 * |   |
|
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда |  Zbio-wikiNG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: |
|
Правила
* Подбор колонки для хроматографии
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.
   |
 Na-ta-ly |
 12.05.2009 16:22
|
|
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость |
12.05.2009 16:40
Это Гистоны!? |
|
Tom1 Постоянный участник |
12.05.2009 16:48
2. Похоже на гистоны эт точно. 3. Если хотите более развернутого совета опишите проблему по подробнее что откуда и зачем.... 4. так с ходу посоветовал бы в дополнение к " восприемнику" фосфоцеллюлозу ...... |
|
Fritz Постоянный участник Москва |
12.05.2009 17:08
|
|
Tom1 Постоянный участник |
12.05.2009 17:20
|
|
Fritz Постоянный участник Москва |
12.05.2009 18:16
|
|
Na-ta-ly |
13.05.2009 12:28
Это не гистоны, это антимикробные пептиды, которые мне нужно выделить из моих трансгенных растений. То, что они маленькие затрудняет процесс. Хороша была бы ВЭЖХ, но ее, к сожалению нет. Поэтому остается ионообменная. Где-то прочла, что поверх еще можно и аффинную, но опять же белки-то - маловаты, как лиганд подобрать? А вот как бы поподробнее о подборе наполнителя для колонки, ведь среди "СМ или S сефароза, биогель, можно даже сефадекс 25" выбрать как-то надо - ? |
|
Fritz Постоянный участник Москва |
13.05.2009 13:42
Ну а вообще-то 15-20 кДа, это уже не пептиды...а белки...  Так что тут можно и с гель-хроматографией поиграть после ионообменки,если будут примеси посторониие в элюате.
|
|
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость |
13.05.2009 14:02
Не не затрудняет, а облегчает например можно использовать ультрафильтрацию с отсечкой на 25 кДа. - Где-то прочла, что поверх еще можно и аффинную Ну можно и не только аффинную. Вообще-то кама-сутра за авторством Остермана, предлагает много вариантов и сочетаний. -А вот как бы поподробнее о подборе наполнителя для колонки, ведь среди "СМ или S сефароза, биогель, можно даже сефадекс 25" выбрать как-то надо - ? Чего больше в тумбочке и что ближе стоит. В любом случае предстоит секс по подбору условий хроматографии. Почитайте две книжки Скоупс Метиод очистки белков и Остерман Хроматография белков и нуклеиновых кислот. |
|
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость |
13.05.2009 14:10
Антитела, антитела, Ватсон |
|
23ezhik |
20.05.2009 17:40
Может вообще что-то другое надо использовать... |
|
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость |
20.05.2009 18:12
-Почитайте две книжки Скоупс Метиды очистки белков и Остерман Хроматография белков и нуклеиновых кислот. -минимальный перечень оборудования Колонка - длиная трубка d/L >=1/10 с фильтром (чтоб не вытекала тв фаза) и утончением с одной стороны и расширением с др. стороны хроматографический сорбент ну и пробирки СФ это уже общелабораторное. Но это минимальный набор, а максимальный не имеет границ и границ цены. упить все можно у друзей-конкурентов Био-рад и Дженерал электрик (бывший амершам, бывший фармация). в принципе колонки можно и самому смастрячить трубки(лучше прозрачные) и тд. А вот хроматографич. фазы придется покупать... Гель фильтрация не лучший способ для очистки, а вот для определения мол веса уже чистого белка это удобно(хотя можно использовать и разные электрофоретические методы), сорбенты для гельфильтрации я бы посоветовал сефакрилы от Фармацми(дженерал электрик) Для очистки можно использовать(совсем не обязательно гельфильтрацию) и высаливание сульфатом аммония и ионобменную хроматографию, гидрофобную и их комбинации. Читайте, указаные выше книжки. В вашем случае возможен вариант аффинной хроматографии на не разрушаемом аналоге субстрата или на обратимом ингибиторе фермента. |
|
дмитрий9999 |
22.04.2012 20:24
1. Найдите сорбент (катионит) Dowex 50WX8 (200-400 меш,50-75 мкм). Регенерация сорбента: промыть 1 н NaOH. промыть водой до pH-5-7, промыть спиртом(этиловый), для удаления мономеров. 2. Найдите стеклянную колонку или другую с диаметром 1 см, можно с рубашкой или без нее, пульпой загрузите сорбент в колонку до высоты слоя - 40 см-50 см, потом для усадки сорбента в колонке промойте 1 н NaOH, водой до pH=5-7. 3. Приготовьте цитратные буферные растворы с ионной силой по Na-0.2M: возьмите 25,53 г лиммоной кислоты(хч,безводной, кристаллическая) и 15 г NaOH(кр), растворите в 1л, после растворения pH будет должен быть равен 6,25. Добавте азид натрия так, чтобы в растворе его содержание было равным 0,02 %. Приготовить растворы 0,2М НСl и 0,2 М NaOH. Приготовить цитратные буферные растворы с pH=4.25; 6.25; 8.25; 10.25; 12.25, последовательно подводя pH в первоначальном растворе с pH= 6.25 0,2 М HCl и NaOH. 4. Приготовить нингидриновый реактив по методике: взять 0,17 г нингидрина смешать с 20 мл демитилсульфоксида, взять 10 мг аскорбиновой кислоты и смешать с 40 мл цитратного буферного раствора с pH=5.Смешать нингидрин в ДМСО (20 мл) с 20 мл цитратного буфера с аскорбиновой кислотой.(1:1). Цитратный буферный раствор для нингидринового реактива: 11.53 г лиммоной кислоты(безв, кристалл) и 4,62 г NaOH довести до 900 мл. (pH=5-5.2) 5.Пробу объемом 0,1 мл определяемого пептида вносят в пробирку, добавляют1 мл рабочего реактива нингидрина и инкубируют на кипящей водяной бане в течение 15 минут. Затем в пробирку добавляют 4 мл смеси пропанол:вода 1:1 и охлаждают до комнатной температуры. Оптическую плотность измеряют при длине волны 570 нм 6. После того, как колонка промыта водой после уплотнения щелочью, необходимо уравновешивать колонку цитратным буферным раствором с pH=4,25. После уравновешивания колонки, готовится проба пептидов с концентрацией 30-60 мг/мл(навеска 30 мг) в 0,1 М НСl. Потом даете объему пробы пептидов проникнуть в слой сорбента и последовательно элюируете буферными растворами с pH=4.25;6.25;8.25;10;25;12.25. Смену буфера производят по достижении 1 объема колонки (pH на входе становится равным pH на выходе из колонки), пробы собираете по 1 мл, в пробе определяется значение pH и оптическую плотность при длине волны 570 нм. Строите хроматограмму зависимости опт плотности при длине волны 570 нм от суммарного объема пропущенного буферного раствора. Разделение смеси пептидов лучше вести при постоянной температуре 32 С. 7. Затем каждый из полученных пиков объединяете и проводите их исследование методом тонкослойной хроматографии в системе изопропанол-этилацетат-34% аммиак - вода(v/v:30-10-3.5-10). Для тсх используете пластины Сорбфил(россия) 5х5 или 10х10. На пластине наносите стартовую линию на расстояние 1,5 см от края пластины и конечную линию очерчиваете от стартовой линии на расстоянии 7 см. Готовите растворы маркерных аминокислот в 25% водном этиловом спирте с концентрацией 5 мг/мл. Также готовите исследуемые пробы пептидов в концентрации 16-25 мг/мл в25% водном этиловом спирте. Пробы наносите микрошприцем в объеме 0,05 мкл. Даете пробам высохнуть на воздухе и помещаете в насыщенную хроматографическую камеру с системой, хроматографируете 60-70 мин, вынимаете ее и даете испариться на воздухе растворителю. Потом выдерживаете пластину с образцами в термостате при 90 С и после этого наносите раствор нингидрина для окраски образца(0,3 г нингидрина+97 мл ацетона+3 мл 100% уксусной кислоты). Даете ацетону испратиться(10 мин), прокаливаете пластину при 90 С до появления пятен образцов. Смотрите компонентный состав по сравнению с маркерными аминокислотами. 8. Предварительно лучше удалить из смеси пептидов сахара, соли, нуклеотиды, Это можно сделать на G-10 или сорбцией на катионите Dowex 50Wx8 в H-форме. Сообщение было отредактировано дмитрий9999 - 22.04.2012 22:43 |
|
дмитрий9999 |
23.04.2012 17:02
|
|
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость |
23.04.2012 18:25
Первое: Вы к кому обращаетесь, выкладывая протокол. Сюда: Вопрос похожий - никогда не делал хроматографию белков -от 64 до 200 кДа (Проблема в том, что не знаю в какой фракции искомый ферментик лежит, поэтому мысль пришла на хроматографию). Или сюда: чтобы выделить пептиды (15-20 кДа), богатые Arg и Lys. Второе: Люди задавали вопрос ТРИ года назад они уже защитились или уволились и забыли об этой проблеме. А вы растекаетесь не корректной мыслью по древу. Третье: Предлагаемая вами методика работает только на достаточно коротких пептидах. В топике же речь идет о полипептидах длинной сотни и даже десятки сотен аминокислот. Для таких молекул полистирольная матрица дауэксовских смол не годится. Они на ней необратимо сорбируются. Менять рН в диапазоне 0-12 для них смерти подобно они от таких упражнений необратимо денатурируют выпадают в осадок на матрицу и смыть их оттуда можно, только разрушив пептидные связи, т.е. уничтожив вещества. Нингидриновая реакция для них тоже малопригодна(по крайней мере без исчерпывающего гидролиза), потому что количество первичных аминогрупп на мг вещества в десятки раз меньше чем в маленьких пептидах(те чувствительность падает раз в 10). Зачем вы необоснованно подняли топик трехлетней давности славно почивший в бозе? Вы любите мертвых?
|
|
Entropy Участник Россия, Тюмень |
10.09.2013 14:10
|
|
watchesbiz Постоянный участник |
 06.12.2021 16:06
|
|
nigoal123 IP-штамп: frXqkB4MpP2jQ гость |
25.05.2022 08:33
The best way to help our students to overcome the challenge of writing in any want to read it. genre is to help them to break things down into their component |
|
nigoal123 IP-штамп: frGvfkzt/vMtQ гость |
26.05.2022 12:44
The planning stage is brainstorming ideas and challenge of writing in any choose the best three or four. Think what your subheadings write a short introduction |
| « Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |
 |
· Викимарт - все интернет-магазины в одном месте · Доска объявлений Board.com.ua ·
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---
Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Powered by Invision Power Board(Trial) v2.0.0 © 2024 IPS, Inc.