужно не спеша. Дайте сорбенту с ней постоять часок-другой в слабощелочном буфере (pH~9). Вы будете смеяться, но, судя по всему, ионная сила при смывании ДНК/РНК значения не имеет. Дело именно в адсорбции. Измеряю оптическую плотность раствора ДНК или РНК, затем инкубирую его с частицами, потом опять измеряю оптическую плотность. В случае ДНК она уменьшается, а в случае РНК - нет. |
ASDF Постоянный участник |
|
VZ IP-штамп: fr3WKvPfRtoWk гость |
(ASDF @ 27.11.2013 21:02) Похоже, особой разницы нет. |
Guest IP-штамп: frQVZIqPyXv.U гость |
|
genseq Постоянный участник |
Похоже, нужно переходить на сухие препараты. |
Guest IP-штамп: frdPTpqcWQV5A гость |
|
genseq Постоянный участник |
На днях обнаружил по соседству сушилку. Надеюсь, с её хозяевами удастся договориться . Приготовил несколько стограммовых препаратов. Постараюсь сегодня оценить их фракционный состав и засушить . |
genseq Постоянный участник |
Исходная партия оседала очень медленно и легко ресуспендировалась. Сухие почему-то ресуспендироваться в воде не желают. Быстро оседают на дно. Похоже, придётся или искать распылительную сушилку, или не выпендриваться и делать как все - поставлять в виде суспензии. |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(genseq @ 31.07.2014 09:32) Вчера высушил на лиофильной сушке 15 грамм. Исходная партия оседала очень медленно и легко ресуспендировалась. Сухие почему-то ресуспендироваться в воде не желают. Быстро оседают на дно. Похоже, придётся или искать распылительную сушилку, или не выпендриваться и делать как все - поставлять в виде суспензии. Правильно, не выпендривайся . Замени среду Ц/Ф-нием пару раз, добавь забуференную среду с консервантами и на 4 оС. Главнее - нанести плотный надежный слой силики. И привези на испытания. |
genseq Постоянный участник |
(-Ъ- @ 01.08.2014 11:23) Правильно, не выпендривайся . Замени среду Ц/Ф-нием пару раз, добавь забуференную среду с консервантами и на 4 оС. Главнее - нанести плотный надежный слой силики. И привези на испытания. Ценрифугированием - это слишком сложно. Проще примагнитить. Среду забуферивать тоже не нужно. Потом придётся разбуферивать. Слои за отчётный период наловчился наносить любой толщины. Но для их уплотнения нужно время. Так что поставил пол кило частиц на созревание и уехал отдыхать. Через пару недель вернусь и с ближайшей оказией передам или сам привезу на испытания. Сообщение было отредактировано genseq - 01.08.2014 18:51 |
genseq Постоянный участник |
Проверку эта партия прошла успешно. Осталось её (0,6 л) разлить по пузырькам (по 20 мл, т.е. ~30 шт.). Главная проблема - соорудить приличные этикетки типа: Сообщение было отредактировано genseq - 01.10.2014 10:10 Картинки: MS1.JPG — (36.4к) |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
Я так и не забрал образец на испытание у соседей. |
genseq Постоянный участник |
Пора переходить на реакторы объёмом 5...10 л. |
ASDF Постоянный участник |
|
ASDF Постоянный участник |
А колонок много, и их регенирировать можно. |
genseq Постоянный участник |
(ASDF @ 21.10.2014 07:29) genseq посоветуйте буфер для связывания одноцепочечных коротких последовательностей (после реакции сиквенса) на колонке с силикой. У меня Binding buffer кончился вот от этого : А колонок много, и их регенирировать можно. На практике не проверял, но теоретические основы таковы: 1. pH<7 (сильно закислять нет смысла). 2. Обязательно "посолить" (например, KCl или CH5N3*HCl >0,3 M). 3. ЭДТА Низкая pH снижает отрицательный заряд силики и концентрацию гидроксилов в растворе. Соль предотвращает отталкивание ДНК отрицательно заряженной силикой. Достаточно 0,2 М, но для полной гарантии добавляют до 0,4 М. ЭДТА - чтобы убрать магний. Связыванию ДНК он не мешает, но может затруднить десорбцию. Так что можно попробовать (теоретически) KAc 0,3 М + 1 mM ЭДТА pH 6,0. Сообщение было отредактировано genseq - 27.05.2020 21:55 |
ASDF Постоянный участник |
Вы свои сорбенты не собираетесь для этого приспособить? Дело то хорошее и аналогов на рынке мало. |
genseq Постоянный участник |
Если захотите поэкспериментировать со своими препаратами, то сорбентами обеспечу бесплатно и в любых количествах. |
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |