Rambler's Top100
Лёгкая версия форума* Виртуальная клавиатура  English  
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы
Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Междисциплинарный биологический онлайн-журналZbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ


Темы за 24 часа  [ Вход* | Регистрация* ]  
   



Форум: 
 

Результаты поиска -- Найденные сообщения --

страницы (3):  1 2 3 >

Где заказать ХОРОШИЕ праймеры
Silence
Участник
Москва


Отправлено: 03.02.2012 14:58  |  Молекулярная и клеточная биологияМолекулярная и клеточная биология  |  link: #1290553  |  Ответов: 28  |  Просмотров: 8 149
По моему скромному мнению стабильность олигов зависит от их нуклеотидного состава. Некоторые праймеры довольно быстро перестают работать в ПЦР, приходится перезаказывать, а некоторые действительно по 10 лет - и без проблем.
Хотя, конечно, возможно что дело не только в нуклеотидном составе...

Метилирование! Помогите!
Silence
Участник
Москва


Отправлено: 28.02.2011 13:04  |  Молекулярная и клеточная биологияМолекулярная и клеточная биология  |  link: #1169891  |  Ответов: 14  |  Просмотров: 4 612
И нам тоже протокол интересен!

Как пометить 5'-конец РНК?
Silence
Участник
Москва


Отправлено: 16.11.2010 15:51  |  Молекулярная и клеточная биологияМолекулярная и клеточная биология  |  link: #1127708  |  Ответов: 16  |  Просмотров: 4 492
(Ekaterina Petrova @ 10.11.2010 15:12)
Ссылка на исходное сообщение  Мне нужно просто "посмотреть" структуру 5'-конца...
Дело в том, что у нас есть сомнения в том, работает ли у нас декэпирующая система. Поэтому идея состоит в том, чтобы пометить просто выделенную РНК и декэпированную специальным китом РНК. Там, где кэп остался, РНК должна быть немеченной, а без него - с меткой.


А у меня такая идея появилась:
Факт1: Exoribonuclease I degrades single-stranded RNA from 5'-to-3'
Факт2: Кэпированную РНК Exoribonuclease I не деградирует.
Так что эксперимент получается простой, только надо выделенную мРНК использовать, не уверен, что тРНК/рРНК будут деградировать.
Этот фермент (дрожжевая XRN-1) продается в NEB.

Выделение РНК из кожи
Silence
Участник
Москва


Отправлено: 26.01.2010 15:32  |  Молекулярная и клеточная биологияМолекулярная и клеточная биология  |  link: #1000351  |  Ответов: 17  |  Просмотров: 4 161
Честно говоря, я выделял РНК из мышиной кожи китом QIAGEN, тризолом выход был совсем уж небольшой. Но обнаружено, что критическая стадия - это измельчение кожи. Я резал кожу скальпелем с жидким азотом до ОЧЕНЬ МЕЛКОГО порошка (3-4 раза). А затем потереть еще с RLT прямо в ступке.

Хочу эндотелий!
Silence
Участник
Москва


Отправлено: 16.11.2009 13:36  |  Молекулярная и клеточная биологияМолекулярная и клеточная биология  |  link: #968976  |  Ответов: 7  |  Просмотров: 2 223
Есть РНК и кДНК с хувеков. Сойдет?

Eva vs Sybr
Silence
Участник
Москва


Отправлено: 16.11.2009 11:36  |  Молекулярная и клеточная биологияМолекулярная и клеточная биология  |  link: #968890  |  Ответов: 2  |  Просмотров: 1 875
Скорее всего, Вы не использовали external well factor, что необходимо делать в таком варианте ПЦРа.

Буфер RLT
Silence
Участник
Москва


Отправлено: 05.11.2009 18:27  |  Молекулярная и клеточная биологияМолекулярная и клеточная биология  |  link: #966490  |  Ответов: 5  |  Просмотров: 2 376
Тоже интересовался. Нагуглил в патентах, дословно:
"RLT buffer denotes a standard commercial buffer (obtainable from Messrs. QIAGEN
, Hilden) based on a guanidinium salt such as eg guanidinium isothiocyanate and an alkali metal salt of a polybasic organic acid, as well as beta-ME, which buffers at pH 7"

Долой скрытность!

Одновременное выделение РНК и белков из мышц
Silence
Участник
Москва


Отправлено: 10.07.2009 16:18  |  Молекулярная и клеточная биологияМолекулярная и клеточная биология  |  link: #919203  |  Ответов: 6  |  Просмотров: 2 860
(guest: ммм @ 10.07.2009 14:03)
Ссылка на исходное сообщение  1) Тризол можно самому смешать.
2) очевидно что тризол буде выделять говно
3) Нормальные люди не загоняют себя в угол и берут отдельно белковые пробы отдельно ДНК.

Выделять адекватгно белок и РНК одновременно из одной пробы технически практически невозможно или исключительно дорого. Это просто сложно по биохимии. Вы фактически обрекаете себя на то что у вас небудет ни тог7о ни другого.

Поэтому негородите ерунды. А планируйте все почеловечески: скупой плати дважды.


1. Можно. Мешали уже. Получается хуже, чем коммерческий.
2. согласен.
3. Тогда я ненормальный. У меня отлично выделяются РНК и белки из других тканей мышей и делается это элементарно: добавляется ацетон к тому, что не задержалось на колонке RNeasy. Всем рекомендую.

Насчет скупости: меня не жаба душит, а мизерное количество материала.

Одновременное выделение РНК и белков из мышц
Silence
Участник
Москва


Отправлено: 10.07.2009 14:30  |  Молекулярная и клеточная биологияМолекулярная и клеточная биология  |  link: #919144  |  Ответов: 6  |  Просмотров: 2 860
(Ъ @ 10.07.2009 09:43)
Ссылка на исходное сообщение  Для одновременного выделения ДНК, РНК и белков:
http://www.ambion.com/techlib/prot/bp_9738.pdf


Спасибо большое за ответ. Но, это всего лишь вариант Тризола, и я не знаю, какие реальные выходы РНК и белков получаются с триреагентом от амбиона. Покупать реагент только для предварительных опытов нерационально, хотелось бы услышать мнение тех, у кого стояла похожая задача.

Одновременное выделение РНК и белков из мышц
Silence
Участник
Москва


Отправлено: 10.07.2009 11:16  |  Молекулярная и клеточная биологияМолекулярная и клеточная биология  |  link: #919075  |  Ответов: 6  |  Просмотров: 2 860
Уважаемые коллеги,

есть ли у кого положительный опыт одновременного выделения РНК и белков из мышечной ткани? По отдельности всё выделяется ОК, но материала для выделения очень уж мало, а сделать хочется много smile.gif
Для выделения РНК мы используем протеиназу К + RNeasy kits. Тризолом получается маловато и грязновато (может, какие-то тонкости там есть?). РНК понадобится для RTи real-time PCR, а белки для вестернов.

Пока что у меня есть подозрение, что по выходу РНК и белков одновременное выделение есть не самый удачный вариант.
Прав ли я?

NanoVue Nanodrop BioSpec-nano Picodrop NanoPhotometer
Silence
Участник
Москва


Отправлено: 06.07.2009 14:53  |  Молекулярная и клеточная биологияМолекулярная и клеточная биология  |  link: #917852  |  Ответов: 53  |  Просмотров: 36 038
(plotter @ 05.07.2009 14:03)
Ссылка на исходное сообщение  У меня 100% недоверие всем этим нанометрам. Появилось оно после того, как я решил интересу ради померить высоко-отчищенную плазмиду на дропе. Лучше бы не делал. 5 замеров и на каждом разброс значений +/- 30% от среднестатистической нормы. Оно в принципе понятно, каждый раз капля облегает всегда по разному, пылинка попасть может и т.п. Гемор короче тот ещё. Предпочитаю классический замер в кюветке.


Очень странно. У меня разброс не превышал 1-3% для концентраций выше 100 нг/мкл. Видимо, у Вас какая-то проблема с прибором.

Как удачно сварить праймеры из ДНК?
Silence
Участник
Москва


Отправлено: 26.05.2009 12:29  |  Молекулярная и клеточная биологияМолекулярная и клеточная биология  |  link: #903248  |  Ответов: 30  |  Просмотров: 4 895
(ship @ 25.05.2009 18:35)
Ссылка на исходное сообщение  то есть вы хотите клонировать днк некоего нового вируса из растений использовав в качестве затравки для РТ-ПЦР самопальные праймеры, сделанные из кДНК гомологичного вируса?

-Именно так! Есть большая коллекция кДНК клонов вирусов растений, можно ее использовать.

-Насчет РТ с тотальной ДНК - это просто очепятка, сорри.

-Насчет обычной процедуры с частично вырожденными праймерами-РТ-ПЦР-сиквенс-RACE - это всё мне, конечно, известно, но ведь хочется иногда поизвращаться... А массовое секвенирование кДНК-библиотеки всё дешевле и дешевле...

Как удачно сварить праймеры из ДНК?
Silence
Участник
Москва


Отправлено: 25.05.2009 14:33  |  Молекулярная и клеточная биологияМолекулярная и клеточная биология  |  link: #902962  |  Ответов: 30  |  Просмотров: 4 895
2 genseq:
Спасибо! Написал в личку.

2 ship:
Ну, есть такая надежда, что такой самопал может помочь избирательно обогатить смесь ДНКи. Ну например: заражено растение каким-то вирусом, примерно понятно каким. Тогда я выделяю тотальную ДНКу, и ставлю RT c такими самопальными праймерами, полученными из кДНК клона вируса-родственника.
Или еще можно что-нибудь придумать... Главная цель - специфическое обогащение пула ДНК из сложной смеси.

Как удачно сварить праймеры из ДНК?
Silence
Участник
Москва


Отправлено: 22.05.2009 15:28  |  Молекулярная и клеточная биологияМолекулярная и клеточная биология  |  link: #902373  |  Ответов: 30  |  Просмотров: 4 895
2 RJ Dio:
Я разоблачен! Не понимаю, как Вы смогли догадаться о моих опытах по зарождению жизни на трупиках бактерий? confused.gif

2 guest: ммм
Что-то с ДНКазой у меня получается слишком широкий набор фрагментов с преобладанием 10-12 нт (резал DNAseI Fermentas + Mg). А хотелось бы получить небольшой и приятненький узенький пичок...

Как удачно сварить праймеры из ДНК?
Silence
Участник
Москва


Отправлено: 21.05.2009 20:01  |  Молекулярная и клеточная биологияМолекулярная и клеточная биология  |  link: #902009  |  Ответов: 30  |  Просмотров: 4 895
(Ъ @ 21.05.2009 16:02)
Ссылка на исходное сообщение  Идея порочная. Такими рандом-праймерами невоспроизводимые результаты обеспечены, даже при "неспецифической амплификации".

Такие рандом-праймеры получали в 70-х прошлого столетия, когда только учились синтезировать олиги. Я хочу сказать. такого добра можно насинтезировать очень дешево и много. Или вам делать нечего. confused.gif


Спасибо за ответ. Действительно, если этот велосипед уже изобретали то можно и не мучаться. Разве что чуть-чуть...

Как удачно сварить праймеры из ДНК?
Silence
Участник
Москва


Отправлено: 21.05.2009 15:51  |  Молекулярная и клеточная биологияМолекулярная и клеточная биология  |  link: #901919  |  Ответов: 30  |  Просмотров: 4 895
Уважаемые коллеги!
Появилась идея нарезать ДНК на короткие олиги, которые можно потом использовать для "полуспецифических" реакций обратной транскрипции, или как "праймеры" для real-time PCR.
ДНК из бактерий была выделена обычными методами + РНКаза, потом стал ее нарезать следующими способами:
1. Кипячение в воде. Действует живительно, ДНК разрушается за несколько часов до фрагментов нужных размеров (15-50нт). Правда, непонятно что с 3'-концами этих молекул. Кто что думает по этому поводу? Пробовал проверить работоспособность этих "праймеров" real-time PCR - что-то ничего не получилось...
2. Ультразвук. Прибор был советский, разрушить до олигов не удалось, а в ушах до сих пор стоит звон smile.gif .
3. ДНКаза. Режет на оч. широкий диапазон фрагментов, видимо, для моих целей не подходит.

Есть ли еще идеи как можно это сделать?
Заранее благодарен за любые советы, кроме комментариев типа "Зачем вообще с этим связываться?"

TA cloning
Silence
Участник
Москва


Отправлено: 03.12.2008 13:45  |  Молекулярная и клеточная биологияМолекулярная и клеточная биология  |  link: #790925  |  Ответов: 11  |  Просмотров: 2 889
Не соглашусь с предыдущим постом.
Наготовил 3 года назад по молбиоловской методике 100 аликвот Т-вектора, до сих пор пользуюсь, всё ОК.
Единственный момент - вырезание из геля и самолигирование проводил два раза, в итоге НИКОГДА не вырастает пустых клонов.
Работайте!

pathways after microarray data - софт
Silence
Участник
Москва


Отправлено: 28.11.2008 14:32  |  Молекулярная и клеточная биологияМолекулярная и клеточная биология  |  link: #787493  |  Ответов: 4  |  Просмотров: 2 517
Для этой цели мы используем Onto Tools, она учитывает направление регуляции и выдаёт разумные pathways. В NAR'e есть пара статей про неё в открытом доступе.
http://vortex.cs.wayne.edu/projects.htm#Onto-Express

Вектора pET в Москве
Silence
Участник
Москва


Отправлено: 27.05.2008 15:18  |  Молекулярная и клеточная биологияМолекулярная и клеточная биология  |  link: #680300  |  Ответов: 2  |  Просмотров: 2 110
Есть pET 3a, 22b+, 20b

Методы оценки повреждения ДНК
Silence
Участник
Москва


Отправлено: 06.12.2007 14:32  |  Молекулярная и клеточная биологияМолекулярная и клеточная биология  |  link: #600956  |  Ответов: 16  |  Просмотров: 4 844
К последнему посту: я использовал этот метод, работает неплохо, но требует очень качественных реактивов и хорошей ПЦР-машины.

двухфазные кривые qPCR - почему?
Silence
Участник
Москва


Отправлено: 29.11.2007 13:07  |  Молекулярная и клеточная биологияМолекулярная и клеточная биология  |  link: #597679  |  Ответов: 15  |  Просмотров: 4 012
(Guest @ 27.11.2007 17:15)
Ссылка на исходное сообщение  может сибра какую фигню делает - я давно на сибре не гоняю
на Евегрин таких фаз не замечал - сибра достаточно фиговый для реалтайм
http://www.biotium.com/product/product_inf...er/evagreen.pdf

Извините за оффтоп: если вы в Москве, то у кого покупаете Еву?

двухфазные кривые qPCR - почему?
Silence
Участник
Москва


Отправлено: 27.11.2007 10:47  |  Молекулярная и клеточная биологияМолекулярная и клеточная биология  |  link: #596611  |  Ответов: 15  |  Просмотров: 4 012
(Kreslavsky @ 26.11.2007 14:49)
Ссылка на исходное сообщение  спасибо!
а какие "игры" с baseline правомочны? а то такого наиграть можно... %-)

Честно говоря, четкого определения правомочности я дать не могу smile.gif Просто эмпирически подбираю такой диапазон Ct для baseline, чтобы кривая выглядела по-человечески. При ранней амплификации часто работают значения 2ой-5ый цикл, или 3ий-6ой.

двухфазные кривые qPCR - почему?
Silence
Участник
Москва


Отправлено: 26.11.2007 11:44  |  Молекулярная и клеточная биологияМолекулярная и клеточная биология  |  link: #596054  |  Ответов: 15  |  Просмотров: 4 012
Это известная проблема, возникающая при ранней (Ст до 10-15) амплификации. Бороться с этим можно или разводя матрицу (что я бы и делал), или вручную "играясь" с baseline settings, подбирая ее индивидуально для каждой кривой (не всякий софт это позволяет, я использую биорадовский для IQ5)

Help! Срочно нужны АТ к дых.цепи
Silence
Участник
Москва


Отправлено: 10.01.2007 11:14  |  Молекулярная и клеточная биологияМолекулярная и клеточная биология  |  link: #447345  |  Ответов: 0  |  Просмотров: 1 836
Пожалуйста!
Кому не жалко поделиться антителами на 5-6 иммуноблотов? Возможен обмен на др. антитела или реактивы.
Антитела пригодятся любые, к любым субъединицам комплексов I, III и IV.

Пишите на e-mail zinovkin@genebee.msu.su
Спасибо заранее!

Мелатонин защищает от токсина сине-зеленых водорослей
Silence
Участник
Москва


Отправлено: 12.12.2006 10:40  |  Колонка новостейКолонка новостей  |  link: #436669  |  Ответов: 4  |  Просмотров: 4 246
Ссылка на реферат статьи пустая!
страницы (3):  1 2 3 > 

Новые сообщения  Есть новые сообщения
Нет новых сообщений  Нет новых сообщений
Нет новых сообщений*  Тема с вашим участием
Горячая тема - новые сообщения  Горячая тема (есть новые сообщений)
Горячая тема - нет новых сообщений  Горячая тема (нет новых сообщений)
Важно - нет новых сообщений  Важная тема
Опрос - есть новые голоса  Опрос — есть новые голоса
Опрос - нет новых голосов  Опрос — нет новых голосов
Опрос -нет новых голосов  Опрос с вашим участием
Объявление  Объявление
Тема закрыта  Закрытая тема
Тема перемещена  Перемещённая тема


Rambler   molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов              

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Ваш форум  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама  ·  Дата и время: 20.10.21 05:09
Bridged By IpbWiki: Integration Of Invision Power Board and MediaWiki © GlobalSoft