Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
nick25 |
biovision Есть проблеми с протоколом, в инструкции сказано просто разведите антитело в binding buffer и проинкубируйте клетки в течении 5 мин. Посмотрел в pubmed люди восновном работают с этим китом для FACS анализа, мне же нужно посмотреть апоптотические клетки на слайде, я заражаю клетки аденовирусом и смотрю приводит ли активация моего гена к апоптозу. Вообшем в моих руках апоптотических клеток вообще невижу даже там где положительний контроль. Буду очень признателен если у кого-нибудь есть протокол как это делать. |
gostya Постоянный участник |
|
nick25 |
мембрану и тогда поялвяется неспецифика, которая весь сигнал перекроет |
gostya Постоянный участник |
если у вас fitc, то он быстро выгорает |
AE Постоянный участник |
(nick25 @ 09.05.2005 22:07) Вопрос такой кто-нибудь работал с apoptosis detection kit на annexin V от biovision Есть проблеми с протоколом, в инструкции сказано просто разведите антитело в binding buffer и проинкубируйте клетки в течении 5 мин. Посмотрел в pubmed люди восновном работают с этим китом для FACS анализа, мне же нужно посмотреть апоптотические клетки на слайде, я заражаю клетки аденовирусом и смотрю приводит ли активация моего гена к апоптозу. Вообшем в моих руках апоптотических клеток вообще невижу даже там где положительний контроль. Буду очень признателен если у кого-нибудь есть протокол как это делать. Какие клетки? Что является позитивным контролем? А вы сразу растите свои клетки на покровном стекле? Вы уверены, что они не открепляются когда уходят в апоптоз? Довольно распространенное явление. Попробуйте собрать все и открепленные и прикрепленные клетки (трипсином или edta) до кучи и просто посмотреть с PI увеличивается ли количество PIpos. Попробуйте также посмотреть апоптоз по другому, например померяйте каспазы. |
Дядя ФАКСер Постоянный участник Nothern Maccaronia, Ticinum |
(nick25 @ 09.05.2005 21:07) Вопрос такой кто-нибудь работал с apoptosis detection kit на annexin V от biovision Есть проблеми с протоколом, в инструкции сказано просто разведите антитело в binding buffer и проинкубируйте клетки в течении 5 мин. Посмотрел в pubmed люди восновном работают с этим китом для FACS анализа, мне же нужно посмотреть апоптотические клетки на слайде, я заражаю клетки аденовирусом и смотрю приводит ли активация моего гена к апоптозу. Вообшем в моих руках апоптотических клеток вообще невижу даже там где положительний контроль. Буду очень признателен если у кого-нибудь есть протокол как это делать. Та-а-ак. Ну во- первых - зайдите на такие сайты, как: http://www.probes.com http://www.bd.com http://coulter.com и им подобные- найдете много интересного. А во-вторых - ну ведь такой же кондовый метод - как с ним могут проблемы возникнуть? А в третьих, Аннексин-V - не антитело |
Дядя ФАКСер Постоянный участник Nothern Maccaronia, Ticinum |
(gostya @ 09.05.2005 21:10) Я плакалЪ... |
гость: g IP-штамп: frlkSmZr37YvE гость |
|
MHC II Постоянный участник |
|
MHC II Постоянный участник |
(гость: g @ 10.05.2005 08:59) Как раз для детектсии апоптоза чаще всего клетки не фиксируют и пермобилизируют... |
Glebber Постоянный участник London, UK |
http://probes.invitrogen.com/servlets/product?item=273 |
nick25 |
хорошая идея, но я вижу на слайде много даже мертвих клеток, наверное попробую посмотреть каспазы, я на самом деле не уверен что мой ген будет вызивать апаптоз в этои системе, у меня есть другие данные in vivo по поводу его, полозительнии контроль просто эти же клетки инкубированние в среде без сыворотки, так по крайней мере вызывают апоптоз другие исследователи, ссылки счас посмотрю может чего найду. Аннехин я делаю cy-3, это красниq фильтр |
imers Участник Москва |
(nick25 @ 10.05.2005 20:11) полозительнии контроль просто эти же клетки инкубированние в среде без сыворотки, так по крайней мере вызывают апоптоз другие исследователи Да, интересно - и долго их без сыворотки нужно для этого держать? А то я на ночь оставляла в бессывороточной - и все с ними ОК было. Правда, клетки другие. Просто для себя узнать интересно! А чего б апоптоз какой-нить перекисью водорода не вызвать? |
gostya Постоянный участник |
|
AE Постоянный участник |
полозительнии контроль просто эти же клетки инкубированние в среде без сыворотки, Беглый просмотр первых десяти ссылок выдаваемых гуглем на hc-11 apoptisis привел меня к выводу, что нужно скорее убирать инсулин из среды. При этом и ждать нужно довольно долго. Вроде как есть и другие методы вызвать у ваших клеток апоптоз. Для НepG2 я в свое время использовал добавление дезоксихолата. Не знаю на счет покраски с аннексином, но активация каспаз и Dioc6-low популяция при этом детектируется на раз. Аннехин я делаю cy-3, это красниq фильтр При этом вы лишаетесь возможности комбинировать эту окраску с PI. |
natusik Постоянный участник окрестности Чикаго |
Клетки легочного эпителия оказались очень даже устойчивыми к этим воздействиям. Меряю одновременно на флоу экстернализацию PS (на FACScane первый "зеленый" канал, потому как третий "красный" идет на PI) и каспазы отдельным китом и не на флоу (рыдает в три ручья, потому как другим китом на хемилюминометре геморройно и надо на белок нормализовать). С перекисью водорода надо быть осторожнее, в зависимости от концентрации каспазы ингибируются. |
natusik Постоянный участник окрестности Чикаго |
|
nick25 |
так нашел в статьях, да PI не могу использовать, но вихода другого нет вирус которым я заражаю несет мои белок как fusion с GFP, перекисью попробую конечно . Всем большое спасибо за советы |
Guest IP-штамп: fr9BGIs2DoBvs гость |
(nick25 @ 09.05.2005 23:07) Вопрос такой кто-нибудь работал с apoptosis detection kit на annexin V от biovision Есть проблеми с протоколом, в инструкции сказано просто разведите антитело в binding buffer и проинкубируйте клетки в течении 5 мин. Посмотрел в pubmed люди восновном работают с этим китом для FACS анализа, мне же нужно посмотреть апоптотические клетки на слайде, я заражаю клетки аденовирусом и смотрю приводит ли активация моего гена к апоптозу. Вообшем в моих руках апоптотических клеток вообще невижу даже там где положительний контроль. Буду очень признателен если у кого-нибудь есть протокол как это делать. dlja polojitelnogo kontrolja lutshe UV Chem sivorotka. FITC vimiraet esli ne analizirovat nepremenno ili mojno na -20 derjat max 1 week v mounting medium... |
AnNaKa |
Прошу помощи по теме. Как влияет на клеточную мембрану трипсинизация? В протоколах анализа апоптоза с помощью аннексина всюду используют суспензионные культуры.. У кого какой опыт анализа монослойных культур? Спасибо! |
watchesonline89 Постоянный участник |
|
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |