Rambler's Top100
Лёгкая версия форума* Виртуальная клавиатура  English  
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы
Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Междисциплинарный биологический онлайн-журналZbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ


Темы за 24 часа  [ Вход* | Регистрация* ]  
   



Форум: 
 

Результаты поиска -- Найденные сообщения --

страницы (2):  1 2 >

Требуются научные сотрудники
Yuly



Отправлено: 01.04.2015 17:41  |  ВакансииВакансии  |  link: #1544385  |  Ответов: 0  |  Просмотров: 1 325
В лабораторию миологии ГНЦ РФ Института медико-биологических проблем РАН (Москва) требуются научные сотрудники с опытом работ в молекулярной биологии для участия в экспериментальных исследованиях системных и клеточных механизмов влияния невесомости и ее моделей на скелетные мышцы. Выполняются также исследования механизмов патогенеза ряда мышечных заболеваний на клинических моделях. В лаборатории имеются гранты РФФИ и РНФ, академические целевые темы. При надлежащем старании возможны зарубежные командировки и стажировки. В лаборатории энергичный молодежный коллектив, интенсивные контакты с зарубежными коллегами. Интенсивно публикуемся (более 12 статей в год).

Требования:
-высшее биологическое/химическое образование, желательно кандидат наук.
-опыт в молекулярной биологии: с культурами клеток, в создании векторов, клонировании.
-английский язык, уверенное чтение статей.

Обязанности:
Выделение нуклеиновых кислот, электрофорез, PCR и RT-PCR, создание векторов, трансфекция, хроматиниммунопреципитация.

Условия:
Территориальное расположение лаборатории, г. Москва, Хорошевское шоссе 76а, м. Полежаевская.
Заработная плата будет зависеть от трудового вклада и научной активности. Грантовое финансирование позволяет установить среднее суммарное (зарплата плюс надбавки и выплаты) месячное содержание для кандидата наук не ниже 40000 рублей. Соответственно для сотрудника без степени – 25-30 тр. Остальное зависит от вас.
Полная занятость, полный день.

Контакты: зав.лаб., проф., д.б.н. Шенкман Борис Стивович, bshenkman@mail.ru
/ Вакансии,  #556804  /
Шенкман Борис Стивович
E-mail: Отправить e-mail
Требуется: Сотрудник
Место работы: Москва
Область деятельности: Молекулярная биология (биохимия, генная инженерия), Научные исследования (другое)

Неспецифика на НЦ-мембране
Yuly



Отправлено: 18.08.2014 07:59  |  Молекулярная и клеточная биологияМолекулярная и клеточная биология  |  link: #1500910  |  Ответов: 36  |  Просмотров: 3 782
(ship @ 15.08.2014 21:43)
Ссылка на исходное сообщение  а сразу слабо было написать, что проблема во вторичных???? то что используете -в помойку, и купите вторичные от GE Healthcare. и будем Вам счастье.


Я это писала и не раз!

Неспецифика на НЦ-мембране
Yuly



Отправлено: 14.08.2014 09:59  |  Молекулярная и клеточная биологияМолекулярная и клеточная биология  |  link: #1500508  |  Ответов: 36  |  Просмотров: 3 782
(Guest @ 13.08.2014 15:34)
Ссылка на исходное сообщение  Абсолютно нет логики. Вы, автор темы, сообщили, что ранее применяли в качестве первичных поликлональные антитела из кролика и получили всё замечательно, верно?

После попробовали абсолютно всё то же самое, но заменили поликлональные первичные антитела на моноклональные мышиные. Получили полностью неспецифичное окрашивание, верно?

Следовательно проблема в новых антителах, которыми стали моноклональные мышиные антитела, верно?

Так и не получен ответ на ворпос, зачем нужно снова красить моноклональными мышиными антителами, когда уже получено доказательство с помощью поликлональных кроличьих антител. Все верно?


1. Верно. 2. Верно. 3. Нет, так сказать нельзя т.к. меняется вторичка.
4. Нет, те антитела, кот. нам нужны выпускают только мышиные и это не AMPK.

Нужно решить проблему со вторичными мышиными антителами т.к. только при сильном разведении, при соблюдении всех забивок и длительности отмывок, такие пятна пропадают, но при этом, какую бы высокую концентрацию первичных не давали, полоса с ними не проявляется. Проверяли не только на AMPK, но и на других первичных от cell sign и abcam. Не думаю,что нам так "везет" и все мышиные, кот. нам поставляют такие плохие.

Неспецифика на НЦ-мембране
Yuly



Отправлено: 14.08.2014 09:47  |  Молекулярная и клеточная биологияМолекулярная и клеточная биология  |  link: #1500506  |  Ответов: 36  |  Просмотров: 3 782
(ship @ 13.08.2014 12:40)
Ссылка на исходное сообщение  как писал гость, из ваших постов все таки не совсем все понятно.
то бишь есть мышиные антитела к АМРК, и именно они вам нужны? эти антитела откуда? кто производитель? они вообще как работают? одну полосу красят или забор?
говорите, что в их качестве не сомневаетесь? судя по картинкам - я бы засомневался.
Могу точно сказать, если первичные антитела ничего не красят на мембране, то такой забор, который вы видите на картинках, ни одни хорошие вторичные антитела не дадут.

ну и как сказали выше, у вас либо перегруз либо пересвет мембраны, либо и то и другое.
кстати, антитела у вас часом не к какому нибудь фосфо-сайту?  если так, то инкубировать надо в БСА, а не в молоке.  опять таки, время инкубации с антителами тоже не указали. да и протокол вестерна не привели. может вы где то еще ошибаетесь


AMPK не нужны, я писала выше. Мы используем всегда Cell sign или abcam. Тут AMPK Cell sign. И красят одну полосу. И не только на них проверяли, на многих мышиных от cell sign или abcam, дело во вторичных, кот. как ни разбавляй все равно устойчиво дают полосу на 80-90 кДа. При меньшей выдержке и при загрузе 10 мкг, не так явно, но все же фон от вторичных есть (вторичку пробовали и santa cruz и bio-rad, к Fc)

Неспецифика на НЦ-мембране
Yuly



Отправлено: 14.08.2014 09:39  |  Молекулярная и клеточная биологияМолекулярная и клеточная биология  |  link: #1500504  |  Ответов: 36  |  Просмотров: 3 782
(Guest @ 13.08.2014 13:55)
Ссылка на исходное сообщение  А стоит ли мучиться с иммуноблотом, когда есть коммерческий набор ИФА?


купим планшетный спектрофотометр и будем делать ифа

Неспецифика на НЦ-мембране
Yuly



Отправлено: 13.08.2014 10:05  |  Молекулярная и клеточная биологияМолекулярная и клеточная биология  |  link: #1500389  |  Ответов: 36  |  Просмотров: 3 782
(Guest @ 12.08.2014 22:43)
Ссылка на исходное сообщение  То есть хорошая картинка, показывать не нужно картинку, с поликлональными кролика и всем остальным, но моноклональные мышиные не работают, верно? Еще авангардный вариант самим сделать моноклональные мышиные, но тут уже снова недостаток информации начальной и возможности нужно знать.


Думаю, что не совсем поняла Ваш вопрос, но в качестве первичных антител я не сомневаюсь.

Неспецифика на НЦ-мембране
Yuly



Отправлено: 13.08.2014 10:00  |  Молекулярная и клеточная биологияМолекулярная и клеточная биология  |  link: #1500387  |  Ответов: 36  |  Просмотров: 3 782
Мы добивались сильного разведения антител GAM (разведение от 1:20 000 у Santa Cruz и 1:100 000 у bio-rad), и такой "грязи" на блоте практически не видно, но когда мы увеличивали концентрацию первичных антител, то с такими разведениями GAM, и нужная полоса не проявлялась (mouse пробовали разные и abcam и cell signaling).

Неспецифика на НЦ-мембране
Yuly



Отправлено: 13.08.2014 09:47  |  Молекулярная и клеточная биологияМолекулярная и клеточная биология  |  link: #1500381  |  Ответов: 36  |  Просмотров: 3 782
(ship @ 12.08.2014 21:37)
Ссылка на исходное сообщение  http://www.cellsignal.com/products/primary-antibodies/5831
может просто стоит купить хорошие антитела?
равно , как и хорошие вторичные. ну и уж явно не от санта-круз.

селл сигналинг в россию возит Акрус, и цены у них приемлимые и сроки нормальные обещают.



Первичные мы берем всегда cell signaling или abcam. Но есть антитела, кот. нам нужны, их производят только mouse. Я писала об этом выше. Картинку AMPK мышиный я привела просто, показать, что дают вторичные GAM на крысином лизате. Такую картинку показывает не только santa cruz, но и GAM от Bio-Rad.

Неспецифика на НЦ-мембране
Yuly



Отправлено: 12.08.2014 15:09  |  Молекулярная и клеточная биологияМолекулярная и клеточная биология  |  link: #1500296  |  Ответов: 36  |  Просмотров: 3 782
(Guest @ 12.08.2014 15:26)
Ссылка на исходное сообщение  Зачем mouse взяли?


Производят первичные антитела только mouse (не к AMPK, кот. в примере, а к другому белку), других нет. И большинство моноклонов mouse, поэтому как-то хочется эту проблему решить.

Неспецифика на НЦ-мембране
Yuly



Отправлено: 12.08.2014 14:12  |  Молекулярная и клеточная биологияМолекулярная и клеточная биология  |  link: #1500281  |  Ответов: 36  |  Просмотров: 3 782
(guest: ммм @ 12.08.2014 14:04)
Ссылка на исходное сообщение  Ну тут еще совет уменьшать общую белковую нагрузку на форез, что конечно будет приводить к снижению чувствительности. Так же можно попробовать коньюгат против Fab -фрагмента.

  И наверное известно, что это за мажорный белок в экстракте. Посмотреть почему ему так ловко удается выдавать себя за антитела мыши.


Хм, спасибо большое!

Неспецифика на НЦ-мембране
Yuly



Отправлено: 12.08.2014 11:26  |  Молекулярная и клеточная биологияМолекулярная и клеточная биология  |  link: #1500259  |  Ответов: 36  |  Просмотров: 3 782
(guest: ммм @ 12.08.2014 11:27)
Ссылка на исходное сообщение  Да соль похоже мало поможет. А на кумаси(серебре, понсе) эти зоны как мажоры?


В принципе, да

Неспецифика на НЦ-мембране
Yuly



Отправлено: 12.08.2014 09:26  |  Молекулярная и клеточная биологияМолекулярная и клеточная биология  |  link: #1500232  |  Ответов: 36  |  Просмотров: 3 782
(Guest @ 11.08.2014 18:38)
Ссылка на исходное сообщение  Или соль понизить или воды добавить... Ну и так далее советы далее будут. Материал без надобности не портить, думать вначале нужно.


(guest: ммм @ 11.08.2014 18:18)
Ссылка на исходное сообщение  Тогда это перегруз на блоте скорее всего. Ну и можно соль повысить при инкубации, и все таки какой мол. вес неспецифичных зон


Спасибо. Попробую изменить соль, мол.вес 80-90 кДа.

Неспецифика на НЦ-мембране
Yuly



Отправлено: 12.08.2014 09:23  |  Молекулярная и клеточная биологияМолекулярная и клеточная биология  |  link: #1500231  |  Ответов: 36  |  Просмотров: 3 782
(Guest @ 11.08.2014 18:12)
Ссылка на исходное сообщение  Хитростей нет, всё примитивно и просто. Плохой лизат с испортившимся белком или отсутствием нужного белка-плохие первичные антитела- плохие вторичные антитела-неверное следование элементарному протоколу. Книжку почитайте по иммунологии, практикум, там всё написано. Раньше получали нормальные результаты с этими антителами-лизатом и пр.? По пунктам проверяйте, в интернете нельзя сказать, что неверно.


С этим лизатом и первичными антителами, только rabbit получали отличные результаты, берем первичные mouse и получается такая вот картинка. Спасибо, найду практикум по иммуноголии и почитаю.

Неспецифика на НЦ-мембране
Yuly



Отправлено: 11.08.2014 17:07  |  Молекулярная и клеточная биологияМолекулярная и клеточная биология  |  link: #1500142  |  Ответов: 36  |  Просмотров: 3 782
(LMP @ 11.08.2014 17:00)
Ссылка на исходное сообщение  Если фото с пленки, то это "передержано". Экспонировать 15-20 сек.


Делали, но все равно лезут полосы, а нужного белка не видно. Я так понимаю, что нужно разводить антитела дальше, но боюсь, тогда и первичные вторичка "не видит"...

Неспецифика на НЦ-мембране
Yuly



Отправлено: 11.08.2014 17:01  |  Молекулярная и клеточная биологияМолекулярная и клеточная биология  |  link: #1500141  |  Ответов: 36  |  Просмотров: 3 782
(Guest @ 11.08.2014 15:59)
Ссылка на исходное сообщение  В помойку всё. Новые антитела/antibodies, новый лизат и, к сожалению, новую белую умную красивую крысу нужно на опыты уничтожить. Так что думать и проверять антитела и реактивы нужно было заранее.


Пробовали и другие, GAM Bio-Rad, такая же история и лизат переделывали. Это как раз и есть проверка. На крысином материале GAM ведут себя одинаково. Думала, может есть какие-то хитрости, о кот. еще пока не в курсе.

Неспецифика на НЦ-мембране
Yuly



Отправлено: 11.08.2014 16:58  |  Молекулярная и клеточная биологияМолекулярная и клеточная биология  |  link: #1500138  |  Ответов: 36  |  Просмотров: 3 782
(guest: ммм @ 11.08.2014 15:35)
Ссылка на исходное сообщение  Так разводите GAMы пока не уйдет неспецифика. Если при этом они все еще будут видеть мышинные антитела, то жизнь прекрасна. Кстати, не могли бы вы сообщить мол вес жирных полос. А также фирму и каталожный номер вторичных коньюгатов.


Здесь разведение вторичных антител 1:200 000, делали и 1:300 000, история похожая. Жирные в районе 80-90 кДа. Здесь вторичка SantaCruz sc-2005, но пробовали GAM и Bio-Rad, такая же история, разводили до 1:400 000, не было грязи, но похоже и первичные тогда "не видит".

Неспецифика на НЦ-мембране
Yuly



Отправлено: 11.08.2014 13:20  |  Молекулярная и клеточная биологияМолекулярная и клеточная биология  |  link: #1500081  |  Ответов: 36  |  Просмотров: 3 782
Добрый день!
У меня следующая проблема. Проводим вестернблот лизата крысиной мышцы. И никак не можем избавится от неспецифического связывания вторичных антител goat-anti-mouse на НЦ-мембране. Пример, как получается на пленке после обработки мембраны ECL, можно увидеть в прикрепленном файле.

полоса 1 - тотАМРК+ молоко 4%.
полоса 2 - негативный контроль к полосе 1, т.е. без первичных антител к тотAMPK, вместо них TBST c 4% молоком, а потом вторичка GAM

полоса 3 - тотАМРК + BlockPro (какой-то коммерческий реагент для блокировки).
полоса 4 - негативный контроль к полосе 2, опять же без первичных антител, вместо них TBST c BlockPro.

Буду очень благодарна за советы!user posted image

Гомогенизатор ультразвуковой для CHIP
Yuly



Отправлено: 23.07.2014 15:26  |  Биофизика и матметоды в биологииБиофизика и матметоды в биологии  |  link: #1496362  |  Ответов: 3  |  Просмотров: 2 268
(Guest @ 22.07.2014 11:20)


Спасибо большое за ответ, буду читать и разбираться.
Хотелось бы определиться с понятиями : что такое "зоникатор"?
И кликая на ссылку с molbiol, там открывается общий форум, не могли бы Вы написать название темы, я по форуму найду.

Гомогенизатор ультразвуковой для CHIP
Yuly



Отправлено: 17.07.2014 17:24  |  Биофизика и матметоды в биологииБиофизика и матметоды в биологии  |  link: #1495406  |  Ответов: 3  |  Просмотров: 2 268
Добрый день!
Хотим освоить методику CHIP, выбираем ультразвуковой гомогенизатор.

Может подскажите какие нужны характеристики, в основном интересует мощность или какой используете Вы?
Я так понимаю, нужно чтобы разбивал на фрагменты в 200 - 1000 п.н. и был бесконтактным..?

Выделение РНК
Yuly



Отправлено: 24.03.2014 11:11  |  Молекулярная и клеточная биологияМолекулярная и клеточная биология  |  link: #1476115  |  Ответов: 17  |  Просмотров: 2 902
Спасибо за ответы!

Выделение РНК
Yuly



Отправлено: 20.03.2014 17:01  |  Молекулярная и клеточная биологияМолекулярная и клеточная биология  |  link: #1475397  |  Ответов: 17  |  Просмотров: 2 902
Когда выделяешь тотальную РНК с помощью тризола или набора типа Rneasy Micro Kit "Qiagen" помимо мРНК, рРНК, тРНК пре-мРНК тоже выделяется?

Активность протеинкиназы, коиммунопреципитация
Yuly



Отправлено: 28.08.2013 18:15  |  Молекулярная и клеточная биологияМолекулярная и клеточная биология  |  link: #1429790  |  Ответов: 16  |  Просмотров: 4 343
(Tom1 @ 23.08.2013 18:50)
Ссылка на исходное сообщение  о как статью тоже не дают прикрепить...
совсем жесть...
да прочитал я ее и возникает вопрoсы к аффторы топика...
1. какая задача стоит перед ним????
что в ее понимании означает определить активность АМ.... киназы  по отношению к субстрату еЕ...???
2. если надо убедится что сказем не е..К фосфорелирует  так в опусе описано как сие сделать для сего и определены ингибиторы...


1. Для начала мне нужно узнать, что AMPK вообще фосфорилирует eEF2 в условиях эксперимента.

2. Что за опус?

Активность протеинкиназы, коиммунопреципитация
Yuly



Отправлено: 23.08.2013 17:03  |  Молекулярная и клеточная биологияМолекулярная и клеточная биология  |  link: #1428638  |  Ответов: 16  |  Просмотров: 4 343
(guest: ммм @ 23.08.2013 14:24)
Ссылка на исходное сообщение  Вот то-то и оно, и я себе задал этот ворос, почитав цитату, вами приведенную. А смывка фермента не может быть по умолчанию, потому что смывки они весьма не дружественны к ферментам и вовсе не факт, что после нее сохранится, его активность, а следовательно квтор обязан указать чем он смывал фермент. А иммобилизованный фермет очень даже может работать, а вот если иммобилизован и субстат, то тут возникает вопрос а как они вообще смогут; повстречатся


Напишу-ка я тогда автору статьи, и спрошу, как они это делали.

Активность протеинкиназы, коиммунопреципитация
Yuly



Отправлено: 23.08.2013 12:09  |  Молекулярная и клеточная биологияМолекулярная и клеточная биология  |  link: #1428592  |  Ответов: 16  |  Просмотров: 4 343
(guest: ммм @ 22.08.2013 19:00)
Ссылка на исходное сообщение  

Где они их смыли? там ни слова про смыли нет и чем смыли нет ни слова: "Immune complexes were washed with lysis buffer " Промыт он был при чем тем же буфером, в котором инкубировался, т.е. смыть этим буфером в принципе ничего нельзя.



Хм, я думала, что это само собой разумеющийся этап, фермент разве будет работать, если он иммобилизирован, да вдобавок, если иммобилизирован еще и его субстрат?

Активность протеинкиназы, коиммунопреципитация
Yuly



Отправлено: 22.08.2013 12:05  |  Молекулярная и клеточная биологияМолекулярная и клеточная биология  |  link: #1428381  |  Ответов: 16  |  Просмотров: 4 343
(guest: ммм @ 22.08.2013 06:22)
Ссылка на исходное сообщение  Чота, я методики не понял они что смешивают сефарозу с иммобилизованной фосфатазой с сефарозой с иммобилизованым субсратом и у них идет реакция?

А фосфор в данном случае можно заменить антителами к фосфорилированному субстрату,если конечно они доступны.


Они сначала клеточный лизат проинкубировали с антителами против протеинкиназы (AMPK) или с антителами против субстрата (eEF2), потом инкубации с сефарозой, смыли иммунокомплексы AMPK или eEF2, слили в одну смесь, добавили реакционный буфер A.

По поводу замены антител к фосфорилированному субстрату, такие антитела есть, и мысль хороша, только я так понимаю, что для моего случая не подходит т.к. к этому же субстрату (eEF2) по тому же сайту фосфорилирования работает другая, eEF2-киназа. И если я на блоте увижу увеличение содержания фосфорилированной eEF2, то не факт, что это благодаря AMPK, может это уже eEF2k успела поработать в клетках. Или тогда выделять иммунопреципитацией только нефосфорилированную форму eEF2, если такие антитела бывают...
страницы (2):  1 2 > 

Новые сообщения  Есть новые сообщения
Нет новых сообщений  Нет новых сообщений
Нет новых сообщений*  Тема с вашим участием
Горячая тема - новые сообщения  Горячая тема (есть новые сообщений)
Горячая тема - нет новых сообщений  Горячая тема (нет новых сообщений)
Важно - нет новых сообщений  Важная тема
Опрос - есть новые голоса  Опрос — есть новые голоса
Опрос - нет новых голосов  Опрос — нет новых голосов
Опрос -нет новых голосов  Опрос с вашим участием
Объявление  Объявление
Тема закрыта  Закрытая тема
Тема перемещена  Перемещённая тема


Rambler   molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов              

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Ваш форум  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама  ·  Дата и время: 19.04.21 11:58
Bridged By IpbWiki: Integration Of Invision Power Board and MediaWiki © GlobalSoft