Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
genseq Постоянный участник |
"Вместо Taq нужно использовать любую другую полимеразу, у которой нет terminal transferase activity, например - Pfu, дающую blunt ends. " Вы будете смеяться, но приходится учитывать, что Pfu намного дороже Taq. Кроме того, доступной она стала совсем недавно - несколько лет назад, а Taq - он всегда под рукой. Ещё одна заморочка - Pfu довольно быстро "сгрызает" праймеры и нужно подбирать условия, при которых это не критично, или заказывать тио-модификацию 3'-концевой фосфодиэфирной связи, а это тоже лишняя головная боль. |
DmitriM Постоянный участник |
|
Павел Постоянный участник Новосибирск |
|
genseq Постоянный участник |
Что касается довеска А, то он, скорее всего, сильно не мешает, тем не менее праймеры желательно начинать с буквы, следующей за T. Тогда довесок А с гарантией не сможет чему-либо помешать, так как будет соответствовать требуемой последовательности. Во всяком случае, при таком подборе праймеров у меня проблем не было. |
alex2345 Постоянный участник |
> на тубике А это что такое? Это из серии "а что ты сделал для hip-hopa"? Закодировался так, что старшие товарищи перестали тебя понимать |
genseq Постоянный участник |
Кстати, полностью отсеквенировано уже 2 штамма. При попарном сопоставлении последовательностей их генов выявляются гипервариабельные участки, указывающие на уязвимые для иммунной системы эпитопы. Жалко, что ни ПЦР-диагностика, ни разработка туберкулёзных вакцин нового поколения никого не интересуют. Даже пострадавшего от туберкулёза Вешку . |
gostya Постоянный участник |
|
Esya Постоянный участник PA, USA |
|
Veshka Постоянный участник Москва |
Автор - genseq: Генсек, нельзя всё-таки быть таким дремучим. Кстати для справки, мой стаж работы не сильно меньше Вашего. Может лет на десять если с 75 года считать. To: Veshka \"Во гимор...на таке ген собирать...\" Если я правильно понял, то \"гимор\" - это, по-видимому, геморрой, а \"так\" - это Taq-полимераза. Собирать на \"таке\" гены - это \"гимор\" только для начинающих генных инженеров, а я этим делом балуюсь с 75 года прошлого века. \"Чтобы не шмерило, нужно просто днтп, праймеры и полимеразку вниз загнуть.\" KlenTag стоит использовать для устранения шмера только в том случае, если снижение количества Taq не помогает. \"Загибать\" ещё и дНТФ с праймерами нет ни какого смысла. \"А мегапраймерные методы - вообще полный люэс.\" С этим заболеванием пока не сталкивался. \"Если уж мегапраймерами баловАться, надо не ассимметричный делать, а биотин 5'-концевой.\" Кажется, что-то умное, но не пойму, что именно. Нельзя ли поподробнее? \"И кто мешал продукт отжига с коротких праймеров в Н.У. амплифицировать?\" Знать бы ещё, что такое \"Н.У.\". \"И как это Вы учитывали внематочные А, когда они не в рамке получатся - вообще убей Бог не пойму... \" Первые несколько лет было тяжело, а потом привык. Если помучаетесь столько же, то поймёте. Отвечаю тут последний раз ибо препираться с Вами бессмысленно - а народ, которому работать надо сам поймёт что к чему. 1. ИЗ ЧЕГО это Вы в 75 году гены собирали? Я ведь могу не полениться и сходить к Чурикову и Матвиенко за точными датами, но боюсь, диагноз ЯСЕН И ТАК. 2. Как человек использующий Pfu и Pfu-подобные полимеразы лет десять или больше могу сказать, что Ваши экзерсисы насчёт сжирания праймеров - ерунда. Пять гамм с инверсника 6-8 килобаз геркулазой, например, получается довольно легко. Кроме того, посчитайте КАКОЙ ПРОЦЕНТ у Вас включается праймера 3. Насчёт бессмысленности загбания вниз праймеров и дНТП могу Вам весело сообщить, что в некоторых случаях победа над димерами достигается амплификацией с 5 пикомоль праймеров и <sub>50 микромоль</sub> дНТП. По-видимому Вам сие неизвестно. Вообще на те же любимые инверсники я редко беру больше 10 пикомоль праймеров. На воспетой Вами Pfu, BTW 4. И плохо, что не сравнивали мегапраймеры с теми же инверсниками, например, по эффективности. Или есть ещё одна глупая приблуда - SOE называется. Из той же серии по эффективности. Все эти вещи пройдены на внесении рэндомизированных кусков в ДНК двадцать раз. Опять же без Вашего участия, очевидно 5. Про биотин и ssDNA из PCR-продуктов ведро статей. Кроме того, для ssDNA из PCR есть ещё более эффективная веСЧь - любимая и ненаглядная T7 gene 6 экзо, о которой, и о том, как ей делать ssDNA из PCR-продуктов Вам тоже видимо неизвестно. А ЗРЯ . 6. Натрансфераженная на 3'-конец буква без еЯ удаления вообще-то в собранном гене как-то портит рамку. Нет разве ???? Всё. От сего бессмысленного препирательства я устал. Вы, Генсек, с сего момента находитесь в глубоком игноре. PS. Вот Орм сбежал отсюда, потому как задрали такие вот. Я не сбегу, наверное, но участвовать в подобных "дискуссиях" зарекаюсь нафих... |
genseq Постоянный участник |
Допустим, вам нужно подобрать праймеры для сборки ампликонов, и праймер должен ложиться на последовательность типа agtctgcatgctcgagctgacgatgc. Если выбрать так: agtCTGCATGCTCGAGCTGACGATGC (праймерной последовательности соответствуют прописные буквы), то проблем с выступающей А не будет. Дело в том, что ампликон будет иметь на конце 5' _CTGCATGCTCGAGCTGACGATGC----------- 3' AGACGTACGAGCTCGACTGCTACG----------- Приглядитесь к исходной последовательности и увидите, что у неё 3'-концевому А соответствует комплементарное основание T. Если кого-нибудь интересуют методические подробности, пишите на E-mail или откройте новый топик. |
morigor Кирьят-Арба-Хеврон, Израиль |
[Текст переведён с транслита] |
genseq Постоянный участник |
Автор - <гость>: Дорогой юный комсомолец,Уважаемый Генсек, объясните, пожалуйста, юным комсомольцам, каким образом можно начать праймер \" с буквы, следующей за Т \" ( по алфавиту - это \"У\", что за нуклеотид такой, навороченный? Не пойму никак, чему может помешать довешенный А, кроме тупого лигирования, и как лишняя некомплементарная буква в праймере (Т, по-видимому) избавит Вас от довешивания еще онного А ? дело не в тупом лигировании, а в том, что однонитевая ДНК с А на 3'-конце должна инициировать полимеразную реакцию, и если этот А не ложится на матрицу, то возможны проблемы. Для того, чтобы этого избежать, Т должна быть не в праймере, а на матрице, примыкающей к 5'-концу праймера (см. выше). За фамильярное обзывание оснований буквами прошу прощения. |
the stranger Участник |
Автор - genseq: Ну все равно не понимаю я расклада . На какую матрицу однонитевая ДНК с А, которая должна инициировать полимеразную реакцию, ложиться? По-моему, эта ДНК и есть матрица, на которой отжигаются праймеры, а им глубоко безразлично должны быть все эти А на 3'-конце. Если я не прав, поправьте, сделайте одолжение.
Автор - <гость>: Дорогой юный комсомолец,[b] Уважаемый Генсек, объясните, пожалуйста, юным комсомольцам, каким образом можно начать праймер \" с буквы, следующей за Т \" ( по алфавиту - это \"У\", что за нуклеотид такой, навороченный? Не пойму никак, чему может помешать довешенный А, кроме тупого лигирования, и как лишняя некомплементарная буква в праймере (Т, по-видимому) избавит Вас от довешивания еще онного А ? дело не в тупом лигировании, а в том, что однонитевая ДНК с А на 3'-конце должна инициировать полимеразную реакцию, и если этот А не ложится на матрицу, то возможны проблемы. Для того, чтобы этого избежать, Т должна быть не в праймере, а на матрице, примыкающей к 5'-концу праймера (см. выше). За фамильярное обзывание оснований буквами прошу прощения. [/b] |
the stranger Участник |
|
Veshka Постоянный участник Москва |
|
the stranger Участник |
Автор - Veshka: А почему некооперативно? И как посчитали, что температура где-то 52-54?
Второй праймер будет плавиться сильно некооперативно и считать его вообще дело дурацкое. Основная проблема как раз в том, что программы считают Tm, а нужна температура отжига для амплификации, которая Tm в общем случае не соответствует. Нормальная температура отжига для амплификации второго праймера где-то градуса 52-54. |
genseq Постоянный участник |
"На какую матрицу однонитевая ДНК с А, которая должна инициировать полимеразную реакцию, ложиться? По-моему, эта ДНК и есть матрица, на которой отжигаются праймеры, а им глубоко безразлично должны быть все эти А на 3'-конце." Отнюдь. Проблема концевого А обсуждалась в контексте сборки генов из нескольких ампликонов. Обычно при этом ампликоны стыкуются "внахлёст" и концевой А должен точно ложиться на общую последовательность, т.е. соответствовать Т, лежащей вне ампликона. Возможно, это казуистический случай, не представляющий особого интереса для решаемых Вами проблем. Что касается OLIGO 6, то по этому поводу имею сообщить следующее: в OLIGO 4 Tm обоих праймеров точно сответствуют тому, что даёт Vector NTI. Возможно, использованный Вами "кряк" прокрякал OLIGO6 не слишком аккуратно. |
Павел Постоянный участник Новосибирск |
|
|
|
pApA2017 |
|
dk Постоянный участник Россия |
А вообще что за удовольствие "ручками" считать Tm? Для праймеров важнее шпильки и димеры. Лично мне нравится OligoAnalyzer от idtDNA. А свободное время лучше потратить на чтение полезных книжек. |
watchesbiz Постоянный участник |
|
« Предыдущая тема · Софт · Следующая тема » |