Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
Trouble IP-штамп: fr/eFUcux3Q2c гость |
У нас возникла такая вот проблемка, возможно это и не проблемка вовсе, но меня ставит в тупик, чем сильно огорчает. Еще больше огорчает, что я не понимаю, почему она вообще возникла, казалось бы на пустом месте. В общем дано: - первичные Т-клетки, сепарированные (MACS, не идеально чистая популяция, но да сойдет). - электропорация плазмидой с GFP. - результаты на картинках приведенных ниже. Казалось бы БИНГО - около половины клеток святятся в FL-1 (сорри, что не загейтировано) и можно с чувством полного удовлетворения пойти в паб ан нет. В FL-2 клетки светятся еще лучше. Вопрос - почему? Компенсировать это нам не удается. Более того, при играх в компенсацию даже удается полностью убрать свечение из FL-1 в пользу FL-2. C Jurcat с абсолютно той же плазмидой ничего подобного не было, все светило вполне предсказуемо. Какие есть мысли? Чувствую что это что-то простое, но скудный ум и отсутствие знаний не дают решить головоломку. PS: - гуру flow cytometry не являюсь; - на флуоресцентном микроскопе опять же выглядит так, что в области PE-светит сильнее; - интуитивно чувствую, что светится таки плазмида, но объяснить происходящее не могу. В общем, помогите, плиз, иначе буду думать о суициде. |
erorr |
(Trouble @ 19.11.2018 14:46) Коллеги, добрый день. У нас возникла такая вот проблемка, возможно это и не проблемка вовсе, но меня ставит в тупик, чем сильно огорчает. Еще больше огорчает, что я не понимаю, почему она вообще возникла, казалось бы на пустом месте. В общем дано: - первичные Т-клетки, сепарированные (MACS, не идеально чистая популяция, но да сойдет). - электропорация плазмидой с GFP. - результаты на картинках приведенных ниже. Казалось бы БИНГО - около половины клеток святятся в FL-1 (сорри, что не загейтировано) и можно с чувством полного удовлетворения пойти в паб ан нет. В FL-2 клетки светятся еще лучше. Вопрос - почему? Компенсировать это нам не удается. Более того, при играх в компенсацию даже удается полностью убрать свечение из FL-1 в пользу FL-2. C Jurcat с абсолютно той же плазмидой ничего подобного не было, все светило вполне предсказуемо. Какие есть мысли? Чувствую что это что-то простое, но скудный ум и отсутствие знаний не дают решить головоломку. PS: - гуру flow cytometry не являюсь; - на флуоресцентном микроскопе опять же выглядит так, что в области PE-светит сильнее; - интуитивно чувствую, что светится таки плазмида, но объяснить происходящее не могу. В общем, помогите, плиз, иначе буду думать о суициде. - гуру flow cytometry не являюсь; чиго надо старче |
erorr |
(Trouble @ 19.11.2018 14:46) Коллеги, добрый день. У нас возникла такая вот проблемка, возможно это и не проблемка вовсе, но меня ставит в тупик, чем сильно огорчает. Еще больше огорчает, что я не понимаю, почему она вообще возникла, казалось бы на пустом месте. В общем дано: - первичные Т-клетки, сепарированные (MACS, не идеально чистая популяция, но да сойдет). - электропорация плазмидой с GFP. - результаты на картинках приведенных ниже. Казалось бы БИНГО - около половины клеток святятся в FL-1 (сорри, что не загейтировано) и можно с чувством полного удовлетворения пойти в паб ан нет. В FL-2 клетки светятся еще лучше. Вопрос - почему? Компенсировать это нам не удается. Более того, при играх в компенсацию даже удается полностью убрать свечение из FL-1 в пользу FL-2. C Jurcat с абсолютно той же плазмидой ничего подобного не было, все светило вполне предсказуемо. Какие есть мысли? Чувствую что это что-то простое, но скудный ум и отсутствие знаний не дают решить головоломку. PS: - гуру flow cytometry не являюсь; - на флуоресцентном микроскопе опять же выглядит так, что в области PE-светит сильнее; - интуитивно чувствую, что светится таки плазмида, но объяснить происходящее не могу. В общем, помогите, плиз, иначе буду думать о суициде. факс не берет зеленый билок поставьте узкий светофильтр омеги на 515 |
erorr |
(Trouble @ 19.11.2018 14:46) Коллеги, добрый день. У нас возникла такая вот проблемка, возможно это и не проблемка вовсе, но меня ставит в тупик, чем сильно огорчает. Еще больше огорчает, что я не понимаю, почему она вообще возникла, казалось бы на пустом месте. В общем дано: - первичные Т-клетки, сепарированные (MACS, не идеально чистая популяция, но да сойдет). - электропорация плазмидой с GFP. - результаты на картинках приведенных ниже. Казалось бы БИНГО - около половины клеток святятся в FL-1 (сорри, что не загейтировано) и можно с чувством полного удовлетворения пойти в паб ан нет. В FL-2 клетки светятся еще лучше. Вопрос - почему? Компенсировать это нам не удается. Более того, при играх в компенсацию даже удается полностью убрать свечение из FL-1 в пользу FL-2. C Jurcat с абсолютно той же плазмидой ничего подобного не было, все светило вполне предсказуемо. Какие есть мысли? Чувствую что это что-то простое, но скудный ум и отсутствие знаний не дают решить головоломку. PS: - гуру flow cytometry не являюсь; - на флуоресцентном микроскопе опять же выглядит так, что в области PE-светит сильнее; - интуитивно чувствую, что светится таки плазмида, но объяснить происходящее не могу. В общем, помогите, плиз, иначе буду думать о суициде. электропорация плазмидой с GFP. YGFP |
Леонид В Постоянный участник Квебек |
(Trouble @ 19.11.2018 06:46) Коллеги, добрый день. У нас возникла такая вот проблемка, возможно это и не проблемка вовсе, * В общем, помогите, плиз, иначе буду думать о суициде. не надо суицида, это не проблема. Во-первых GFP имеет очень широкий спектр, а у некоторых модификаций GFP очень-очень широкий. Во-вторых срочно уберите слово компенсация из первоначального сообщения ибо сразу ясно, что Вы слегка недопоняли, что это (термин неприменим при использовании одного флуорохрома, в той же степени в какой невозможно деление на ноль) В-третьих посмотрите на ширину полосы фильтров (подсказка: гипотетический оч. широкий красный фильтр будет давать сигнал больше с FITC, чем очень узкий зеленый) В четвертых, главных и основных, посмотрите на усиление в канале. Подумайте. Приходите с новыми вопросами по результатам раздумий. PS. простите, что не дал прямого ответа, но мне показалось, что Вам интересно понять в чем дело, а не просто подкрутить ручки по подсказке, получить от начальства пятерку в дневник и забыть.
|
Trouble IP-штамп: fr/eFUcux3Q2c гость |
Про компенсацию - каюсь!, слово таки оставлю - пусть будет напоминанием о моей полной дремучести. Картинка для спектров и фильтров для моей ситуации, если я ничего не напутал, выглядит так - как по мне eGFP не сильно отличается от FITC (поправьте если я неправ). По поводу усиления на канале - каюсь опять же - будем снижать напряжение по FL-2 на след. этапе экспериментов. С другой стороны возникает такой вопрос - напряжение в FL-2 в принципе выставлено по контрольным клеткам (электропорированные Т-клетки без плазмиды). Если я буду понижать интенсивность - не привет ли это к тому что "контроль" уйдет сильно влево? Еще раз огромное спасибо за участие!!
|
Леонид В Постоянный участник Квебек |
(Trouble @ 20.11.2018 09:53) это слово из вокабюлера лесотехников. Мы на другом форуме. Так что будем говорить о Вашей похвальной любознательности. (Trouble @ 20.11.2018 09:53) посмотрите на спектр eGFP. Зеленые фотоны есть? А оранжевые? А у FITC? Вот это и объясняет разницу. Хотя и у FITC оранжевых хватает. (Trouble @ 20.11.2018 09:53) будем снижать напряжение по FL-2 на след. этапе экспериментов. С другой стороны возникает такой вопрос - напряжение в FL-2 в принципе выставлено по контрольным клеткам (электропорированные Т-клетки без плазмиды). Если я буду понижать интенсивность - не привет ли это к тому что "контроль" уйдет сильно влево? если закрыть глаза, то монитор не исчезнет (проверьте экспериментально). По этой же причине нет смысла играть в жмурки с каналом FL2. Усиление было мной помянуто как объяснение причин, а не руководство к действию. Не стоит крутить ручки и нажимать на кнопочки если это не требуется. Вы планируете использовать FL2 для какой-нибудь метки? Еже ни, тогда не трогайте его, он Вам не нужен, а сигнал в нём отражает истинное положение вещей: eGFP испускает фотоны зеленые (очень много), и другие (тоже много). Сообщение было отредактировано Леонид В - 20.11.2018 19:16
|
Дядя ФАКСер moderator Nothern Maccaronia, Ticinum |
|
Дядя ФАКСер moderator Nothern Maccaronia, Ticinum |
|
Дядя ФАКСер moderator Nothern Maccaronia, Ticinum |
(erorr @ 19.11.2018 16:20) |
Дядя ФАКСер moderator Nothern Maccaronia, Ticinum |
(Trouble @ 20.11.2018 15:53) Картинка для спектров и фильтров для моей ситуации, если я ничего не напутал, выглядит так - как по мне eGFP не сильно отличается от FITC (поправьте если я неправ). Какой у вас прибор? |
Trouble IP-штамп: fr/eFUcux3Q2c гость |
Вы планируете использовать FL2 для какой-нибудь метки? В том то и дело, что очень рассчитывали на этот канал в будущей работе. Вольтаж на PE- канале слишком высокий, а на FITC/GFP - слишком низкий. Вот и "превратился" GFP в semi- RFP Хорошое и простое объяснение - спасибо Дядя ФАКСер и Леонид В! Что меня продолжает смущать - так это другая картина с морфологически сходными клетками линии Jurcat - прикрепляю картинку, полученную фактически на тех же настройках. Jurcat в свое время электропорировали той же плазмидой - сейчас это постоянная экспрессия. "Паттерн" экспрессии в FL-2 канале совершенно другой на мой взгляд - более ожидаемый что ли. fcs скиньте сюда- гляну Какой у вас прибор? FACS Aria |
Леонид В Постоянный участник Квебек |
(Trouble @ 21.11.2018 09:04) Хорошо, тогда посмотрите на Вашу компенсацию. Что нужно компенсировать, чтобы “освободить“ канал? Зеленое убирать в оранжевом или оранжевое в зеленом? Посмотрите на график FL1/FL2 с Jurkat (так называемый “до компенсации“) Вас не смущает, что GFP+ клетки странным образом загибаются в область сильно отрицательных значений FL2? A на аналогичном графике с лимфоцитами оный феномен отсутствует. Нет ли какого-либо случайного математического насилия над данными с Jurkat? Еже ни — дайте знать, будем думать. |
Trouble IP-штамп: fr/eFUcux3Q2c гость |
осмотрите на график FL1/FL2 с Jurkat (так называемый “до компенсации“) Вас не смущает, что GFP+ клетки странным образом загибаются в область сильно отрицательных значений FL2? A на аналогичном графике с лимфоцитами оный феномен отсутствует. Нет ли какого-либо случайного математического насилия над данными с Jurkat? Еже ни — дайте знать, будем думать. Да, Вы правы - таки есть по-видимому определенное насилие. Наш специалист по проточной цитометрии также говорит, что все таки не правильно сравнивать эти результаты. В следующий раз как будем электропорировать лимфоциты, сделаем контроль с Jurcat, все в одинаковых условиях - результаты я обязательно выложу в этой ветке. Спасибо! |
Леонид В Постоянный участник Квебек |
(Trouble @ 22.11.2018 05:32) А! так у Вас есть специалист ... т.е. Вы не сами ручки крутите. ОК, тогда либо пусть он пишет сюда, либо скажите ему прямым текстом, без туманных педагогических намеков для студентов-аспирантов, что компенсация канала FL1 это FL1 - %FL2, а не наоборот. А в случае с Jurkat еще и была гиперкомпенсация FL2, иначе объяснить GFP позитивные в негативе по FL2 крайне затруднительно. Сообщение было отредактировано Леонид В - 23.11.2018 00:12
|
Дядя ФАКСер moderator Nothern Maccaronia, Ticinum |
(Trouble @ 22.11.2018 11:32) Что за специалист? P.S. Глянул файлы- вольтаж на PE задран, вестимо. Забывают люди,что правило "больше длина волны- выше вольтаж" работает лишь для меток со сходным квантовым выходом. А в случае "традиционки" на паре FITC/GFP vs PE - нет (ибо у PE оный- около 0.95, а у "зеленки"- менее 0.5) |
Дядя ФАКСер moderator Nothern Maccaronia, Ticinum |
|
Trouble IP-штамп: fr/eFUcux3Q2c гость |
А! так у Вас есть специалист ... т.е. Вы не сами ручки крутите. ОК, тогда либо пусть он пишет сюда, либо скажите ему прямым текстом, без туманных педагогических намеков для студентов-аспирантов, что компенсация канала FL1 это FL1 - %FL2, а не наоборот. А в случае с Jurkat еще и была гиперкомпенсация FL2, иначе объяснить GFP позитивные в негативе по FL2 крайне затруднительно. Леонид, еще раз спасибо за Ваше участие. Я попрошу ее зарегистрироваться и самолично участвовать в дискуссиях. Также спасибо, что успокоили, лично для меня было принципиально важно знать, что с электропорацией клеток все в порядке - значит, можно идти дальше. Что за специалист? Не уверен, что ты лично ее знаешь Денис. Молодой специалист, хороший)). Кстати, Арию то юзаете наконец "по прямому назначению", или все так же, как и в прежние годы- как анализатор ("ибо сортинг настроить мы не умеем"(с))? Пока скорее второе, чем первое. Но до конца года, надеюсь будут выраженные изменения в сторону первого. Влад.
|
Дядя ФАКСер moderator Nothern Maccaronia, Ticinum |
(Trouble @ 23.11.2018 09:26) Пока скорее второе, чем первое. Но до конца года, надеюсь будут выраженные изменения в сторону первого. Влад. Если это та Ария, о которой я думаю...За 10 лет - ни одного сортинга? |
Леонид В Постоянный участник Квебек |
(Trouble @ 23.11.2018 03:26) не стоит насиловать молодого хорошего специалиста. Если у нея нет желания, то значит так тому и быть. |
Дядя ФАКСер moderator Nothern Maccaronia, Ticinum |
|
Леонид В Постоянный участник Квебек |
(Дядя ФАКСер @ 23.11.2018 04:39) зато молодой специалист чувствует себя при деле. Почти час раскочегаривать (а если прокладку на сопелко руками накладывать, то еще и больше), чтобы потом анализировать вдумчиво. Одна только процедура смены пробирки напоминает инаугурацию на пост президента. Это Вам не CYTOFLEX: включил и понеслась ... а если с плашкой, так и вообще включил и ушел ...
|
Дядя ФАКСер moderator Nothern Maccaronia, Ticinum |
(Леонид В @ 25.11.2018 05:00) Дык, анализировать надо на анализаторе. А сортер- он токмо для сортинга. |
caroline123 |
|
« Предыдущая тема · Клеточные технологии · Следующая тема » |