molbiol.ru -> ИФА

> Все форумы > Тематические форумы > Молекулярная и клеточная биология

Zbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ

Правила FAQ* Поиск* Участники* Календарь* Избранные темы* Форум Форумов*

Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ]

Форум:

* ИФА -- странные результаты --

Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.

страницы (2): 1 2 >

Gizelle

11.02.2013 11:45

URL #1

Друзья, помогите! Ставлю ИФА твердофазную: сорбирую на плашку антиген, забиваю молоком, вношу сыворотку (развожу в молоке). Титрую с определенным шагом. после - инкубация, отмывка, внесение конъюгата (тоже развожу в молоке) и снова отмывка. после тмб выдерживаю в темноте, короче, по протоколу. Вношу стоп - и тут начинается ужас. лунки, в которых разведение сыворотки было больше - выдают гораздо большие значения ОП, чем самая первая лунка с меньшим разведением сыворотки, хотя должно быть ровно наоборот. в итоге кривая получается не S-образная, а "горкой". уже не знаю, на что грешить. титрую аккуратно. Помогите!

guest: ммм
IP-штамп: frwHRv5zEzGDY
гость

11.02.2013 18:44

URL #2

1) Лунки, которые с высоким разведением и большим сигналом находятся с краю планшета? Если да, то попробуйте их расположить так, что бы они были где-нибудь в середине.

2)А что с сигналом в контрольных лунках, в которых не был антигена, а было только молоко.

Если у вас горбик, то как я понимаю при дальнейшем разведении сигнал все же падает.

Возможно из-за ингибирования продуктом пероксидазной реакции в высоких концентрациях сигнал не накапливается. Возможно что может помочь разбавление коньюгата или уменьшение концентрации субстрата.

vb
Постоянный участник

11.02.2013 19:19

URL #3

а зачем все в молоке разводить? я помню фосфатным и карбонатным буфером обходились с добавлением твина. это че сейчас так модно что ли ?

vtosha
Постоянный участник

11.02.2013 23:37

URL #4

Вот да, молоком вроде при вестерн-блотах забивают... Хотя, может, я чего не знаю.

berm
Участник

12.02.2013 00:00

URL #5

"Возможно из-за ингибирования продуктом пероксидазной реакции в высоких концентрациях сигнал не накапливается. Возможно что может помочь разбавление коньюгата или уменьшение концентрации субстрата." - истинная правда

несколько раз натыкался на подобную ситуацию и борол именно так, разбавлением сыворотки,разбавлением конъюгата, ну еше помог переход с твина на БСА

Azato2000
Постоянный участник

12.02.2013 12:12

URL #6

1. У вас молоко - это разведенный обезжиренный молочный порошок или реально молоко?
2. А можно протокол посмотреть?

Azato2000
Постоянный участник

12.02.2013 13:15

URL #7

(Gizelle @ 11.02.2013 14:45)

Друзья, помогите! Ставлю ИФА твердофазную: сорбирую на плашку антиген, забиваю молоком, вношу сыворотку (развожу в молоке).

а вы отмывку перед внесением сывороток делаете?

Gizelle

12.02.2013 13:19

URL #8

Спасибо! Лунки с наименьшим разведением сывороток действительно находятся на краю планшета. Попробую переставить их в середину - спасибо, это для меня находка!) Что касается сигнала в лунках "пустых", то бишь содержащих только молоко, он слабый, сопоставим с сигналом явно отрицательных сывороток. Планшет забиваю раствором сухого обезжиренного молока, разумеется)) - в TBS или PBS, смотря чего не жалко). С разведением сывороток и конъюгатов я уже отшаманила до этого, когда после добавления стоп-реагента на донышках лунок выпадал черный осадок. Разведение конъюгата реально помогло в этом случае. Однако и с разведенным конъюгатом "горка" осталась.

Gizelle

12.02.2013 13:26

URL #9

(Azato2000 @ 12.02.2013 14:15)

а вы отмывку перед внесением сывороток делаете?

Да, разумеется. В двух словах: вношу раствор антигена в PBS в лунки, инкубирую при +4 ночь. Утром сливаю, и вношу 5% обезжир. молоко (в PBS) - и на час при +37. после все лунки промываю TBS-Tween20, после этого вношу сыворотки, разведенные в 5% молоке, титрую - и на 2 часа при +37. после отмывка, затем вношу конъюгат в молоке опять же, после отмывка, далее ТМБ+субстр. буфер и все, стоп.

Gizelle

12.02.2013 13:28

URL #10

(berm @ 12.02.2013 01:00)

Спасибо

Azato2000
Постоянный участник

12.02.2013 13:48

URL #11

черный осадок это мусор, а сколько раз отмываете и чем (в смысле вручную или на вошере)?

я так понял вы титровку непосредственно в тестовой планшете делаете, а как это технически делается?
допустим во все лунки внесли по 50 мкл дилюента.
потом в лунку А - 50 мкл образца,
перемешали
взяли 50 мкл и перенсли в лунку В
и т.д.

Guest
IP-штамп: frGqyYT8IU7LU
гость

12.02.2013 14:26

URL #12

(Azato2000 @ 12.02.2013 13:48)

Титрую сразу в планшете таким образом: вношу во все лунки 50 мкл 5%молока в TBS-Tween, затем в первую - 25 мкл сыворотки, и титрую шагом 3: отбираю 25 мкл и и вношу в следующую, перемешиваю пипетированием и снова отбираю 25 мкл в следующую и так далее. и плюс 1 ряд лунок просто с молоком. Отмывку делаю вручную многоканальной пипеткой.
Про мусор : откуда он берется? я так понимаю, что это ТМБ выпадает в осадок (мелкие черные точки на дне лунок, особенно они наблюдаются в тех из них, где концентрация сыворотки наибольшая)?

Gizelle

12.02.2013 14:29

URL #13

Да, и отмываю каждую лунку по 4 разаx200 ul TBS-Tween20

guest: ммм
IP-штамп: frwHRv5zEzGDY
гость

12.02.2013 14:31

URL #14

-я так понял вы титровку непосредственно в тестовой планшете делаете, а как это технически делается?
допустим во все лунки внесли по 50 мкл дилюента.
потом в лунку А - 50 мкл образца,
перемешали
взяли 50 мкл и перенсли в лунку В
и т.д.

А вы так делаете???!!!!

-- и вношу 5% обезжир. молоко (в PBS) - и на час при +37. после все лунки промываю TBS-Tween20.

Промывку после забивки можно не делать. Может это даже лучше.

Azato2000
Постоянный участник

12.02.2013 14:58

URL #15

(guest: ммм @ 12.02.2013 17:31)

нет мы титруем в отдельной U-well плашке
просто из описания Gizelle они это делают непосредственно в ИФА плашке
поэтому мне стало любопытно КАК они это делают?

Gizelle

12.02.2013 15:09

URL #16

(guest: ммм @ 12.02.2013 15:31)

Делаю всё так, только тирую шагом 3. т.е. получается 1:3, 1:9, 1:27 и т.д. ...

Gizelle

12.02.2013 15:12

URL #17

(Azato2000 @ 12.02.2013 15:58)

нет мы титруем в отдельной U-well плашке

а потом просто переносите на рабочую плашку?

Azato2000
Постоянный участник

12.02.2013 15:13

URL #18

(Gizelle @ 12.02.2013 18:12)

а потом просто переносите на рабочую плашку?

именно

Gizelle

12.02.2013 15:14

URL #19

(guest: ммм @ 12.02.2013 15:31)

Промывку после забивки можно не делать. Может это даже лучше.

Сейчас прочитала в одной статье, что после забивки молоком промывают PBS, без твина

Gizelle

12.02.2013 15:14

URL #20

(Azato2000 @ 12.02.2013 16:13)

именно

а в чем вы сыворотки разводите?

Azato2000
Постоянный участник

12.02.2013 16:00

URL #21

(Gizelle @ 12.02.2013 18:14)

а в чем вы сыворотки разводите?

Сыворотки и антигены разводим буфером А: PBS 0,01 моль/л, pH 7,4 ± 0,20 с добавлением 0,05% (объем/объем)Tween 20

Если добавить 5% сухого молока получается буфер Б. Его не храним. Каждый день свежий. У вас также?

Azato2000
Постоянный участник

12.02.2013 16:01

URL #22

Мы промываем по 5 раз на вошере после каждой инкубации (кроме последней конечно)

guest: ммм
IP-штамп: frwHRv5zEzGDY
гость

12.02.2013 16:14

URL #23

Нельзя разводить сыворотку в cенсибилизированнам планшете.

Azato2000
Постоянный участник

12.02.2013 16:22

URL #24

(guest: ммм @ 12.02.2013 19:14)

Нельзя разводить сыворотку в сенсебилизированном планшете.

добавлю, что разведение и в несенсибилизированных полистироловых плашках не делается

только полипропиленовых

guest: ммм
IP-штамп: frwHRv5zEzGDY
гость

12.02.2013 16:48

URL #25

ПП вас от неспецифической сорбции не спасет.

Azato2000
Постоянный участник

12.02.2013 16:54

URL #26

(guest: ммм @ 12.02.2013 19:48)

ПП вас от неспецифической сорбции не спасет.

да ладно, а допустим пробирки для разведения из чего делаются?
методике уже сто лет в обед и чего-то полипропиленовые плашки никто не меняет

guest: ммм
IP-штамп: frwHRv5zEzGDY
гость

12.02.2013 17:02

URL #27

Вы на эту проблему не с той стороны смотрите.

Azato2000
Постоянный участник

12.02.2013 17:05

URL #28

(guest: ммм @ 12.02.2013 20:02)

Вы на эту проблему не с той стороны смотрите.

поясните пожалуйста

Gizelle

12.02.2013 17:15

URL #29

(Azato2000 @ 12.02.2013 17:00)

Если добавить 5% сухого молока получается буфер Б. Его не храним. Каждый день свежий. У вас также?

Всё так же=)

guest: ммм
IP-штамп: frwHRv5zEzGDY
гость

12.02.2013 17:18

URL #30

--добавлю, что разведение и в несенсибилизированных полистироловых плашках не делается.

Сорбция на ПС на самом деле не сильно отличается от сорбции на ПП, я даже думаю что на ПС сорбируется чуть хуже. Если вы хотите реально уменьшить сорбцию пластика обработайте его сывороточным альбумином или желатином.

Azato2000
Постоянный участник

12.02.2013 17:48

URL #31

(guest: ммм @ 12.02.2013 20:18)

в первый раз слышу

guest: ммм
IP-штамп: frwHRv5zEzGDY
гость

12.02.2013 18:18

URL #32

Все бывает в первый раз.

птаха
Постоянный участник

12.02.2013 18:37

URL #33

напишите
пжлст

какие ОП у Вас на разных разведениях первых АТ
может надо не с шагом 3 до 27 разводить
а с шагом 10 до 10000?

Gizelle

12.02.2013 18:42

URL #34

(птаха @ 12.02.2013 19:37)

разведения делала в последний раз от 1:9 шагом 3 вплоть до 1:6561. значения ОП= 0.7 (при 1:9) и далее примерно 1.3 (1:27), 1.01 (1:81) и далее плавно по убывающей

Gizelle

12.02.2013 18:45

URL #35

при 1:2187 ОП=0.2 ПРИМЕРНО, в пустой лунке с молоком порядка 0.050

птаха
Постоянный участник

12.02.2013 18:54

URL #36

нормальные у Вас результаты
не гневите бога

Gizelle

12.02.2013 19:08

URL #37

(птаха @ 12.02.2013 19:54)

нормальные у Вас результаты
не гневите бога

да, но... почему пр 1:27 значение ОП почти вдвое выше, чем при 1:9? возможно, дело действительно в расположении образцов на плашке. завтра узнаю)) Спасибо вам всем за помощь!

птаха
Постоянный участник

13.02.2013 04:22

URL #38

не думаю,
что краевой эффект приводил бы к таким "катастрофическим" последствиям.
в любом случае, если будете менять расположение образцов, в качестве контроля обязательно используете прежнее расположение. и очень любопытно было узнать о результатах

мой Вам совет -
поменьше заморачиваясь и титруйте, начиная с 1/100
и
пусть прибудет с вами сила

Gizelle

14.02.2013 14:58

URL #39

Как выяснилось, расположение сывороток на краю планшета тут ни при чем. разница есть, конечно, но совершенно незначительная (сотые доли буквально) и вызвана, скорее всего, иными факторами. Также и предварительная раститровка в ПП плашке до нанесения на основную сильно на результат не влияет - тоже порядка сотых долей ОП, мне для качественного анализа в принципе это не важно, хотя было очень любопытно. Варьировала с титрами, начиная с 1:5 шагом 5 и с 1:10 шагом 10. загиб все равно не исчез. завтра буду пробовать то же, но с изменением концентраций конъюгата.

Gizelle

14.02.2013 15:00

URL #40

Видимо, действительно ингибируется моя пероксидаза продуктом. посмотрим

Сообщение было отредактировано Gizelle - 14.02.2013 15:00

Azato2000
Постоянный участник

14.02.2013 16:18

URL #41

Продукты пероксидазы вода и кислород
Кислород окисляет ТМБ
Накопление продукта пероксидазы в сильно разведенных образцах?
У вас что конкурентный ИФА?

guest: ммм
IP-штамп: frwHRv5zEzGDY
гость

14.02.2013 20:12

URL #42

-Продукты пероксидазы вода и кислород

ЭЭЭЭ! Это не так.

Хм! В слабо разведенных накопления продуктов ингибирующих фермент. А в сильно разведенных ингибирование меньше и сигнал больше.

Gizelle

15.02.2013 10:49

URL #43

(Azato2000 @ 14.02.2013 17:18)

У вас что конкурентный ИФА?

Неконкурентый

Gizelle

15.02.2013 10:53

URL #44

(guest: ммм @ 14.02.2013 21:12)

-Продукты пероксидазы вода и кислород

ЭЭЭЭ! Это не так.

Хм! В слабо разведенных накопления продуктов ингибирующих фермент. А в слабо разведенных ингибирование меньше и сигнал больше.

Вы имели в виду, что в сильно разведенных ингибирование меньше, правильно я поняла?

guest: ммм
IP-штамп: frwHRv5zEzGDY
гость

15.02.2013 12:16

URL #45

Ага!"

Azato2000
Постоянный участник

15.02.2013 15:42

URL #46

(guest: ммм @ 14.02.2013 23:12)

-Продукты пероксидазы вода и кислород

ЭЭЭЭ! Это не так.

честно говоря я не понял.
вода и кислород не являются продуктами пероксидазы?

guest: ммм
IP-штамп: frwHRv5zEzGDY
гость

15.02.2013 17:33

URL #47

--вода и кислород не являются продуктами пероксидазы?
Ага! Это у каталазы так. А пероксидаза без восстановителя никакой кислород не выделяет.

Gizelle

28.02.2013 10:58

URL #48

А как вы думаете, насколько правомерно, так сказать, предварительно разводить сыворотки, например, в 10 раз и дальше все делать по обычному сценарию, а в конце при расчетах использовать некий коэффициент (те же 10) для получения истинных значений? я в вектор-бесте вроде встречала подобный вариант, а кто-нибудь в лабе делал это? подскажите, пожалуйста...

Panaev
Постоянный участник

01.03.2013 04:45

URL #49

Никто не может вам этого запретить

guest: Alex76
IP-штамп: friCJHCWFt1UU
гость

07.03.2013 07:38

URL #50

У меня была похожая ситуация. Попробуйте больше развести антиген на плашке. Для блокировки планшета попробуйте взять БСА фракция 5 0,5-1% в ФБС с твином и сыворотки разводите на этом же растворе. И играйтесь с разведением антигена

Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.

Имя:

Отправка сообщений использует JavaScript операции. В вашем броузере не
установлено/отключено выполнение JavaScript программ. Используйте Netscape Navigator
или Internet Explorer (не ранее 3 версии); убедитесь, что выполнение JavaScript
программ разрешено в настройках вашего броузера.