Rambler's Top100
Лёгкая версия форума* Виртуальная клавиатура  English  
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы
Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Междисциплинарный биологический онлайн-журналZbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ


Темы за 24 часа  [ Вход* | Регистрация* ]  
   



Форум: 
 

Щёлкните, чтобы внести в Избранные Темы* Конкретный вопрос
ИнтерЛабСервис - передовые технологии молекулярной диагностики
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.


 
Добавить сообщение в темуСоздать новую темуСоздать голосование
Участник оффлайн!




 прочитанное сообщение 19.09.2001 18:43     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #1 множественное цитирование

Привет всем участникам, так сказать...
У меня довольно конкретный вопрос по поводу мол.биологии - я сам пока во всех этих науках не очень - поэтому прошу совета:
Задача:
у меня есть некая бактерия (Rhodobacter capsulatus), в бактерии есть некий фермент (Complex I - то есть первый путкт их дыхательной цепи) - всего 14 субъединиц и все находятся в одном опероне.
Цель:
сделать вектор этого оперона и вставить его в бактерию - (в E.coli не получится - пробовали) - то есть обратно в Rhodobacter capsulatus. В результате концентрация фермента возрастет (4-6 раз достаточно) и можно будет его мучить ЭПРом. Естественной концентрации недостаточно, даже для новомодных суперЭПРных машин.
Длина оперона - 19K. Сделали ПЦР половинок, потом рестрикции серединных концов по SacI - в настоящий момент есть ети две половинки по 9.5К, их предполагается лигировать и получить целый фрагмент. Потом его надо засунуть в некую плазмиду и потом в клетку. К сожалению у етого родобактера толстая стенка наружняя и электропорацией это сделать довольно сложно (как специалисты говорят). Поэтому придется, видимо, использовать др. метод с клетками хелперами.
Вопросы:
1. По какому принципу выбирать и где взять подходящую плазмиду ? Насколько я понимаю необходимо чтобы могла жить в Родобактере (а), делала мало копий себя (б) и подходила по сайтам рестрикции (NdeI c начала и XbaI с конца) (в), вероятно, надо еще и чтоб был промотор, так как в непонятно, есть собственный промотор в опероне или нет. Какие еще могут быть требования ?
2. Связываться с клетками хелперами и второй плазмидой как-то не оч. хочется - потому возможно ли засунуть плазмиду все таки путем электропорации ??
Хорошо бы конкретный совет или ссылку киньте на ресурс...
заранее благодарен
shure
Участник оффлайн!




 прочитанное сообщение 20.09.2001 21:00     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #2 множественное цитирование

Наводящие вопросы:
Непонятно - вам нужен штамм Rhodobacter-суперпродуцент фермента или собственно фермент в склянке? Что значит "в колях не получится - пробовали"? Экспрессия? Тогда какой вектор? Может быть, попробовать экспрессировать по частям и ассоциировать их in vitro?
Участник оффлайн!




 прочитанное сообщение 21.09.2001 21:11     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #3 множественное цитирование

Привет...
Спаспибо за ответ
по порядку
<BLOCKQUOTE><font size="1" face="Verdana, Arial">quote:<HR>вам нужен штамм Rhodobacter-суперпродуцент фермента или собственно фермент в склянке<HR></BLOCKQUOTE>
Нам нужен препарат фермента, чтоб в перспективе его изучать ЭПР-спектроскопией. В данной бактерии (по сравнению с другими и митохондриями) концентрация фермента в мембране мала, для того, чтоб разрешить потом спектр. Повысив концентрацию фермента даже в 3-5 раз, на современных машинах это можно сделать. Возражение насчет выделения и исследования в "чистом" виде: во-первых выделить подобный фермент пытались и не один раз, но в процессе выделения теряются некоторые свойства (чувствит. к специф. ингибиторам, в определенной степени могут диссоциировать редокс-компоненты (которых там оч. много)). Да и в принципе, так как фермент функционален только в составе мембраны - то это накладывает ограничения на выделение - либо целые клетки, либо т.н. суббактериальные частицы. Идея о очистке ферментаи встраивании его в фосфолипидные везикулы не нова и долго и тщательно проверялась, пока не оч. успешно.
<BLOCKQUOTE><font size="1" face="Verdana, Arial">quote:<HR>Что значит "в колях не получится - пробовали"? Экспрессия? Тогда какой вектор?<HR></BLOCKQUOTE>
Скажу честно, этого не знаю. Пробовал не я и только отдельные субъединицы - говорят образуются inclusion bodies...
<BLOCKQUOTE><font size="1" face="Verdana, Arial">quote:<HR>Может быть, попробовать экспрессировать по частям и ассоциировать их in vitro??<HR></BLOCKQUOTE>
Не уверен, но это мало пользы принесет IMHO... Довольно сложный комплекс, железосерные кластеры, флавин...
Спасибо...
с уважением shure
Участник оффлайн!




 прочитанное сообщение 25.09.2001 22:20     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #4 множественное цитирование

Для облегчения электропорации можно попробовать подобрать режим подращивания в богатой среде, чтоб клеточная стенка не успевала утолщаться. У колей есть разные методы, надо взглянуть в старые книги, когда эффективность была небольшой и изголялись по черному. В общем снимать на порацию где-то на 13-12 ОД от плато роста. Среду побогаче, клеток поменьше и вперед.
Участник оффлайн!




 прочитанное сообщение 26.09.2001 15:10     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #5 множественное цитирование

спасиббо...
это более менее понятно, да...
totosite
IP-штамп: frif60/G4Seok
гость



 прочитанное сообщение Сообщение на английском  18.12.2020 07:39     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #6 множественное цитирование

How can you think of this?토토커뮤니티사이트I thought about this, but I couldn't solve it as well as you.토토커뮤니티I am so amazing and cool you are. I think you will help me. I hope you can help me.토토사이트
totosite
IP-штамп: frif60/G4Seok
гость



 прочитанное сообщение Сообщение на английском  18.12.2020 07:40     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #7 множественное цитирование

I want to talk to you about your writing. If you think so too, come to me.토토사이트
totosite
IP-штамп: frif60/G4Seok
гость



 прочитанное сообщение Сообщение на английском  18.12.2020 07:41     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #8 множественное цитирование

I was thinking a lot before reading this article.토토커뮤니티But reading this article solved all the problems.토토커뮤니티사이트So I expressed my gratitude to my blog. My blog is "토토사이트"
totosite
IP-штамп: frif60/G4Seok
гость



 прочитанное сообщение Сообщение на английском  18.12.2020 07:42     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #9 множественное цитирование

Your writing is perfect!! You gave me great joy!! Please come to my site and give your opinion. 토토사이트
totosite
IP-штамп: frif60/G4Seok
гость



 прочитанное сообщение Сообщение на английском  18.12.2020 07:43     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #10 множественное цитирование

Read my article and let us know your opinion.토토사이트I want to solve this problem. I think you can solve it enough.토토사이트
Участник оффлайн! kimkibang
Постоянный участник



 прочитанное сообщение Сообщение на английском  30.01.2021 13:28     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #11 множественное цитирование

this is one very interesting post. I like the way you write and I will bookmark your blog to my favorites.토토커뮤니티
Участник оффлайн! kimkibang
Постоянный участник



 прочитанное сообщение Сообщение на английском  30.01.2021 13:32     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #12 множественное цитирование

Nice information, valuable and excellent design, as share good stuff with good ideas and concepts.메이저사이트
Участник оффлайн! watchesbiz
Постоянный участник



 прочитанное сообщение Сообщение на английском  28.09.2021 05:38     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #13 множественное цитирование

https://wanelo.co/replicarolexwatches
https://musescore.com/fakerolexwatches
https://www.racked.com/users/Replicarolexwatches
https://sketchfab.com/Rolexrelicawatches
http://www.video-bookmark.com/bookmark/433...eplica-watches/
https://www.slideserve.com/ReplicawatchesUK...pt-presentation
https://www.theverge.com/users/Replicarolexwatches
https://www.yumpu.com/en/document/read/6532...lica-watches-uk
https://online.flippingbook.com/view/152275247/
https://www.instapaper.com/p/8767342
https://www.bigblueview.com/users/Replicarolexwatches
https://weheartit.com/watcheshutuk
https://sites.google.com/view/replicarolexwatches24/home
https://www.indiehackers.com/post/hints-on-...atch-113aef73a9
http://replicawatchesuk.esportsify.com/for...ica-rolex-watch

*




Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.
Имя:

 преобразовывать смайлики · показать смайлики
Назначение кнопок:

   Поблагодарить автора сообщения — поблагодарить автора
   Удалить сообщение — удалить
   Редактировать сообщение — редактировать
   Поместить сообщение в колонку новостей — поместить в колонку новостей
   Цитировать — цитировать сообщение
   не входит в цитирование/входит в цитирование — цитировать несколько
   Отметить СПАМ-сообщение — обозначить спам
   Сообщение для модератора — связь с модератором
   Участник онлайн!/Участник оффлайн! — автор онлайн/оффлайн
   Фотография — фотография автора

   - остальные обозначения -
 
   *
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема »
Быстрый ответДобавить сообщение в темуСоздать новую тему

Rambler   molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов              

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Ваш форум  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама  ·  Дата и время: 19.10.21 05:49
Bridged By IpbWiki: Integration Of Invision Power Board and MediaWiki © GlobalSoft