Rambler's Top100
Лёгкая версия форума* Виртуальная клавиатура  English  
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы
Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Междисциплинарный биологический онлайн-журналZbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ


Темы за 24 часа  [ Вход* | Регистрация* ]  
   



Форум: 
 

Щёлкните, чтобы внести в Избранные Темы* Надо разогнать маркер вдоль мембраны электрическим полем
ИнтерЛабСервис - передовые технологии молекулярной диагностики
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.


 
Добавить сообщение в темуСоздать новую темуСоздать голосование
Участник оффлайн! Alexei L
Участник



 прочитанное сообщение 18.04.2018 22:53     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #1 множественное цитирование

Всем доброго вечера! Имеется статья, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15585299 (см прикрепленный файл), в которой описано как с помощью электрического поля разгоняли маркер DiI (флуоресцентный липид, катион) по мембране нерва.

Итак, мне нужно воспроизвести этот опыт с имеющимся у меня оборудованием
Что имеют авторы статьи:
1) платиновые электроды
2) нерв
3) маркер DiI
4) Блок питания для электрофореза EC-400
5) масло

В статье они прикладывали электроды непосредственно к нерву по обеим сторонам, и давали напряжение (оптимум до 48V/см). Нерв был помещен в масло (изолятор), таким образом ток шел только через нерв. Смысл был в том что DiI (флуоресцентный липид) это катион и под действием электрического поля он будет двигаться от анода (+) к катоду (-) по мембране, если маркер DiI помещен у анода. В статье есть ньюанс - силу тока авторы в амперах не указали (и не контролировали?!!! как мне автор статьи написал), но их блок питания дает максимум 200мА.


Что я имею в наличии:
1) Стальные электроды
2) образцы мышиного мозга
3) маркер DiI
4) Блок питания 0-5А (шаг 10мА), 0-30V (шаг 10мV), сила тока регулируется, напряжение регулируется
5) масло

Я попробовал воспроизвести опыт прямо как в статье, но со стальными электродами (платиновых нет и не будет), но мозг расплавился уже на 10мА (минимальная сила тока).
Я модифицировал схему, сделал как классический электрофорез, т.е взял две ванночки, залил физраствором, поместил туда стальные электроды, сделал мостик из агар-агара с мозгом внутри (агар-агаровый блок), и по бокам блока прикрепил фильтровалку, которая одним концом контактирует с агар-агаром, а другим с физраствором (замкнул цепь). На значениях 10мА вроде мозг не плавится, хотя электролиз в растворе идет что парит.

но есть проблемы - я электрофорез сам никогда не делал, и не уверен что у меня все правильно собрано, все мои знания о нем книжные. Хотел бы мнения спецов об своей схеме эксперимента, какие подводные камни и т.п. может и исходную схему авторов можно поправить под мои условия? Меня парит вот что - напряжение на фильтровалке по краям блока (мерил тестером) выходит почти нулевое, хотя в растворе 30V, и сила тока не увеличивается регулятором (10мА), но увеличивается до 50-70мА если я почти вплотную вручную приближаю мозг к стальным электродам. Так что я даже не уверен идет у меня ток через мозг или нет. может агаровый блок и не нужен, может напрямую фильтровалку к срезам мозга приложить что бы ток не гасился агар-агаром? все это надо проверять конечно но я уже 5 образцов потерял, и как то больше бы не хотелось. В общем жду мнений, советов, вопросов.

Файл/ы:

скачать файл swift2005.pdf
размер: 309.91к
кол-во скачиваний: 183


Участник оффлайн! Alexei L
Участник



 прочитанное сообщение 18.04.2018 23:03     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #2 множественное цитирование

PS. Маркер я наношу в конкретное ядро мышиного мозга, чьи связи хорошо описаны, и эти связи идут линейно вдоль мозга, хотя и не на дальние дистанции, так что в каком то смысле это тот же аналог линейного нерва что описан в статье.
Участник оффлайн! LaBord

Монреаль



 прочитанное сообщение 19.04.2018 14:52     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #3 множественное цитирование

Я бы взял серебряные электроды и в борьбе за метод не жалел образцов, так как вариантов действия (что может быть чтобы заработало) много.
Кстати, имел опыт попыток повторения некоторых работ (из солидных изданий от авторитетных лабораторий) - как в оригинальных (описанных в статьях), так и осмысленно модифицированных (порой - многократно) вариантах. Воспроизводимость составила 0.
В паре случаев довел до доказательного обоснования невозможности получения заявленных результатов при описанных объектах, методах и условиях.
Где взять серебряные электроды? Подсказка шага 1 : покупается серебряная монета или ложечка...
Участник оффлайн! ksm
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 19.04.2018 19:32     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #4 множественное цитирование

...крестик
Участник оффлайн! Tom1
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 19.04.2018 23:18     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #5 множественное цитирование

(ksm @ 19.04.2018 09:32)
Ссылка на исходное сообщение  ...крестик

вот вот и непременно освясчается в ближайшей церкви....
Участник оффлайн! Alexei L
Участник



 прочитанное сообщение 20.04.2018 01:06     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #6 множественное цитирование

С крестиком идея прикольная хотя использовать такие атрибуы в качестве электродов - в этом что то есть в общем)))) по поводу воспроизводимости - по факту эта статья невоспроизводима без значений силы тока, по сути эту работу надо с нуля делать заново. Странно что рецензенты которые пропустили эту статью в журнал не обратили внимание на это, или я чего то не понимаю...
Участник оффлайн! LaBord

Монреаль



 прочитанное сообщение 20.04.2018 05:05     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #7 множественное цитирование

Дело наверняка не только в силе тока, даже если все в работе было предельно корректно. Это еще и лабораторная магия, когда работа по одному протоколу у разных людей дает разные результаты (подробный поиск проблем, выявляет, например, у одного на руке есть металлические часы, а у другого - нет...).

Сообщение было отредактировано LaBord - 20.04.2018 05:06
Участник оффлайн! Alexei L
Участник



 прочитанное сообщение 20.04.2018 09:25     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #8 множественное цитирование

Лабораторная магия это хорошо но это уже не наука. Если результат нельзя воспроизвести то это означает что либо протокол не полный, либо он не работает. Авторы могли бы силу тока и указать, одна строка всего, а параметр очень ключевой. Серебрянные электроды я достану. Я попробую повторить в ванночке с маслом на 10 миллиамперах, схема такая - единый блок из трех частей с заключенным в центре мозгом

1) проводник агар-агар на физрастворе, контактирует с электродом и со срезом мозга
2) мозг с обрубленными концами, заключенный в агар-агар на дистилляете (изолятор), ток пойдет только через мозг в теории)
3) проводник агар-агар на физрастворе, контактирует с электродом и со срезом мозга

У меня вопрос - мне кажется у агар-агара на физрастворе все таки хорошее сопротивление, может кто знает альтарнативу?
Участник оффлайн! ECH
Участник



 прочитанное сообщение 20.04.2018 14:56     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #9 множественное цитирование

А смысл всего этого, да еще и на мыше? DiI использовали за неимением лучшего, и то как правильно написано в статье - для отслеживания периферических нервов. - Для отслеживаний внутри ЦНС либо rabies используют, либо экспрессию флуоресцентного белка под специфическим промотором ядра или проецирующей структуры, если уж структура известна, причем это делают уже лет 15 как. Курсовая работа с исходными DiI и срезом мозга? И пытаемся натянуть это на нерв в изоляторе т.е. сову на глобус?
Участник оффлайн! Alexei L
Участник



 прочитанное сообщение 20.04.2018 15:49     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #10 множественное цитирование

Для ЕHC:

"А смысл всего этого, да еще и на мыше?" - смысла нет вообще ни в чем (Виктор Пелевин). Вопрос был не о смысле, смысла нет в 99% научных работ которые чаще всего невоспроизводимы. Но это лирика. Смысл того о чем я спрашивал - разгон маркера электрическим полем, важно проверить принципиальную возможность этого, потому что по статье эта возможность неясна. По фото которые приведены в статье я не скажу что у них получилось, но сама задумка хорошая и ее надо проверить.

"DiI использовали за неимением лучшего, и то как правильно написано в статье - для отслеживания периферических нервов" - ? DiI используют как маркер выявляющий тело нейрона со всеми нервными окончаниями, что не так? Метите нужное ядро мозга и смотрите в каких структурах выявились тела нейрнонов. Нерв просто использовали как удобный линейный объект, но возможности DiI гораздо шире, и DiI можно нанести в любую структуру мозга, а не ограничиватся периферийными нервами.

" Для отслеживаний внутри ЦНС либо rabies используют, либо экспрессию флуоресцентного белка под специфическим промотором ядра или проецирующей структуры, если уж структура известна, причем это делают уже лет 15 как" - сразу видно писал молекулярщик))) - вирусы это стереотаксис, экспрессия генов под промотором - трансгенные мыши. Стереотаксису как методу инъекций в ядра мозга специфичных маркеров (в том числе и вирусов как варианта маркера) в целом не 15 лет а 50. На выходе как ни крути одно - выявить тела нейронов после инъекции в нужную структуру мозга. А теперь сравните стоимость стереотаксиса (нейрохирургическая операция), стоимость создания трансгенных мышей с флуоресцентным белком (хотя обычно используют инъекции HRP, PHAL, Fluoro-Gold и т.п но с помощью того же стереотаксиса), стоимость вирусных инъекций - и стоимость инъекции DiI в нужную структуру, и заодно можете поинтересоватся кпд всех этих методов. DiI это недорого и это его главное преимущество.

"Курсовая работа с исходными DiI и срезом мозга? И пытаемся натянуть это на нерв в изоляторе т.е. сову на глобус?" - непонятное предложение. Мышиный мозг и метка в известную структуру с хорошо описанными связями - идеальный объект для проверки работоспособности метода. Или предлагаете проверять на структурах чьи связи не описанны? У меня есть объект который я хорошо знаю - мышиный мозг - на нем я и буду тестировать. Что не так?

Вы можете что то посоветовать по поводу их методики, или предложите модификацию? Может вы сможете дать критику этой статьи по существу? Может вы можете что то сказать по поводу того какую силу тока и напряжение нужно подавать на объект что бы он не расплавился на электродах? Или посоветуете проводник вместо агар-агара на физрастворе? Я буду рад выслушать))
Участник оффлайн! Stepan2




 прочитанное сообщение 03.04.2020 15:42     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #11 множественное цитирование

интресно
Участник оффлайн! watchesbiz
Постоянный участник



 прочитанное сообщение Сообщение на английском  28.10.2021 12:31     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #12 множественное цитирование

http://www.authorstream.com/Replicawatches24/
https://about.me/Replicawatches24
https://moz.com/community/users/17050093
https://trello.com/rolexrelicawatches/activity
https://replicarolexwatches.dreamwidth.org/365.html
https://visual.ly/users/watcheshutuk/portfolio
https://www.viki.com/users/watcheshutuk_549/about
https://www.academia.edu/s/14bdb7d4fe?source=link
https://www.slideshare.net/Nowseore/guide-o...ex-watch-online
https://audiomack.com/rolexrelicawatches
https://soundcloud.com/replicarolexwatches
https://www.bagtheweb.com/u/fakerolexwatches/profile
https://www.flipsnack.com/ReplicawatchesUK/...ca-watches.html
https://www.4shared.com/office/zA4L7Rmzea/G...hase_a_Fak.html?
https://codepen.io/Rolexrelicawatches/full/abBEzaQ
Участник оффлайн! watchesonline89
Постоянный участник



 прочитанное сообщение Сообщение на английском  25.12.2022 10:16     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #13 множественное цитирование

https://62e8ce2ae5d50.site123.me/
https://www.vingle.net/posts/4647029
https://eatsleepride.com/c/383272
https://anotepad.com/notes/prkpsawt
https://demo.wowonder.com/1665548793521727_195426
https://linktr.ee/omegawatches89
https://omegawatches89.gumroad.com/p/reason...replica-watches
https://omegawatches93.mystrikingly.com/
https://writer.zoho.com/writer/open/k3enw04...fea14e95e0ee806
https://www.edocr.com/v/rakkz4oq/omegawatch...-replica-online
https://diigo.com/0pigfx
https://62e8ce2ae5d50.site123.me/blog/reaso...replica-watches
https://www.worldranklist.com/preview/bookm...s-Online-Store-
https://omegawatches89-95.webselfsite.net/contact
https://form.jotform.com/223252982096057

*




Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.
Имя:

 преобразовывать смайлики · показать смайлики
Назначение кнопок:

   Поблагодарить автора сообщения — поблагодарить автора
   Удалить сообщение — удалить
   Редактировать сообщение — редактировать
   Поместить сообщение в колонку новостей — поместить в колонку новостей
   Цитировать — цитировать сообщение
   не входит в цитирование/входит в цитирование — цитировать несколько
   Отметить СПАМ-сообщение — обозначить спам
   Сообщение для модератора — связь с модератором
   Участник онлайн!/Участник оффлайн! — автор онлайн/оффлайн
   Фотография — фотография автора

   - остальные обозначения -
 
   *
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема »
Быстрый ответДобавить сообщение в темуСоздать новую тему

Rambler   molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов              

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Ваш форум  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама  ·  Дата и время: 29.03.24 00:30
Bridged By IpbWiki: Integration Of Invision Power Board and MediaWiki © GlobalSoft