Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
Gizelle |
|
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость |
2)А что с сигналом в контрольных лунках, в которых не был антигена, а было только молоко. Если у вас горбик, то как я понимаю при дальнейшем разведении сигнал все же падает. Возможно из-за ингибирования продуктом пероксидазной реакции в высоких концентрациях сигнал не накапливается. Возможно что может помочь разбавление коньюгата или уменьшение концентрации субстрата. |
vb Постоянный участник |
|
vtosha Постоянный участник |
|
berm Участник |
несколько раз натыкался на подобную ситуацию и борол именно так, разбавлением сыворотки,разбавлением конъюгата, ну еше помог переход с твина на БСА |
Azato2000 Постоянный участник |
2. А можно протокол посмотреть? |
Azato2000 Постоянный участник |
(Gizelle @ 11.02.2013 14:45) Друзья, помогите! Ставлю ИФА твердофазную: сорбирую на плашку антиген, забиваю молоком, вношу сыворотку (развожу в молоке). а вы отмывку перед внесением сывороток делаете? |
Gizelle |
|
Gizelle |
(Azato2000 @ 12.02.2013 14:15) Да, разумеется. В двух словах: вношу раствор антигена в PBS в лунки, инкубирую при +4 ночь. Утром сливаю, и вношу 5% обезжир. молоко (в PBS) - и на час при +37. после все лунки промываю TBS-Tween20, после этого вношу сыворотки, разведенные в 5% молоке, титрую - и на 2 часа при +37. после отмывка, затем вношу конъюгат в молоке опять же, после отмывка, далее ТМБ+субстр. буфер и все, стоп. |
Gizelle |
(berm @ 12.02.2013 01:00) "Возможно из-за ингибирования продуктом пероксидазной реакции в высоких концентрациях сигнал не накапливается. Возможно что может помочь разбавление коньюгата или уменьшение концентрации субстрата." - истинная правда несколько раз натыкался на подобную ситуацию и борол именно так, разбавлением сыворотки,разбавлением конъюгата, ну еше помог переход с твина на БСА Спасибо |
Azato2000 Постоянный участник |
я так понял вы титровку непосредственно в тестовой планшете делаете, а как это технически делается? допустим во все лунки внесли по 50 мкл дилюента. потом в лунку А - 50 мкл образца, перемешали взяли 50 мкл и перенсли в лунку В и т.д. |
Guest IP-штамп: frGqyYT8IU7LU гость |
(Azato2000 @ 12.02.2013 13:48) черный осадок это мусор, а сколько раз отмываете и чем (в смысле вручную или на вошере)? я так понял вы титровку непосредственно в тестовой планшете делаете, а как это технически делается? допустим во все лунки внесли по 50 мкл дилюента. потом в лунку А - 50 мкл образца, перемешали взяли 50 мкл и перенсли в лунку В и т.д. Титрую сразу в планшете таким образом: вношу во все лунки 50 мкл 5%молока в TBS-Tween, затем в первую - 25 мкл сыворотки, и титрую шагом 3: отбираю 25 мкл и и вношу в следующую, перемешиваю пипетированием и снова отбираю 25 мкл в следующую и так далее. и плюс 1 ряд лунок просто с молоком. Отмывку делаю вручную многоканальной пипеткой. Про мусор : откуда он берется? я так понимаю, что это ТМБ выпадает в осадок (мелкие черные точки на дне лунок, особенно они наблюдаются в тех из них, где концентрация сыворотки наибольшая)? |
Gizelle |
|
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость |
допустим во все лунки внесли по 50 мкл дилюента. потом в лунку А - 50 мкл образца, перемешали взяли 50 мкл и перенсли в лунку В и т.д. А вы так делаете???!!!! -- и вношу 5% обезжир. молоко (в PBS) - и на час при +37. после все лунки промываю TBS-Tween20. Промывку после забивки можно не делать. Может это даже лучше. |
Azato2000 Постоянный участник |
(guest: ммм @ 12.02.2013 17:31) -я так понял вы титровку непосредственно в тестовой планшете делаете, а как это технически делается? допустим во все лунки внесли по 50 мкл дилюента. потом в лунку А - 50 мкл образца, перемешали взяли 50 мкл и перенсли в лунку В и т.д. А вы так делаете???!!!! нет мы титруем в отдельной U-well плашке просто из описания Gizelle они это делают непосредственно в ИФА плашке поэтому мне стало любопытно КАК они это делают? |
Gizelle |
(guest: ммм @ 12.02.2013 15:31) -я так понял вы титровку непосредственно в тестовой планшете делаете, а как это технически делается? допустим во все лунки внесли по 50 мкл дилюента. потом в лунку А - 50 мкл образца, перемешали взяли 50 мкл и перенсли в лунку В и т.д. А вы так делаете???!!!! -- и вношу 5% обезжир. молоко (в PBS) - и на час при +37. после все лунки промываю TBS-Tween20. Промывку после забивки можно не делать. Может это даже лучше. Делаю всё так, только тирую шагом 3. т.е. получается 1:3, 1:9, 1:27 и т.д. ... |
Gizelle |
(Azato2000 @ 12.02.2013 15:58) нет мы титруем в отдельной U-well плашке а потом просто переносите на рабочую плашку? |
Azato2000 Постоянный участник |
(Gizelle @ 12.02.2013 18:12) именно |
Gizelle |
(guest: ммм @ 12.02.2013 15:31) Сейчас прочитала в одной статье, что после забивки молоком промывают PBS, без твина |
Gizelle |
(Azato2000 @ 12.02.2013 16:13) а в чем вы сыворотки разводите? |
Azato2000 Постоянный участник |
(Gizelle @ 12.02.2013 18:14) Сыворотки и антигены разводим буфером А: PBS 0,01 моль/л, pH 7,4 ± 0,20 с добавлением 0,05% (объем/объем)Tween 20 Если добавить 5% сухого молока получается буфер Б. Его не храним. Каждый день свежий. У вас также? |
Azato2000 Постоянный участник |
|
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость |
|
Azato2000 Постоянный участник |
(guest: ммм @ 12.02.2013 19:14) добавлю, что разведение и в несенсибилизированных полистироловых плашках не делается только полипропиленовых |
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость |
|
Azato2000 Постоянный участник |
(guest: ммм @ 12.02.2013 19:48) да ладно, а допустим пробирки для разведения из чего делаются? методике уже сто лет в обед и чего-то полипропиленовые плашки никто не меняет |
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость |
|
Azato2000 Постоянный участник |
(guest: ммм @ 12.02.2013 20:02) поясните пожалуйста |
Gizelle |
(Azato2000 @ 12.02.2013 17:00) Всё так же=) |
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость |
Сорбция на ПС на самом деле не сильно отличается от сорбции на ПП, я даже думаю что на ПС сорбируется чуть хуже. Если вы хотите реально уменьшить сорбцию пластика обработайте его сывороточным альбумином или желатином. |
Azato2000 Постоянный участник |
(guest: ммм @ 12.02.2013 20:18) --добавлю, что разведение и в несенсибилизированных полистироловых плашках не делается. Сорбция на ПС на самом деле не сильно отличается от сорбции на ПП, я даже думаю что на ПС сорбируется чуть хуже. Если вы хотите реально уменьшить сорбцию пластика обработайте его сывороточным альбумином или желатином. в первый раз слышу |
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость |
|
птаха Постоянный участник |
пжлст какие ОП у Вас на разных разведениях первых АТ может надо не с шагом 3 до 27 разводить а с шагом 10 до 10000? |
Gizelle |
(птаха @ 12.02.2013 19:37) напишите пжлст какие ОП у Вас на разных разведениях первых АТ может надо не с шагом 3 до 27 разводить а с шагом 10 до 10000? разведения делала в последний раз от 1:9 шагом 3 вплоть до 1:6561. значения ОП= 0.7 (при 1:9) и далее примерно 1.3 (1:27), 1.01 (1:81) и далее плавно по убывающей |
Gizelle |
|
птаха Постоянный участник |
не гневите бога |
Gizelle |
(птаха @ 12.02.2013 19:54) да, но... почему пр 1:27 значение ОП почти вдвое выше, чем при 1:9? возможно, дело действительно в расположении образцов на плашке. завтра узнаю)) Спасибо вам всем за помощь! |
птаха Постоянный участник |
что краевой эффект приводил бы к таким "катастрофическим" последствиям. в любом случае, если будете менять расположение образцов, в качестве контроля обязательно используете прежнее расположение. и очень любопытно было узнать о результатах мой Вам совет - поменьше заморачиваясь и титруйте, начиная с 1/100 и пусть прибудет с вами сила |
Gizelle |
|
Gizelle |
Сообщение было отредактировано Gizelle - 14.02.2013 15:00 |
Azato2000 Постоянный участник |
Кислород окисляет ТМБ Накопление продукта пероксидазы в сильно разведенных образцах? У вас что конкурентный ИФА? |
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость |
ЭЭЭЭ! Это не так. Хм! В слабо разведенных накопления продуктов ингибирующих фермент. А в сильно разведенных ингибирование меньше и сигнал больше. |
Gizelle |
(Azato2000 @ 14.02.2013 17:18) Неконкурентый |
Gizelle |
(guest: ммм @ 14.02.2013 21:12) -Продукты пероксидазы вода и кислород ЭЭЭЭ! Это не так. Хм! В слабо разведенных накопления продуктов ингибирующих фермент. А в слабо разведенных ингибирование меньше и сигнал больше. Вы имели в виду, что в сильно разведенных ингибирование меньше, правильно я поняла? |
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость |
|
Azato2000 Постоянный участник |
(guest: ммм @ 14.02.2013 23:12) честно говоря я не понял. вода и кислород не являются продуктами пероксидазы? |
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость |
Ага! Это у каталазы так. А пероксидаза без восстановителя никакой кислород не выделяет. |
Gizelle |
|
Panaev Постоянный участник |
|
guest: Alex76 IP-штамп: friCJHCWFt1UU гость |
|
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |