Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
dan14444 Участник |
наконец-то мы дошли до того, что Вы хотели спросить. Т.е. тема должна звучать так. Как на Арии с таким-то набором фильтров получить данные (т.е. отсортировать) некий класс митохондрий. И почище-почище. А потом использовать эти данные для прозрачного грантового намёка, что прибор с иными (улучшенными и дополненными) характеристиками будет Nature'ы печь как пирожки. Правильно? Философски да, исторически нет . Тема началась ДО того, как я обнаружил, что на Арии митохондрии сортировать хоть и криво, но получается. Исходно планировалось на основании старых данных по "проточной митохондриометрии" на самодельном приборе - делать "прозрачный грантовый намёк" на "версию 2", с "блэкджеком и... сортером. Для этого нужно определится с исходным "шасси" - это проще чем "с нуля". Так возникла тема. А так все правильно. Опять вернемся...Откуда на 515 сигнал от SS на 488,еслирассеяние не комбинационное? Вот аутофлуоресценция- да, будет. Автофлуоресценцию пробовал исключить уф-прожигом и спектром ин-балк. Не гарантия, но всё же. А "откуда может быть" - так фильтры не идиальны. Если ОД на 25нм в сторону всего 3-4, то пробъёт обязательно. Я в таких случаях на своём приборе ставил бэндпасс на лазер от гармоник, дополнительный бэнд- или лонгпасс на детектор, ну и щели конопатил. Тут, к сожалению, не имею возможности приложить шаловливые ручки... тогда понятно...нужен свой доступк процессу,а не толькок финальным данным. Он каг бэ есть... т.е. я сижу рядом, и если я скажу оператору, чего конкретно делать в софте - она сделает... но вот вдумчиво посидеть и поразбираться с прибором и софтинкой пока нет возможности.последовательный гейтинг чем не угодил для многомерности? Когда поведение частиц буду заранее знать - так видимо и будет, а пока быстро выловить нужные группы на множестве проекций сложновато. На DiVa даже 3Д не посмотреть. Утаскиваю на малознакомый FlowJo, там хоть что-то можно - но постфактум. Вообще, хотел бы экспортировать raw data в привычный IgorPro, но пока не понял как. По формату данных и экспорту где бы посмотреть?... А для композитного параметра-свое Булево выражение напишите, и введите ,как PC А вот тут поподробнее, если можно. Описаловки к Diva читать начал, но без собственно софтинки под рукой - идёт мееедленно. Кстати и для FlowJo нашёл только куцые до неприличия обучалки - буду благодарен за сцылки...Сообщение было отредактировано dan14444 - 12.05.2017 18:11 |
Леонид В Постоянный участник Квебек |
(dan14444 @ 12.05.2017 10:58) что именно криво? не философски, а конкретно с цифрами и графиками. Насколько кривизна критична ? |
dan14444 Участник |
В результате даже для JC-10 пока - до 90% уходит в мусор, в сравнении с NAO. И даже по NAO общее количество событий в разы меньше ожидаемого, а поскольку чутьё на гранце - фиг проверишь, артефакт это пробоподготовки, анализа, или ещё чего. Графиками это представлять ПМСМ незачем, но если очень интересно - могу плотов в почту накидать . В общем, на прелим дату Арии похоже хватит, а дальше - увы. Ну дык на то она и цитометр в ЦКП, а не митохондриометр в лабе . |
Леонид В Постоянный участник Квебек |
(dan14444 @ 12.05.2017 12:45) В первую очередь тогда каков поток (давление) ? (dan14444 @ 12.05.2017 12:45) время инкубации и концентрация JC-10 ? (dan14444 @ 12.05.2017 12:45) а если один раз посмотреть в камеру Горяева и подсчитать глазом насколько реальность отличается от ожиданий? |
dan14444 Участник |
В первую очередь тогда каков поток (давление) ? Цифру не скажу, оператору говорил ставить на минимум. время инкубации и концентрация JC-10 ? От микромоля до 10 пробовал, инкубация 10-60мин. Это сильно с запасом - пробовал добавлять субстрат прямо в цитометре, эффект мгновенный (и очень забавный - митохондрии бьются на три(!) субпопуляции, щаз копаю это дальше). Правда видны только самые отожранные. А вот разобщители за 5-10мин 590нм не просаживают - видимо агрегаты довольно стабильны. а если один раз посмотреть в камеру Горяева и подсчитать глазом насколько реальность отличается от ожиданий? В одном ооците 100000+ митохондрий... Кристы в оптику не видны, фиг отличишь от прочего дебриса... а по кардиолипину смотреть - у меня глаз всё ж не фотон каунтер.
|
Леонид В Постоянный участник Квебек |
(dan14444 @ 12.05.2017 15:15) диаметр сопла? (dan14444 @ 12.05.2017 15:15) В одном ооците 100000+ митохондрий... Кристы в оптику не видны, фиг отличишь от прочего дебриса... а по кардиолипину смотреть - у меня глаз всё ж не фотон каунтер. не в клетке, а в растворе готовом к сортировке при окраске NAO и на фл. микроскопе |
dan14444 Участник |
диаметр сопла? Сотка, без возможности замены к сожалению. Впрочем, разбавление никто не отменял.не в клетке, а в растворе готовом к сортировке при окраске NAO и на фл. микроскопе Понятно что не в клетке, но "минимальная партия" из одной клетки - от ста тыщ . Но дело не в репрезентативности малой выборки, а в том, что и под микроскопом всё обнаружить не очень быстро и просто. В смысле, просто "посмотреть на камеру Горяева" на абы чём не получится.А вообще да, данные будут комбинироваться с микроскопией. |
Леонид В Постоянный участник Квебек |
(dan14444 @ 12.05.2017 17:54) это, pardon, как? оператор не может заменить сопло? Оператор сортирует митохондрии на сотке? прошу простить за грубость, но “а по шее“? (dan14444 @ 12.05.2017 17:54) и под микроскопом всё обнаружить не очень быстро и просто. В смысле, просто "посмотреть на камеру Горяева" на абы чём не получится. Вы упомянули детекцию (про выход после сортинга пока не говорим) малого числа митрохондрий относительно “ожидаемого“. Вопрос прост, можно ли “ожидаемое“ заменить на реальное, посмотрев в микроскоп на содержимое именно той пробирки, которую вот-вот поставят в сортер?
|
dan14444 Участник |
это, pardon, как? оператор не может заменить сопло? Оператор сортирует митохондрии на сотке? прошу простить за грубость, но “а по шее“? Авторитету пока тут не наработал. Но мысль правильная . Вы упомянули детекцию (про выход после сортинга пока не говорим) малого числа митрохондрий относительно “ожидаемого“. Вопрос прост, можно ли “ожидаемое“ заменить на реальное, посмотрев в микроскоп на содержимое именно той пробирки, которую вот-вот поставят в сортер? Так говорю ж - "в принципе" можно, а "в кожухе" - пока не очень. По вышеописанным причинам. Собсно, для микроскопа сохраняются все те же сложности, что и для цитометра (что-то проще, что-то сложнее... суммарно так на так). |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
|
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
|
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
|
watchesonline89 Постоянный участник |
|
« Предыдущая тема · Клеточные технологии · Следующая тема » |