Коллеги, добрый день.

У нас возникла такая вот проблемка, возможно это и не проблемка вовсе, но меня ставит в тупик, чем сильно огорчает. Еще больше огорчает, что я не понимаю, почему она вообще возникла, казалось бы на пустом месте. 

В общем дано:
- первичные Т-клетки, сепарированные (MACS, не идеально чистая популяция, но да сойдет).
- электропорация плазмидой с GFP.
- результаты на картинках приведенных ниже.

https://yadi.sk/i/yarM1RDWFhRIIA

Казалось бы БИНГО - около половины клеток святятся в FL-1 (сорри, что не загейтировано) и можно с чувством полного удовлетворения пойти в паб ан нет.

В FL-2 клетки светятся еще лучше. Вопрос - почему? Компенсировать это нам не удается. Более того, при играх в компенсацию даже удается полностью убрать свечение из FL-1 в пользу FL-2. 

C Jurcat с абсолютно той же плазмидой ничего подобного не было, все светило вполне предсказуемо. 

Какие есть мысли? Чувствую что это что-то простое, но скудный ум и отсутствие знаний не дают решить головоломку.

PS:
- гуру flow cytometry не являюсь;
- на флуоресцентном микроскопе опять же выглядит так, что в области PE-светит сильнее;
- интуитивно чувствую, что светится таки плазмида, но объяснить происходящее не могу. 

В общем, помогите, плиз, иначе буду думать о суициде.

  Коллеги, добрый день.

У нас возникла такая вот проблемка, возможно это и не проблемка вовсе, но меня ставит в тупик, чем сильно огорчает. Еще больше огорчает, что я не понимаю, почему она вообще возникла, казалось бы на пустом месте. 

В общем дано:
- первичные Т-клетки, сепарированные (MACS, не идеально чистая популяция, но да сойдет).
- электропорация плазмидой с GFP.
- результаты на картинках приведенных ниже.

https://yadi.sk/i/yarM1RDWFhRIIA

Казалось бы БИНГО - около половины клеток святятся в FL-1 (сорри, что не загейтировано) и можно с чувством полного удовлетворения пойти в паб ан нет.

В FL-2 клетки светятся еще лучше. Вопрос - почему? Компенсировать это нам не удается. Более того, при играх в компенсацию даже удается полностью убрать свечение из FL-1 в пользу FL-2. 

C Jurcat с абсолютно той же плазмидой ничего подобного не было, все светило вполне предсказуемо. 

Какие есть мысли? Чувствую что это что-то простое, но скудный ум и отсутствие знаний не дают решить головоломку.

PS:
- гуру flow cytometry не являюсь;
- на флуоресцентном микроскопе опять же выглядит так, что в области PE-светит сильнее;
- интуитивно чувствую, что светится таки плазмида, но объяснить происходящее не могу. 

В общем, помогите, плиз, иначе буду думать о суициде.

  Коллеги, добрый день.

У нас возникла такая вот проблемка, возможно это и не проблемка вовсе, но меня ставит в тупик, чем сильно огорчает. Еще больше огорчает, что я не понимаю, почему она вообще возникла, казалось бы на пустом месте. 

В общем дано:
- первичные Т-клетки, сепарированные (MACS, не идеально чистая популяция, но да сойдет).
- электропорация плазмидой с GFP.
- результаты на картинках приведенных ниже.

https://yadi.sk/i/yarM1RDWFhRIIA

Казалось бы БИНГО - около половины клеток святятся в FL-1 (сорри, что не загейтировано) и можно с чувством полного удовлетворения пойти в паб ан нет.

В FL-2 клетки светятся еще лучше. Вопрос - почему? Компенсировать это нам не удается. Более того, при играх в компенсацию даже удается полностью убрать свечение из FL-1 в пользу FL-2. 

C Jurcat с абсолютно той же плазмидой ничего подобного не было, все светило вполне предсказуемо. 

Какие есть мысли? Чувствую что это что-то простое, но скудный ум и отсутствие знаний не дают решить головоломку.

PS:
- гуру flow cytometry не являюсь;
- на флуоресцентном микроскопе опять же выглядит так, что в области PE-светит сильнее;
- интуитивно чувствую, что светится таки плазмида, но объяснить происходящее не могу. 

В общем, помогите, плиз, иначе буду думать о суициде.

  Коллеги, добрый день.

У нас возникла такая вот проблемка, возможно это и не проблемка вовсе, *
В общем, помогите, плиз, иначе буду думать о суициде.

  дремучести.

 eGFP не сильно отличается от FITC (поправьте если я неправ). 

   будем снижать напряжение по FL-2 на след. этапе экспериментов. С другой стороны возникает такой вопрос - напряжение в FL-2 в принципе выставлено по контрольным клеткам (электропорированные Т-клетки без плазмиды). Если я буду понижать интенсивность - не привет ли это к тому что "контроль" уйдет сильно влево?

  факс не берет зеленый билок поставьте узкий светофильтр омеги на 515

  

Картинка для спектров и фильтров для моей ситуации, если я ничего не напутал, выглядит так - как по мне eGFP не сильно отличается от FITC (поправьте если я неправ). 

https://yadi.sk/i/MHyBSo6UTA9S_w

Вы планируете использовать FL2 для какой-нибудь метки?

Вольтаж на PE- канале слишком высокий, а на FITC/GFP - слишком низкий. Вот и "превратился" GFP в semi- RFP

fcs скиньте сюда- гляну

Какой у вас прибор?

 
В том то и дело, что очень рассчитывали на этот канал в будущей работе.

осмотрите на график FL1/FL2 с Jurkat (так называемый “до компенсации“) Вас не смущает, что GFP+ клетки странным образом загибаются в область сильно отрицательных значений FL2? A на аналогичном графике с лимфоцитами оный феномен отсутствует. Нет ли какого-либо случайного математического насилия над данными с Jurkat? Еже ни — дайте знать, будем думать.

   Наш специалист по проточной

  Наш специалист по проточной цитометрии

А! так у Вас есть специалист ... т.е. Вы не сами ручки крутите.

ОК, тогда либо пусть он пишет сюда, либо скажите ему прямым текстом, без туманных педагогических намеков для студентов-аспирантов, что компенсация канала FL1 это FL1 - %FL2, а не наоборот.

А в случае с Jurkat еще и была гиперкомпенсация FL2, иначе объяснить GFP позитивные в негативе по FL2 крайне затруднительно.

Что за специалист?

Кстати, Арию то юзаете наконец "по прямому назначению", или все так же, как и в прежние годы- как анализатор ("ибо сортинг настроить мы не умеем"(с))?

  
Пока скорее второе, чем первое. Но до конца года, надеюсь будут выраженные изменения в сторону первого.

Влад.

  Я попрошу ее зарегистрироваться и самолично участвовать

  Если это та Ария, о которой я думаю...За 10 лет - ни одного сортинга? 

 
Это Вам не CYTOFLEX: включил и понеслась ... а если с плашкой, так и вообще включил и ушел ...