Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
Anastasia Buziashvili |
1) клетки наращиваю до OD600 0.3-0.6, 2) остужаю культуру в течение ночи в холодильнике, 3) осаждаю в эппендорфах 4 мин при 5000 об при +4, 4) ресуспендирую покачиванием (встряхиванием) клетки в 1 мл холодного CaCl2 (+4, из холодильника), 5) дальше отбираю в 2 эппендорфа по 100 мкл клеток, 6) в 1 закапываю плазмиду (точное количество не отмеряю, т.к. мы выделяем плазмиду без РНКазы, и образцы содержат много РНК. Капаю по 20 мкл раствора pDNA), второй эппендорф - контрольный, с ним ничего не делаю. 7) Оба эппендорфа щелкаю пальцем, чтобы перемешать клетки с плазмидой, 8) дальше оба замораживаю в жидком азоте (где-то минуту), и 9) кладу в термостат на 5 мин, 37 градусов. 10) Потом добавляю 1 мл LB и кладу оба эппендорфа в термостат на +28 градусов на 2 часа. 11) Потом из обоих эппендорфов отбираю 100 мкл и сажаю на чашки Петри с твердым LB, 100 мг/л канамицина, 50 мг/л рифампицина, распределяю клетки по среде шпателем, просушиваю до высыхания. Теперь вопрос. Почему у меня через 1 сутки на чашках Петри вырастает газон и в трансформированных, и в нетрансформированных образцах? С антибиотиками, вроде, нет проблем - сажала пустые штаммы на ту же твердую среду LB, 100 мг/л канамицина, 50 мг/л рифампицина - ничего не растет. Заплавляю я в хорошо остуженную среду. На всякий случай следующие трансформации буду сажать на среду со свежими антибиотиками. Почему агробактерия может себя так вести, кто встречался с такой же проблемой, как это решили? |
MMM Постоянный участник |
|
distemper Постоянный участник |
|
Anastasia Buziashvili |
(MMM @ 30.05.2018 07:32) Исходная фасовка не растет. Сажала вчера бактерию просто с чашки Петри и приготовленные компетентные клетки - ничего, слава Богу, не выросло на среде с канамицином и рифампицином. На рифампицине растет все как надо. Скорее всего, я на прошлой неделе контаминировала клетки уже после трансформации, возможно, на этапе recovery phase c жидким LB. Сегодня повторила трансформацию, буду ждать результата... |
Esya Постоянный участник PA, USA |
|
Anastasia Buziashvili |
|
watchesonline89 Постоянный участник |
|
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |