molbiol.ru -> Экспрессия pET28/29

> Все форумы > Тематические форумы > Молекулярная и клеточная биология

Zbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ

Правила FAQ* Поиск* Участники* Календарь* Избранные темы* Форум Форумов*

Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ]

Форум:

* Экспрессия pET28/29 -- не экспрессируется --

Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.

Uri

28.05.2013 07:47

URL #1

Есть вставки в плазмидах pET28/29, а экспресии нет.
Из-за чего такое бывает?
Подбирали разные условия: обороты от 160 до 200, Т от 30 до 37, делали в день и в ночь. На ИФА белок взаимодействует на тройку, но форезе на нужной длине нет того белка.
Трансфомировали на клетках JM103, а экспрессировали на клетках BL21.
Заклонированный фрагмент белка гликопротеина одного вируса

Esya
Постоянный участник
PA, USA

28.05.2013 08:23

URL #2

или редкие кодоны, или токсичность - мембранная фигня?
подбирать штаммы
но нужная длина - понятие расплывчатое, плюс-минус

Uri

28.05.2013 08:32

URL #3

Спасибо,
не понял только про мембранную фигню

Esya
Постоянный участник
PA, USA

28.05.2013 08:40

URL #4

мембранные белки бывают токсичны несколько чаще чем другие

а вестерн делали?

Tuco Ramires
Постоянный участник
Rio Grande

28.05.2013 08:56

URL #5

Я бы разные экспрессионные штаммы попробовал. А было у меня вот такое: http://molbiol.ru/forums/index.php?showtopic=523144&hl=

Uri

28.05.2013 10:12

URL #6

Нет, вестерн не делали

Uri

28.05.2013 12:02

URL #7

2 Tuco Ramires

И как Вы с этим разбирались?

ernesta88
Постоянный участник
москва

28.05.2013 14:08

URL #8

Uri в каких вы условиях выделяете белок? В нативных или с 8М мочевиной? И как анализируете экспрессию? И - какова масса этого фрагмента?

Tom1
Постоянный участник

28.05.2013 14:56

URL #9

"а экспрессировали на клетках BL21." если сие правда, то какую експресиию можно ожидать???
надо брать не BL21 but BL21 (DE3) or Rosetta2 BL21 DE3
как-то туко...

ernesta88
Постоянный участник
москва

28.05.2013 15:51

URL #10

многие люди ДЕ3 просто не дописывают такшто топикстатер может имел дело и с де3 я как-то видела диссер где бл21 де3 именовались как де3(бл21) не опечатка .могут и просто де3 написать чо или просто бл21 так шта...

Guest
IP-штамп: frxbj0K9xj17w
гость

28.05.2013 18:03

URL #11

(Uri @ 28.05.2013 12:02)

2 Tuco Ramires

И как Вы с этим разбирались?

А чего тут разбираться? Проверили экспрессию в нескольких штаммах, выбрали тот, в котором уровень экспрессии нас устраивал, пустили в работу именно эту комбинацию "штамм+конструкция". Собственно, все...

(ernesta88 @ 28.05.2013 15:51)

многие люди ДЕ3 просто не дописывают

Это да, но я в своей работе поостерегся бы иметь дело с такими людьми...

ernesta88
Постоянный участник
москва

28.05.2013 18:24

URL #12

Это да, но я в своей работе поостерегся бы иметь дело с такими людьми...
________
имхо есть куда бОльшие недостатки - про ДЕ3 можно прочитать, а другие недостатки не выбьешь ничем кроме пули в голову))

ваще еще слова о "фрагмент" наводят на мысль, что белок мал - если меньше 5-7 кДа то тяжело эксрпрессировать, надо фьюз так или иначе стартовых данных мало чтоб понять в чем там дело.

Esya
Постоянный участник
PA, USA

28.05.2013 21:17

URL #13

я забыла добавить стандартное напоминание, експрессировать белки в [BL21(DE3)] и его аналогах надо только со свежих чашек, никаких стоков и чашек недельной давности

Поблагодарили (1): R.J. Dio

criplenie
Участник

28.05.2013 21:19

URL #14

(Uri @ 28.05.2013 07:47)

но форезе на нужной длине нет того белка.

А Т7-полимераза видна? Вес около сотни kDa. Штаммы бывает DE3 теряют.

ernesta88
Постоянный участник
москва

29.05.2013 09:32

URL #15

на самделе причин может быть тыща помимо того что это не тот штамм для чего нужно знать следующие стартовые условия:

1) в нативных условиях выделяли или в денатурирующих (может растворимого нет, а в тельцах включения - куча)

2) предполагаемый MW белка (опять же, мелкие белки эксрпессируются плохо)

3) как анализировали экспрессию (иногда нужную полосу можно проглядеть если сравнивать лизаты до и после)

4) на форезе на нужной длине - опять же - элюаты или лизаты?

ну и кстати, раз уж в ИФА есть какая-то реакция, значит какая-то экспрессия идет, белок синтезируется и значит штамм таки(скорей всего) ДЕ3,

R.J. Dio
Постоянный участник

29.05.2013 10:05

URL #16

1) надо посмотреть, есть ли мРНК вообще
2) возможно, неоптимальная структура 5'- конца РНК блокирует последующую трансляцию, иными словами, структура RBS-ген нехороша. Некоторые фирмы, синтезирующие гена de novo, дизайнят не только ген под конкретный организм, но и upstream область. Для вас- перекинуть ген в другой экспрессионный вектор, скажем pQE, может, станет лучше

ernesta88
Постоянный участник
москва

29.05.2013 11:38

URL #17

в 28 и 29 достаточно немаленькие тэги перед полилинкером которые имхо препятствуют образованию препятствующих трансляцию рнковых шпилек, если, конечно, не клонировали по сайту NdeI.

R.J. Dio
Постоянный участник

29.05.2013 11:41

URL #18

шпилька- это всегда контекст, мало ли что там за ген

Uri

29.05.2013 12:18

URL #19

Да на самом деле брали клетки BL21 (DE3), извиняюсь за сленг.
Экспрессировали в 8М мочевине.
ernesta88, в нативных условиях может нужный белок не раствориться?
Масса фрагмента должна быть от 29.8 до 32 кДа в зависимости от рамки с которой начнется считывание после промотора, естественно, что ожидали более длинный белок то есть ~ 32 кДа.
T7 полимераза есть и еще много разных полос.
Экспрессию делали со свежих чашек и стоков.
Паралельно делали экспрессию другого белка, другой конструкции и там на нужной длине была хорошая полоса.
На форезе анализировали и лизаты и элюаты.
Здесь же на нужной длине ничего не видно, видно что-то на 38 кДА и на 20 кДа, а между ними вообще нет бендов. Но при этом в ИФА все отлично взаимодействует и хорошо титруется с 3 до 0.392.
К сожалению нет возможности на Ni-колонке все очистить. Говорят что можно с имидазолом, кто знает эффективно ли это?
2R.J. Dio: это несинтезированный ген, это ген полученный обычным ПЦРом.
Всем большое спасибо!!

R.J. Dio
Постоянный участник

29.05.2013 12:21

URL #20

вы не понимаете, что я говорю! Какая разница, синтезированный ген или полученный ПЦР, или аист принес в капусте. Если начало гена имеет такой сиквенс, что образуется шпиля, или еще что неоптимальное, вот и вас и проблемы с инициализацией трансляции

ernesta88
Постоянный участник
москва

29.05.2013 12:36

URL #21

К сожалению нет возможности на Ni-колонке все очистить. Говорят что можно с имидазолом, кто знает эффективно ли это?
_______
а почему нет возможности очистить? нет агарозы? регулярно чищу имидазолом (20 мМ, 50мМ - промывка, 350 мМ - элюция) (а не градиентом рН) с ни-нта, все ок, так и в руководстве (например погуглите Ni-NTA invitrogen probond написано).

в нативных условиях да, многое и очень часто не растворяется т.к. уходит в тела включения к-е растворяются только мочевиной и др..

можно выделить в денатурирующих условиях (8М мочевина), а потом ренатурировать.

кстати говоря - на 20 кДа, это полоска стандартного контаминанта SlyD, - на 38 - посчитайте, может быть к вашему белку добавилась масса тэгов, которые все равно есть в 28 и 29 - в зависимости от того, по какому сайту вы клонировали

эээ...а что значит экспрессировали в 8М мочевине? то есть чистили в смысле?

и обязательно надо сделать блот, тк только он поможет понять где ваш белок - может это те самые 38
УПД:
по каким сайту вы все ж клонировали?

Tom1
Постоянный участник

29.05.2013 16:51

URL #22

"Экспрессировали в 8М мочевине. "
жескач....
"Но при этом в ИФА все отлично взаимодействует и хорошо титруется с 3 до 0.392. "
антитела на что на таг или на белок????
ставить "ифу" на грубом лизате колеи имха себя не любить...
если даже поверить что имеет быть место спейцифика то какая чуйствительность "ифы"??? то-то....
да исчо кучка центофф...
если сие гликопротеин вполне возможно что он ясен арафат не гликозилируется и в связи с ентим : а) падает в тельца; б) быстренько деградирует в связи не не правильным фолдингом...
" Т от 30 до 37," у сие не есть подбор температур....
если допустить что идет в тельца то имха следует снижать Т до 22, 20, 15 градусофф, один мои кореш добился вразумительного кол-ва однои киназы ( человеческой) при +4...
да и имха снизьте ИПТГ до 0.1мМ помогает...
"К сожалению нет возможности на Ни-колонке все очистить. Говорят что можно с имидазолом, кто знает эффективно ли это?"
исчо одна жесть жестянная...
имха пассажир очень отдаленно представляет что есть хроматография на металл-хелатнои резине...
интересно что он имеет ввиду????
что у него мало сорбента дык там ебкость вполне приличная или сорбента совсем нет???
и интересно если сорбент есть чрм елюировали , нет я знаю что можно и пахом, и хлористым аммонием 9 если нет иммидазола или обьем колонку от литра и выше)
имха короче ( ударение на последнюю быкву) пассажиру матчасть подучить бы в начале...

watchesbiz
Постоянный участник

06.12.2021 17:19

URL #23

http://www.authorstream.com/Replicawatches24/
https://about.me/Replicawatches24
https://moz.com/community/users/17050093
https://trello.com/rolexrelicawatches/activity
https://replicarolexwatches.dreamwidth.org/365.html
https://visual.ly/users/watcheshutuk/portfolio
https://www.viki.com/users/watcheshutuk_549/about
https://www.academia.edu/s/14bdb7d4fe?source=link
https://www.slideshare.net/Nowseore/guide-o...ex-watch-online
https://audiomack.com/rolexrelicawatches
https://soundcloud.com/replicarolexwatches
https://www.bagtheweb.com/u/fakerolexwatches/profile
https://www.flipsnack.com/ReplicawatchesUK/...ca-watches.html
https://www.4shared.com/office/zA4L7Rmzea/G...hase_a_Fak.html?
https://codepen.io/Rolexrelicawatches/full/abBEzaQ

Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.

Имя:

Отправка сообщений использует JavaScript операции. В вашем броузере не
установлено/отключено выполнение JavaScript программ. Используйте Netscape Navigator
или Internet Explorer (не ранее 3 версии); убедитесь, что выполнение JavaScript
программ разрешено в настройках вашего броузера.