 * |   |
|
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда |  Zbio-wikiNG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: |
|
Правила
* PAAG электрофорез белков -- comments to a permanent page of the site --
Тема связана с: SDS PAAG
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.
   |
|
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость  |
 30.11.2007 17:24
|
 polly |
30.11.2007 19:32
|
|
Guest IP-штамп: fr0CXODQM332o гость |
30.11.2007 20:50
плавите собираете камеру (стекла-спейсеры-зажимы) расплавленную агарозу наливаете на канавки пока она не застыла, ставите собранные стекла нижней частью прямо в нее ждете, пока застынет, не трогаете, заливаете гели |
|
Guest IP-штамп: fr0CXODQM332o гость |
30.11.2007 20:50
плавите собираете камеру (стекла-спейсеры-зажимы) расплавленную агарозу наливаете на канавки пока она не застыла, ставите собранные стекла нижней частью прямо в нее ждете, пока застынет, не трогаете, заливаете гели |
|
polly |
30.11.2007 21:34
|
|
ужик |
01.12.2007 18:09
|
|
guest: Гость IP-штамп: frHVRS/ao5Sko гость |
06.12.2007 16:35
|
|
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость |
06.12.2007 17:59
Я! |
|
Ъ IP-штамп: frNwv0U1khjS. гость |
06.12.2007 18:19
(guest: Гость @ 06.12.2007 15:35)  Кто может за вознограждение провести форезИ я тоже  Вознаграждение какое будет? 
|
|
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость |
06.12.2007 21:36
И вообще в очередь. Вас здесь нестояло. |
|
Tom1 Постоянный участник |
06.12.2007 21:45
"Восприемник" сходил бы лутше в топик что кислород может как быший химик что-то умное сказал бы.... |
|
bukach Постоянный участник Geneva, Switzerland |
06.12.2007 23:47
(guest: Гость @ 06.12.2007 16:35) Кто может за вознограждение провести фореза Вам какой? по Лэммли, трициновый, по Шванку и Мункресу, по Дэвису, по Шагеру (blue и colorless), по Веберу и Осборну, нативный в гомогенной системе (несколько разных), изоэлектрофокусирование в нативных или денатурирующих условиях? или ещё какой? возможно в градиентных гелях, по желанию в присутствии мочевины.
|
|
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость |
07.12.2007 11:16
Ты! Думаешь я его не читал. пока ничего красивого в голову не лезет, вот и молчу в тряпку. |
|
Ёлкин Пермь - Москва - Пущино |
10.02.2008 22:17
Вопрос: за что именно проугать студентов, если завтра утром я буду переделывать этот форез вместо того чтобы счастливо ставить блот? PS: Сам по этой прописи регулярно ставлю форезы, все прекрасно получается. Картинки:  PAGE_unusual.jpg — (46.09к) 10.02.2008 — 24.02.2008 |
|
bukach Постоянный участник Geneva, Switzerland |
10.02.2008 22:46
покрасьте гель для полной уверенности в том, что всё ок. з.ы. и вот нечего детей заставлять по воскресеньям работать 
|
|
Guest IP-штамп: frPanb9Lvzu1g гость |
10.02.2008 22:55
|
|
HACTEHKA |
26.02.2008 19:15
При проведении электрофореза идет все как нужно, но при окраске Кумасси выясняется, что снизу есть большая темная синяя полоса примерно 1,5 см, и по всей видимости, белки идут только до ее начала. При вестерне на границе с началом этой полосы определяются белки по всей ее длине на одном уровне вне зависимости от их молекулярной массы. С чем это может быть связано? |
|
comp3v Постоянный участник Москва |
26.02.2008 19:28
|
|
HACTEHKA |
26.02.2008 19:47
(comp3v @ 26.02.2008 19:28) это называется фронт миграцииИ как его избежать? При этом при прохождение электрофореза, если следить за краской, то все в порядке, а на самаом деле белки не дошли. |
|
comp3v Постоянный участник Москва |
26.02.2008 19:55
Это всё если, конечно, мы об одном явлении говорим. |
|
HACTEHKA |
26.02.2008 23:49
|
|
Бору Постоянный участник Киев. обл., Украина |
28.02.2008 22:02
|
|
Tom1 Постоянный участник |
28.02.2008 22:56
Не смертельно.... |
|
Guest IP-штамп: fr4I3qoC2Qq4. гость |
29.02.2008 01:20
(Бору @ 28.02.2008 21:02) Вертикальная камера, розделяющий гель залит, но не очень плотно пристает к боковым стенкам (те которые не стеклянные), после заливки концентрирующего тот уходит в образованные щели, и доходит до самого низу. Это не страшно?А как это выглядит в концентрирующем геле? У Вас при этом крайние лунки целые получаются, или вытекают? |
|
Бору Постоянный участник Киев. обл., Украина |
29.02.2008 08:23
Сообщение было отредактировано Бору - 29.02.2008 08:30 |
|
Guest IP-штамп: fr4I3qoC2Qq4. гость |
29.02.2008 10:34
|
|
Ёлкин Пермь - Москва - Пущино |
25.03.2008 21:46
|
|
Beonick Постоянный участник |
02.04.2008 12:43
Сообщение было отредактировано Beonick - 02.04.2008 13:17 |
|
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость |
02.04.2008 13:50
Не нужен "кроме, как в Loading buffer" --и как добиться нужного уровня разрушения клеток и екстракции белков, если исключить его? Дезинтеграция, дезинтеграция и еще раз дезинтеграция, Батенька. Любыми доступными спосбами, это архиважно для текущего момента.  Ну, и не забывайте о неионных детергентах и 8М мочевине, но последнюю все же лучше перед нанесением подразбавить раза в два. |
|
Бору Постоянный участник Киев. обл., Украина |
03.04.2008 21:39
 Полагаю причина в использованиии не оч. свежего ДСН. (В растворе буфера для образцов где конц. ДСН 2% находится в виде осадка при комнатной температуре). Как его перекристализируют? |
|
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость |
04.04.2008 11:54
Перекристализовывают из горячего спирта. |
|
Бору Постоянный участник Киев. обл., Украина |
04.04.2008 12:10
Нет, в электродный буфер и гель вносили 0,1% ДСН. Если мне не изменяет память
|
|
Гость IP-штамп: frGqyYT8IU7LU гость |
09.04.2008 18:51
Акриламид свежий, pH всех растворов в норме. Сомнения вызывает только буфер для нанесения - рН 6,9 |
|
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость |
09.04.2008 20:21
ЭЭЭ, часть фронта? Поперек поля или вдоль? Вообще-то после вхождения в разделяющий фронт разделяется на 2 границы впереди бежит хлор, сзади глицин, мелкие белки бегут с глицином БФС бежит между ближе к глицину(если не изменяет память). Бывает ,что БФС грязный и у него появляется желто-коричневая полоса(примеси) во фронте глицина. |
|
Гость IP-штамп: frGqyYT8IU7LU гость |
09.04.2008 20:37
Часть фронта. Поперек поля. Другими словами, желтеет не часть БФС по всей ширине форнта, а весь БФС в какой-то части фронта. |
|
Dimych Постоянный участник Kr-sk - Puschino - NYS - Calgary... Круг замкнулся |
10.04.2008 04:15
(Бору @ 03.04.2008 18:39) Полагаю причина в использованиии не оч. свежего ДСН. (В растворе буфера для образцов где конц. ДСН 2% находится в виде осадка при комнатной температуре). Как его перекристализируют? Эээээ.... Не очень свежий это как? Годами стоит на полке в растворе и ничего ему не делается. В сухом виде десятилетиями. Довольно стабильная фиговина. Не майтесь дурью с перекристаллизацией. Осадок в 2% растворе при КТ наводит на мысли о наличии в растворе калия. Когда муть видна? При смешивании с образцом? Или "на клетке с буйволом надпись слон". В том смысле, что у Вас вместо ДСНа непонятная смесь.
|
|
Бору Постоянный участник Киев. обл., Украина |
10.04.2008 19:20
Для того чтобы сделать 2%-ный раствор надо нагревать, при комнатной температуре выпадает осадок. Калия нигде не даем. После кипячения с пробами (и остывания) мути будто бы не видно. В лунках тоже ничег оне остается, вся проблемма в том, что он выпадает после вхождения в гель. Акриламиду третий год, может причина в его "чистоте"? А может сделать деионизацию мочевины перед добавлением в гель? |
|
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость |
10.04.2008 20:18
Никогда не сталкивался с таким. Там неоткуда браться кислоте, разве что закисление анодного пространства, если анод расположен близко к гелю, а электродный буфер не новый и плохо перемешивается, но это так маловероятно. |
|
fagot-bsu |
18.04.2008 17:02
1) и самое важное: кто-нить когда-нить сушил гели ПААГ, есси да отпишитесь как мона подробнее как енто делать 2) очень важно. Если кто-то работал в программах серии Amersham (tatal lab, Image quant) ОООООООгромная просьба откликнуться и ответить какой метод выбора background substaraction юзаете вы и почему (не могу выбрать rollingball или Image rectangle) 3) мой научник посоветовал мне увеличить молярность буферов на 30%, оно и пнятно напряженность при переходе концентрирующий гель - рабочий гель padaet eshe silnee, но в результате получилось, что часть белковые полосы начали демонстрировать самые разные отклонения. Однако я не уверен, что причина таких выкрутасов именно в етом,есси когда-тоделали что-то подобное отпишитесь 4) возможно ли построить калибровку, степень окрашенности от молекулярной массы ispolzuya Kumassi g250 ili Dameral serebro PS sry za translit (debilniy komp v labe) |
|
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость |
18.04.2008 21:05
Ключевым является использование целлофана(регенерированной целлюлозы) и вымачивание геля в растворе для сушки.(кстати я пользуюсь другими растворами, но и этот должен работать) --2) очень важно. Если кто-то работал в программах серии Amersham (tatal lab, Image quant) ОООООООгромная просьба откликнуться и ответить какой метод выбора background substaraction юзаете вы и почему (не могу выбрать rollingball или Image rectangle) Забейте, попробуйте крякнутый софт типа Bioplot, Totallab или open soft типа ImageJ, где взять крякнутый спросите в разделе форума биософта. --3) мой научник посоветовал мне увеличить молярность буферов на 30%, оно и пнятно напряженность при переходе концентрирующий гель - рабочий гель padaet eshe silnee, но в результате получилось, что часть белковые полосы начали демонстрировать самые разные отклонения. Однако я не уверен, что причина таких выкрутасов именно в етом,есси когда-тоделали что-то подобное отпишитесь. Не делал не советую, Лэмли и так в 2 раза увеличил концентрации по сравнению с исходной системой, ничего кроме дополнительного разогрева или удлинения времени фореза это не даста результат диффузия. Это оправданно при высоких нагрузках по белку и высокой соле в пробе. И концентрирование происходит вовсе не при переходе в разделяющий, а на границе глицин хлор уже в концентрирующем. Если у вас не очень острые зоны, а буфера проверены и перепроверены из лучших реактивовов, то виноват акриламид. Деионизуйте его над смешанным ионообменником и будет вам счастие. --4) возможно ли построить калибровку, степень окрашенности от молекулярной массы ispolzuya Kumassi g250 ili Dameral serebro Несовсем понял. Вы думаете, что интенсивность окраски зависит от размера белка. Нет! Кумаси красит на массу белка(с вариациями, см топик про Брэдфорд). Строго говоря, он красит лизины и аргинины, и немного пептидную связь. Если подобрать более менее адекватный белок-стандарт для градуировки и работать на ее линейном участке, то кумаси позволяет определять количество довольно прилично с вариацией процентов 10. Но не размер, а зачем вам размер у вас Лэмли по размеру разделяет. Серебро загадочно в окраске. Вот оно не любит например красить актин. Но если вам известно, как красится какой-то конкретный белок и есть чистый-стандарт белка, то можно строить градуировку по серебру. Но у серебра очень короткий участок линейности и сильная зависимость от проявления к проявлению. |
|
fagot-bsu |
20.04.2008 08:16
2) позволю себе не согласиться, концентрирование однозначно происходит при переходе концентрирующий разделяющий, ето объясняется скачком подвижности обусловленным: -разной пористостью -разной молярностью буфера -перераспределением заряда между трисом и глицином в концентрирующем геле, в результате чего большая часть глицина пришедшего на смену хлорид-аниона превращается в цвиттер-ион (два последних повышенная напряженность в концентрирующем геле) см. Остерман ("... назначение формирующего геля- собрать смесь белков в узкую полосу, толщина которой может составлять сотые доли миллиметра, независимо от объема исходного препарата. Для рабочего геля она является исходной зоной фракционирования, что резко повышает его разрешающую способность) 3) Я неправильно выразил свою мысль. Я вообще- то хотел спросить можно ли построить калибровку окрашенности от КОЛИЧЕСТВА белка. По кумасси получилось, а вот ссеребром проблема, если кто-то делал нечто подобное пожалуйста отзовитесь. Или просто посоветуйте метод с высокой линейностью и воспроизводимостью (время окраски не существенно). Сообщение было отредактировано fagot_bsu - 20.04.2008 08:17 |
|
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость |
21.04.2008 13:44
2)Вы несовсем правы, но для обяснения недостаточно места на полях этого форума. 3) С кумаси возможно. Да и серебром наверное возможноглавно подобрать условия. |
|
Гость IP-штамп: frOCLgZ.AxHok гость |
21.04.2008 15:31
|
|
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость |
21.04.2008 17:29
А в каком контексте вы это читате. И что сие буквосочетание значит. SSС 20х , а разводят чаще всего в 5 раз Состав 5хTGB в студию, тогда и поговорим. |
|
guest: Гость IP-штамп: frOCLgZ.AxHok гость |
22.04.2008 12:42
|
|
Почему IP-штамп: frOCLgZ.AxHok гость |
22.04.2008 15:26
|
|
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость |
22.04.2008 16:36
В смысле в самом конце, геля? Если так, то это просто развал и низкомилекулярная фракция, ее можно выгнать вместе с БФС, а можно оставит на любителя. |
|
fagot-bsu |
27.04.2008 20:59
Очень жду вашего ответа и буду за него благодарен. |
|
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость |
28.04.2008 11:07
Очень жду вашего ответа и буду за него благодарен. К сожалению не могу сказать ничего определенного. Мы в лабе пользуемся окраской аммиакатами. Воспроизводимость при любой окраске(не только серебром) никакая, поэтому обычно пробу гоняют одновременно с раститровкрой градуировочного белка на одном геле. Чувствмтельность окраски аммиакатами, зависит от концентрации исходного нитрата серебра, и от сенсибилизации геля формалином или глютаром. И колеблется от 0.1нг до 1нг (реально воспроизводится 0.5-1нг) на зону. Что касается линейности, то она соблюдается до нг 10-50. Но как чувствительность, так и линейность еще очень сильно зависит от "личного отношения" конкретного белка к окраске серебром. |
|
Гость IP-штамп: frZa2jpwcO5Kk гость |
08.05.2008 19:25
|
| « Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |
 |
· Викимарт - все интернет-магазины в одном месте · Доска объявлений Board.com.ua ·
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---
Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Powered by Invision Power Board(Trial) v2.0.0 © 2024 IPS, Inc.