Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
Astate IP-штамп: frTlWdNmzlEpc гость |
После выделения белки требуется измерить методом Брэдфорда, а затем определить повреждения от окислительного стресса (карбонильные группы). Поэтому добавлять восстанавливающие и окисляющие агенты нельзя, а без них очень плохо растворяется даже после нагревания. Заранее спасибо. |
MMM Постоянный участник |
Растворяйте кипячением в SDS долгим и многократным. Потом измеряйте концентрацию по Лоури. Брэдфорд для SDS не подходит. Карбонилы как определять собираетесь? |
Blaid Постоянный участник |
Непосредственно с образцами, содержащими белки, нельзя работать? Метод, скорее всего, с использованием 2,4-динитрофенилгидразина, в котором - после инкубации образцов с этим самым 2,4-ДНФГ - белки осаждаются ТХУ. Так, может, и выделять вовсе не надо?.. |
Guest IP-штамп: frjQ2JohnsuSs гость |
|
MMM Постоянный участник |
Тризол и для рнк не лучший вариант , а белки из него воще дрянь. ---RSBT протокол конечно быстрее, Интересно что скрывается за этими 4 буквами --- но и с тризолом проблем нет. Видать вы выделяете из клеточных культур и смотрите qPCR на фрагментах 100-120нп. А для этого ваще можно ничего не выделять и без тризола обойтись. --После добавки этанола эекземпляры в центрифугу и осадок промываю в GHCl Интересно сколько у вас там молей гуанидин хлорида и сколько он с промывками белка отсасывает. -- три раза в комнатной температуре по 20 мин, потом 70 процентов этанол тоже 20 мин, опять центрифуга, потом даю белку высохнуть и добавляю 10М Urea. Оставляю так не трогая на ночь на столе. На след день добавляю 1:1 2xSDS и в соникатор. И нанодроп. Нанодроп?! в 5М мочевине?! ню-ню! разве что рассеяние от нерастворившейся суспензии посмотреть. И вот пишет человек "2хSDS" и по отношению к чему он двукратный это мы наверное телепатически должны прочесть. --Чтобы использовать нанодроп, надо НЕ добавлять BPB в 2xSDS. Это из-за него нанодроп не получается. Интересно кто такое BPB? И зачем его в SDS добавлять. Нанодроп загнется от 5М мочевины. Может это бромфеноловый синий? Это ж кому в голову то может придти: измерять поглощение белка на 280нм в растворе БФС!? А после расчетов добавляю эти белки в 1x SDS уже с BPB, чтобы видно было цвет. Все отлично получается. Уже 8 лет так работаю. Так себя мучить - 8 лет! |
guest: Ольга IP-штамп: frjQ2JohnsuSs гость |
|
Guest IP-штамп: frjQ2JohnsuSs гость |
(guest: Ольга @ 20.03.2018 21:13) Прошу прощение. Так и знала, что не смогу объяснить. Мне просто стало интересно почитать что-нибудь из того, чем я занимаюсь - по-русски. Я уехала в 27 лет и мол биологию уже изучала в штатах с нуля и по русски ни слова сказать не могу. Нашла этот форум. Мне показалось, что я что-то понимаю. Да ладно, что вы придираетесь? Говорю же, что работает. Нанодроп получается. Пики от экземпляра к экземпляру совпадают. Ponceau S показывает ровные и равные bands. Я ни на что не претендую, звезд с неба не хватаю, но очень счастлива, что моя работа - это мое хобби. У меня такие картинки получаются (не только Western), что мой профессор комплементы получает на встречах и все мои картинки во всех публикациях из-за качества. Так что не хотите - не верьте. Соникатор - ручной, не ванна. 10 процентов по 10 sec 2 раза достаточно. SDS - 1 percent final. Правда не смейтесь. Я уже вижу, что зря поделилась.
|
Tom1 Постоянный участник |
|
watchesonline89 Постоянный участник |
|
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |