Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
Tatsiana |
|
ksm Постоянный участник |
я не специалист по инфецированию, но полагаю что проблемы следующие: 1. "рукожопие" а) кривые руки при постановке эксперимента; б) низкорасположенные руки при фиксации материала; в) неспособность пользоваться протоколом; г) неверная интерпретация результатов пользования нанодропом, т.к. РНК по сути не выделилась. 2. если я не прав в п.1, то проблемы в чем-то ином а) мало материала б) испорченный кит в) плохой нанодроп |
ASDF Постоянный участник |
|
vb Постоянный участник |
ну и присоединяюсь к предыдущему оратору 1 ЕСЛИ речь о 96луночном планшете, то это нормальное такое количество. |
Tatsiana |
|
ship Постоянный участник Moscow |
примерный выход РНК из миллиона клеток от 10 до 30 мкг в зависимости от типа клеток. ну и если даже выход низкий - то этого все равно хватит например для обратной транскрипции. если у вас конечно более-менее нормальная ревертаза и вы умеете делать RT. |
Tatsiana |
(ship @ 17.05.2018 13:28) Объем элюции то какой? то есть какой выход РНК с одной лунки? примерный выход РНК из миллиона клеток от 10 до 30 мкг в зависимости от типа клеток. ну и если даже выход низкий - то этого все равно хватит например для обратной транскрипции. если у вас конечно более-менее нормальная ревертаза и вы умеете делать RT. РНК из одной лунки экстрагировалась в объем 30 мкл (остальные лунки аналогично), концентрации РНК после измерения на Nanodrop составили от порядка 2 до 20 нг на мкл объема экстракции (30 мкл), таким образом, выход РНК в лунках варьировал от 60 до 600 нг в 30 мкл? |
ship Постоянный участник Moscow |
потому что если так - то выход 600 нг вполне адекватен. |
Tatsiana |
(ship @ 17.05.2018 14:57) клетки BEAS-2B это что за клетки? я очень сильно сомневаюсь что в лунке 24 луночного планшета вы сможете комфортно разместить такое количество клеток. вы уверены что не ошиблись на порядок с количеством клеток? потому что если так - то выход 600 нг вполне адекватен. BEAS-2B - клетки бронхиального эпителия человека. Извините за несильную грамотность в этом вопросе ( у меня только 1,5 месяца опыта работы с культивированием клеток). Вы подразумеваете, что в данном случае мы добавили больше клеток, чем может вместить планшет, в итоге неприкрепленные клетки не вносят вклад в суммарную РНК, и выход соответствует гораздо меньшему количеству клеток, которые прикрепились к планшету? Грубо говоря, мы внесли 10(6), прикрепились 10(5), последние обеспечили выход РНК? |
vb Постоянный участник |
(Tatsiana @ 17.05.2018 12:16) BEAS-2B - клетки бронхиального эпителия человека. Извините за несильную грамотность в этом вопросе ( у меня только 1,5 месяца опыта работы с культивированием клеток). Вы подразумеваете, что в данном случае мы добавили больше клеток, чем может вместить планшет, в итоге неприкрепленные клетки не вносят вклад в суммарную РНК, и выход соответствует гораздо меньшему количеству клеток, которые прикрепились к планшету? Грубо говоря, мы внесли 10(6), прикрепились 10(5), последние обеспечили выход РНК? Все может быть. Они могут как не прикрепиться и сдохнуть, так и размножиться. Поэтому считать на внесенное количество клеток несколько некорректно. Обычно с контрольной лунки собирают интактные клетки и их считают, если уж клетки в лунках доя выделения рнк недоступны доя подсчета. Или снимают клетки, считают, а потом выделяют. Это если аналит (в вашем случае рнк) нужно нормировать по количеству клеток. |
ship Постоянный участник Moscow |
(Tatsiana @ 17.05.2018 12:16) BEAS-2B - клетки бронхиального эпителия человека. Извините за несильную грамотность в этом вопросе ( у меня только 1,5 месяца опыта работы с культивированием клеток). Вы подразумеваете, что в данном случае мы добавили больше клеток, чем может вместить планшет, в итоге неприкрепленные клетки не вносят вклад в суммарную РНК, и выход соответствует гораздо меньшему количеству клеток, которые прикрепились к планшету? Грубо говоря, мы внесли 10(6), прикрепились 10(5), последние обеспечили выход РНК? Ну вы на лунки то смотрели хотя бы после рассева клеток? если вы по миллиону бухнули в лунку это видно будет, что там не просто монослой, а огромная куча клеток. может они не прикрепились и вы их, или сдохли от такой высокой плотности и открепились, или мало ли что еще вы не так сделали. Научитесь считать и культивировать клетки, посейте их в разной плотности, определите какая оптимальная и тп. потом уже за выделение РНК беритесь. Мы со сходными линиями работаем, обычно по 80 000 клеток в 24 луночный сеется. |
ship Постоянный участник Moscow |
(vb @ 17.05.2018 12:46) вот это точно не нужно делать ни при каких обстоятельствах! и вообще, концентрация РНК определяется и далее исходя из нее все нормируется. а количество клеток - ого все равно ни при рассеве и потом реально точно определить невозможно, если только не гонять суспензию через ФАКС, и концентрация РНК это более точный параметр. |
Tatsiana |
(ship @ 17.05.2018 16:52) Ну вы на лунки то смотрели хотя бы после рассева клеток? если вы по миллиону бухнули в лунку это видно будет, что там не просто монослой, а огромная куча клеток. может они не прикрепились и вы их, или сдохли от такой высокой плотности и открепились, или мало ли что еще вы не так сделали. Научитесь считать и культивировать клетки, посейте их в разной плотности, определите какая оптимальная и тп. потом уже за выделение РНК беритесь. Мы со сходными линиями работаем, обычно по 80 000 клеток в 24 луночный сеется. Спасибо большое! |
Horse-radish Участник |
|
Tatsiana |
(Horse-radish @ 17.05.2018 17:30) Нет, коллаген не используем |
Tatsiana |
(ship @ 17.05.2018 16:52) Ну вы на лунки то смотрели хотя бы после рассева клеток? если вы по миллиону бухнули в лунку это видно будет, что там не просто монослой, а огромная куча клеток. может они не прикрепились и вы их, или сдохли от такой высокой плотности и открепились, или мало ли что еще вы не так сделали. Научитесь считать и культивировать клетки, посейте их в разной плотности, определите какая оптимальная и тп. потом уже за выделение РНК беритесь. Мы со сходными линиями работаем, обычно по 80 000 клеток в 24 луночный сеется. Подскажите, пожалуйста, а размер Ваших клеток сопоставим с BEAS-2B, BEAS-2B сравнительно маленькие клетки. |
ship Постоянный участник Moscow |
размер у них достаточно большой, например по сравнению с HEK293. на важна еще скорость пролиферации. ни одни клетки нельзя посеять в 24луночный в плотности 10(6) |
vb Постоянный участник |
(ship @ 17.05.2018 13:55) вот это точно не нужно делать ни при каких обстоятельствах! и вообще, концентрация РНК определяется и далее исходя из нее все нормируется. а количество клеток - ого все равно ни при рассеве и потом реально точно определить невозможно, если только не гонять суспензию через ФАКС, и концентрация РНК это более точный параметр. Чейта? Всяко делают. |
ship Постоянный участник Moscow |
(vb @ 18.05.2018 11:00) трипсинизация, в отличие от промывки ПБС, это уж точно сильный стресс для клеток, что может повлиять на профиль экспресии генов. При трипсинизации или снятии версеном разрушаются адгезионные контакты, происходит сильное изменение формы клетки, плюс механический стресс при пипетировании и тп и тд. |
Tom1 Постоянный участник |
================================== Почему-то никто не обатил внимания.... |
watchesonline89 Постоянный участник |
|
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |