Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
Der-ro Участник |
|
|
[Текст переведён с транслита] |
tupoi Постоянный участник |
|
Der-ro Участник |
|
|
Я пока делала форез тоталной РНА, и у меня вместо 2 полос - несколко, штук 5, где-то. Это тоже ДНА? Или пластидная РНА ? Форез был нередузируюсчий, обычны ТАЕ. Потом я сделала форез с формалдегидом, один раз - добавив ЭтБр в гел, и получился офигенный бацкгроунд, с трудом можно было различит РНковые полоски. Это потом я прочитала, что этидий связывается с формалдегидом и не дает смотрет на РНКу. Второй раз я делала гел без этидия, а ЭтБр добавляла к самплес, но тоже не особо получилос, вроде 2 полоски на фоне шмера, а может, это шмер от этидия вообсче, которы связался с формалдегидом по ходу фореза. Делат гел и красит его в ванночке с раствором ЭтБр - не хотелось морочится , это ж надо RNAse free все делать, ванночку, раствор, поленилась. А возможно ли теперь эту РНА пропустить через цезиевы градиент? Все протоколы описаны для лизата, а у меня РНА в ДЕПЦобработанной водичке. Надо в буфер ее переводить? [Текст переведён с транслита] |
Veshka Постоянный участник Москва |
|
|
Я не совсем разбираюсь, вернее, совсем не разбираюсь - а какая метка - это при first strand synthesis контрол с P32 ATP ? А что потом делают с этим контролем, отмывают от не включившейся метки и меряют кол-во включившейся на счетчике? Как различают ДНК от РНК? И как калибруется система по количеству ДНК? И есчо - гуанидин можно добавить прямо в раствор тотальной РНА (сделат раствор гуанидина и накапать до нужной концентрации)-или РНА осаждать и потом растворять в гуанидиновом растворе? И какие концентрации - если в лисис- буфере (по методе с цезиевым градиентом, что у нас в лабе использовали) 5,5,М цезий, то сейчас можно ту же концентрацию взять? Как это соображается? Спасибо большое всем ответившим. [Текст переведён с транслита] |
Veshka Постоянный участник Москва |
3. Концентрация гуанидина - от 4 до 8 молей - любая. Ну, буфер, саркозил, меркаптоэтанол опять же. Цезий, кстати, нужно брать 5.7 моля, а не 5.5. |
|
2. ??? Что есть мабука? (-: Мне стыдно от моей тупости и невежества, и назойливости, но что проишодит когда РНА достраивается рандом -праймером (что значит с дезокси буквой?) ? И что меряется до обйедания ДНАзой и после? Я могу нафантазировать, но это может быть далеко от реалности, а про это я не читала нигде )-: 3. Сорры, 5,5, молей концентрация гуанидина, а не цезия. Так надо все таки РНКу в полноценный буфер с МЕ и саркозилом переместить? Осадить из воды и растворить ? [Текст переведён с транслита] |
|
[Текст переведён с транслита] |
|
[Текст переведён с транслита] |
tima |
[Текст переведён с транслита] |
|
В Маниатисе, 2нд едитион в описании isolation rna from mammalian cells стр.7.9.есть ремарка, что при выделении РНа из клеток которые были инфицированы вирусной ДНА или трансфицированы ДНА может статься , что фрагменты ДНа, комплементарно гибридизируются с РНА и служат праймерами в обратно-транскриптазной реакции. Это ведет к ошибочному маппингу 5ь конца мРНА и генерации укороченных кДНА клонов. Мне надо создать експрессионную библиотеку и затем тестировать на наличие белков-аллергенов - для этого используется сыворотка пациентов , которую трудно добыть и нужно бережно рашодовать. Поетому мне важно, чтоб клоны были не укороченные, а нормалные. И тут я прочитала, полазив по форуму, что без цезия не обойтись если нужно получить чистую РНА без примесей ДНА. Вот я и не знаю, как быть, спасают ли киты от контаминации, или нужен все-таки цезий. [Текст переведён с транслита] |
|
[Текст переведён с транслита] |
Veshka Постоянный участник Москва |
РНК вообще говоря достраиваться не будет. Праймера нужно брать мало (0.5-1 пикомоля). Будет достраиваться ДНК. Если достройку не делать при комнатной температуре, праймер на себя достраиваться не будет. После достройки можно увидеть есть ДНК или нет. Даже на форезе. После объедания ДНКазой Вы сможете удостовериться, что она сработала - если это так, метка по большей части перейдёт в ТХУ-растворимое состояние. Проблема не в терминации и гибридизации с ДНК, а в том, что несмотря на вроде бы малые её количества она лезет и через олигоДТ и потом большая часть клонов это ДНК а не кДНК В данном контексте обозначает непременную последовательность действий. РНК можно не осаждать. Да и не нужно. Просто добавьте гуанидина с буфером. 5.5 молей - нормально. Меньше - тоже не так и плохо. |
|
С сигмой пячально, кто ж знал. Коллега сказал , что это хорошая Дназа, вот, я ее уже и заказала. Вообсшче ситуация такова, что все люди, кто здесь работал с созданием библиотек, делали цесиевы градиент, но из тех оснований, что они мелкими китами не могли выделить нужное количество рнк. А вовсе не изза чистоты експеримента (ну, немцы). То что цезий позволяет получить чисты продукт - это как то второстепенно. У меня же из этих бобов выделяется приличное кол-во рнки и они считают , мое началство в том числе, что это прекрасно, цезий не нужен, только в путь, давай клонируй. Я клонирую, получится не експрессионная чистая библиотека, а лиш бы что, и вся работа запотрется, переделывать наново, и тд, мне это не нужно. Счас я их пытаюсь убедить, что цезий просто необходим, чтоб перестраховаться. Но это ужасно нелегко, по причине моего слабого неубедителного немецкого (а английски не лучше), а так же по причине того, что я не спез, не шарю вообшче. А тут такой менталитет, что ни у кого ничего не спросиш, потому что создаеш себе репутацию незнайки и причем, навечно. Более того, реакция такая, как будто их грабят и убивают и отнимают самое ценное, когда пытаешся вытянуть некую информацию. Поетому копаюсь сама все семь раз не по-русски и можно голову свихнуть. Етот контроль с деокси-праимером - тут в ките инструкция, кДнк праймируется с олигодТ или рандом хинд3 и 5-ме дЦТП встраивается в обе страндс без екстракции и преципитации между 1 и 2 стан синтезом. Это и есть то самое - что надо кленовым или секвеназой достроить? Далше они пишут - от обсчего обйема 1 странд синтез взят аликвоту и добавит радиоактивны АТП и инкубироват в тех же условиях , что и всю бадю при 37 град 1 час. Потом осадить ТХУ или посмотреть на счелочном геле- это оно? А как это меряется после достройки с этим рандом деокси-праймером? Прошу прошчения за занудство. [Текст переведён с транслита] |
|
Или полиТ праймеры вместо того, чтоб садится на РНК, садятса на эти куски ДНК и достраивают их? Но раз эти куски короткие, то там и синтезироватся нечему, и клоны будут короткими? Помогите разобраться, пожалуйста. [Текст переведён с транслита] [Текст переведён с транслита] |
|
<img src="graemlins/weep.gif" border="0" alt="[рев в 3 ручья]" /> |
Veshka Постоянный участник Москва |
У немцев есть такое свойство. Вообще, если мало знаешь жалко делиться - а вдруг тот с кем поделился после этого будет знать уже больше тебя? Ведь если знаешь мало, этот порог близэнько-блзэнько Инструкции в ките положите обратно в кита пусть они там как планктон... Я не синтезе кДНК говорю - прочитайте ещё раз и не торопясь подумайте чём. Без обид, Ок? То, что в Маниатисе пишут не про фагов или тот же цезий нужно делить на 8 или 32. Если в препарате РНК ТАК много ДНК, что она мешает вот так вот синтезу, значит препарат надо было уже до синтеза выбросить. Основная проблема - в силу относительной неэффективности всех РНКово-кДНКовых процедур даже незначительные примеси ДНК потом клонируются и составляют большой процент библиотеки, а это не GLP |
|
Я вот сейчас как раз и читаю. А что значит - ето не GLP? |
Veshka Постоянный участник Москва |
|
can be worse Участник |
|
|
Пагибаю от мигрени третий день, жара на меня плохо влияет. )-: [Текст переведён с транслита] |
|
RNA выделяем Gentrой. Контаминация DNA есть, но не мешает. spring_r@yahoo.com |
kuku |
|
kuku |
[Текст переведён с транслита] [Текст переведён с транслита] [Текст переведён с транслита] |
|
Может ДНК и не мешает. А если мешает - то интересно, почему мешает. Праймером она быть не может, на нее садятся полыТ праймеры и реверсе транскриптаза успешно ее амплифицирует. Ну, получается смешанная библиотека, а чем это чревато? Насколько это принципиально или не принципиально? Не ГЛП, как говорит Вешка. (-: Я уже осваиваю цезиевы градиент, а именно, нахожусь на последней стадии - растворения рнки в депц-воде с целю измерения концентрации полученного продукта. Далее планирую обожрать дназой. И потом выделить мрнк на полыТматриксе. Заодно и избавлюсь от остатков нуклеотидов и дназы. В инструкции к дназе написано, что после обработки можно сразу гнеть рт-пцр а в качестве контроля - пцр без обратной транскриптазы. Как конкретно это делается, нигде не могу найти. Спросит не у кого , ибо никто этим не морочился никогда. Итак уже скоро снискаю себе нехорошую репутацию со своим педантизьмом. [Текст переведён с транслита] |
kuku |
Как делать и РТ-ПЦР написано в инструкции к тому киту для РТ-ПЦР, кот. ты будешь использовать. НО-РТ контроль (ПЦР без обратной транскриптазы) - все тоже самойе, но без РТ, т.е. сразу делайешь ПЦР по той программе, кот. ты используйешь в РТ-ПЦР. Почитай на ввв.амбион.цом. [Текст переведён с транслита] |
|
Я не специалист, может, для специалистов, это само собой разумеюсчиеся весчи - а для меня это тупик пока что. На амбионе тоже самое и написано, догадайся мол сама. [Текст переведён с транслита] |
|
А простите, нескромный вопрос - сколько раз вы делали kДНА библиотеки и на каком об'екте? [Текст переведён с транслита] |
kuku |
Напиши на мыло свой телефон. |
|
[Текст переведён с транслита] |
tupoi Постоянный участник |
|
|
Выделяем RNA, как я уже сказала, китом Gentra (Biozym). Из котиледонов и из листьев. Из семенной оболочки выделяется плохо. Дл нее использую специальный метод для тканей с большим содержанием полисахаридов. На дайнабидсы садим mRNA. А там уже после промывок никакая ДНК не страшна. Можно проверить контаминацию ДНКой простым ПЦР, или даже уже РТ-ПЦР, если к какому-нить хаузкипинг гену подобрать праймеры, узнающие геномную последовательность с интроном. Я встречала случаи, когда контаминацию в РТ-ПЦРе интерпретировали как альтернативный сплайсинг. Библиотеки у нас получаются хорошие. |
|
|
|
|
|
Потом я использовала опять qiagen для выделения мрнк и тут у меня облом, не знаю, что я утварила, но из 3 г тотальной рнки я вытянула 2! мкг м РНк, грабеж средь бела дня. Сначала получилось 6 мкг, и я решила обогатить, что называется , полученную фракциу, все, что осталось от первого раунда прогнала все тоже самое по второму кругу и вот, конечный результат. 1мкг пошел на гель, один остался. Вот не знаю, пустить этот мкграмм в синтез цднк или не стоит. Вообсшче, как получить побольше цднк - поможет ли увеличение времени реакции и ингредиентов? [Текст переведён с транслита] |
Veshka Постоянный участник Москва |
|
|
А вот что такое суперскрипт и 10(9) по суперкоилу , сорры, опять :teepot Как в том анекдоте - думай , Петька, думай! (в какой руке бутылка - в левой!) [Текст переведён с транслита] |
Veshka Постоянный участник Москва |
10(9) это эффективность трансформации микрограмма суперскрученной плазмиды. На химически компетентных клетках практически недостижима, что бы там не писали. Только на электропораторе. Для того, чтобы эффективно электропорировать несколько микрограмм лигата, нужно извести не одну кювету, а несколько десятков и несколько милллилитров электрокомпетентных клеток, иначе эффективность резко падает. |
|
[Текст переведён с транслита] |
|
Я ползовался тем же китом для виделеня РНК, Без последуучеи ДНКзнои обработки ВСЕГДА остается ДНК, даже если обрабативаеш "на колонке" ДНкзои Эиаген. Потом я стал применят ДНКзу "Амбион". Оказалос успешно. Проблема толко в том, что РНК не видерживает болше 2 размораживании - деградирует [Текст переведён с транслита] |
Veshka Постоянный участник Москва |
|
|
Но я чисчу не на колонках с Qiagenovskoj ДНАзой, тоталную РНк я выделила с Cs-градиентом, потом чисчу ДНАзой от Sigma, а потом только на полиТ qiagen для выделения мРНК. Таким вот образом. Да, а молони тоже входит в состав ламбда-китов novagenа. А вообсче у нас некоторые чистят и на qiagenovskih колонках с ихнехй дназой, но никак не проверяют, осталас дна или нет. И когда задаеш вопросы - а как вы проверяете, то косятся, как ленин на буржуазию и и толкают пламенные речи, что дназа - это ядреное срэдство против дна, и после нее все чисто, какие есчо проверки. [Текст переведён с транслита] |
f1dark Постоянный участник Lahore, Punjab, Pakistan |
|
Ufa1688 Постоянный участник |
|
guest: 123vega IP-штамп: frXqkB4MpP2jQ гость |
|
Ufa1688 Постоянный участник |
|
Jaislmer Escort IP-штамп: frQrtJ1xVpdzY гость |
Website Our Linkes |
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |