Rambler's Top100
Лёгкая версия форума* Виртуальная клавиатура  English  
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы
Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Междисциплинарный биологический онлайн-журналZbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ


Темы за 24 часа  [ Вход* | Регистрация* ]  
   



Форум: 
 

Щёлкните, чтобы внести в Избранные Темы* Определение вирулентности Candida albicans in vivo, на мышах. -- Может у кого-то есть опыт? --
ИнтерЛабСервис - передовые технологии молекулярной диагностики
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.


 
Добавить сообщение в темуСоздать новую темуСоздать голосование
Участник оффлайн! Mac-1
Постоянный участник
оттуда



 прочитанное сообщение 07.07.2006 23:40     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #1 множественное цитирование

По одному из грантов я сейчас занимаюсь исследованием взаимодействия лейкоцитов с C.albicans. Мы индентифицировали и выделили грибковый белок, который узнается макрофагами и нейтрофилами, сделали нокаутные грибки и "рескъюэд", провели уже все необходимые эксперименты in vitro. Сейчас переходим к экспериментам на мышах - нужно будет сравнить вирулентность нормальных и нокаутных грибков на нормальных и нокаутных мышах.
Когда я их ранее планировал - то представлял себе дизайн эксперименов так: я вызываю у мышей инвазивный кандидоз, а затем просто считаю дохлых мышей (системный кандидоз даже при интенсивном лечении имеет ~80% летальность). Но сейчас нам запретили "death as endpoint", и мне разрешили эксперименты с мышами только при условии, что я буду их "сакрафис при первых признаках дистресса". Т.е. мне придется мышей препарировать и, вероятно, определять количество грибковых клеток в крови и органах, возможно и степень разрушения внутренних органов (селезенка, сердце, печень - так это описано в литературе, причем в разных статьях, обращают внимание на заное...). А я в гистологической технике новичок - с клетками работал много, а вот органы никогда не препарировал, сейчас вот впервые буду.
Статей по этому поводу немало, я их читаю, но я все же хотел бы спросить (в самой общей форме), может кто-то здесь имеет опыт сходных работ по определению вирулентности микроорганизмов, не обязательно кандиды? Что мне делать, с чего лучше мне начать и как, может быть мне все эти методы будут не нужны? Нужно ли мне красить эту кандиду в тканях (есть поликлоны), или просто под микроскопом клетки считать итп...
Грубо говоря, когда принесут убиенного мыша с чего мне лучше начинать?
Участник оффлайн! Griva
Постоянный участник
Philadelphia, PA, USA



 прочитанное сообщение 08.07.2006 15:33     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #2 множественное цитирование

я небольшой специалсит по кандиде и вообще не микробиолог, но вот что можно посоветовать.


сама вирулентность in vitro уже определена на клетках-мишенях?

1) сравнить высеваемость кандиды wt и KO из крови и какого нибудь органа. На день 1, 5, 10....после инфекции. На начальные дни это будет в основном вирулентность, на поледующие- реакция иммунной системы. инфицировать мышей двумя разными дозами. например той, которая как LD50 для wt мыши и еще одной- на порядок меньше

2)сакрафис при первых признаках дистресса". - это жестко. Нельзя ли хотя бы rough coat и slow movement не считать за сильный дистресс. Я бы взвешивал мышей каждый день и тех кто теряет 20% веса забивал бы и обьявлял умершими в день взвешивания (это довольно надежный показатель). Так можно имитировать death as an endpoint эксперименты.

Я бы не стал красить в тканях кандиду как основной метод определения ее количества, это не количественно. Я бы сделал высевы, а если будет эффект, то подобрал бы потом подходящие под этот эффект гистологические картинки, протсо была бы в статье лишняя красивая иллюстративная картинка. но делать важный вывод только на основе окрашивания грибы в органах я бы не стал.

еще люди делают гриб или бактерию с люциферазой и потом меряют гомогенат органа на люминометре, вместо того чтобы высевы делать. Это гораздо быстрее, так как не надо выращивать и подходит например для БЦЖ и туберкулеза, подойдет наверное и для кандиды.

органы из мышей для патологии я бы фиксировал и.или морозил. опять же если есть эфект на высевах и смертности, то потом можно подтянуть гистологию в качестве дополнительного иллюстративного материала.

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): Mac-1
Участник оффлайн! Tom1
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 08.07.2006 17:10     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #3 множественное цитирование

1. Юниор гриб в кроли это нонсенс.....
2. Макномер раз не ожидал в пубмеде вагон статей по тестированию гриба в модельном организме......
3. Насколько я помню для тстирования грiба использую печень, но чаще почки.....

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): Mac-1
Участник оффлайн! Mac-1
Постоянный участник
оттуда



 прочитанное сообщение 08.07.2006 18:47     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #4 множественное цитирование

Грива,
Большое спасибо за советы! О "первых признаках дистресса" сказано в новых правилах. В утвержденном протоколе (коего я должен придерживатся - будут проверять) мы разработали модную сейчас "балльную систему": за взъерошеную шерсть - столько то баллов, за "хенчед посче" - столько очков, за "закаченные глаза" - очки, за "ограничение подвижности" - очки, потеря веса - очки итд. Когда мыша наберет определенную сумму баллов (15) - ее будут эвтаназировать. Признаки дистресса оценивать в очках мне помог мой технолоджист - она очень опытная в работе с мышами (живыми), но с Кандидой работать будет впервые тоже. Она же и будет следить за мышами 2-3 раза в день (комиссия потребовала).
Собственно, по клеткам-мишеням мы вирулентность не определяли, т.к. тут чуть другие задачи - мы же изучаем влияние этого белка на иммунную защиту. Зато я определял кандидацидную активность нейтрофилов и макрофагов ин витро, а также фагоцитоз кандиды.
При системном заражении (попадании в кровь), дрожжевая форма кандиды прикрепляется к внутренним органам и переходит в мицелиальную форму, образовавшиеся гифен и псевдогифен прорастают в эти органы и разрушают их. Этот белок, что мы нашли, он очень интересный - он существует в двух формах: как нормальный белок клеточной стенки он участвует в образование гифен, и нокаутные штаммы грибка прорастают в органы хозяина значительно медленнее. Кроме того, он участвует и в начальном прикреплении дрожжевой формы к органам хозяина ("адгезивный белок"), а также возможно участвует в питании грибка. Этот белок также в большом количестве секретрируется грибком в окружающую среду, и, очевидно, служит "растворимой приманкой" (soluble docoy, по принципу "Протеина А" у Стафиллококус ауреус) - он конкурирует с "грибковосвязанной формой" этого белка за лейкоцитарные рецепторы, а также вызывает у лейкоцитов хемокинетическую реакцию - т.е. дает им сигнал для "детачмента", мешает адгезировать к грибкам и фагоцитировать их. Очень интересный пример борьбы паразита с защитой хозяина. Т.е. с одной стороны, его вырубание значительно уменьшает общий вред, который причиняет этот грибок, и следовательно уменьшает вирулентность. А с другой стороны, поскольку он - главная и чуть ли не единственная прямая мишень для системы клеточного иммунитета - вырубание его может сделать грибок сверхвирулентным, т.к. организм не в состоянии с ним боротся особенно на ранних стадиях инфекции. Ин витро макрофаги совершенно не узнают такой нокаутный грибок и не фагоцитируют его, а нейтрофилы не убивают его, т.к. они не инициируют в них "оксидативный бурст" (проверял все это. Есть и многие другие любопытные эффекты у этого белка, в т.ч. и потенциально "терапевтические" - но ин витро). Вот все это я и хочу выяснить.
Мне кажется, вы мне дали очень хорошую идею о высевании крови на 2,5..н день, попробую проверить, когда буду отрабатывать метод. А можно пробовать посчитать самих грибков в крови? Открутить, и на гемацитометр? В некоторых статьях вирулентность выражали, как число грибков в крови и в отдельных органах.
Прокрашивание я думал использовать для оценки степени прорастания гифен внутрь органов. Значит вы не советуете с этим возится?
С лициферазой сейчас очень не хочется возится, кроме того, боюсь мне потом придется доказывать рецензентам, что люцифераза не влияет на вирулентность... Однако, буду это иметь в виду, если другое не поможет, а также при реньювэл гранта на будующее. smile.gif
Эвтаназия при потере 20% веса предусмотрена протоколом, это сразу дает 15 "баллов", а мыши и будут "сакрафис" при достижении 15 баллов в любом наборе (10% потеря веса - 12 баллов).
Наверное, это будет мне очень удобно - морозить органы на патологию на "потом", и "если понадобится" - я уже упоминал, что в гистологии я - новичек. Как мне лучше это делать - морозить непрепарированнные органы целиком, или сделать все же сначала срезы и препараты с них, а уже потом морозить? И как вы посоветуете фиксировать? Может еще что-нибудь посоветуете?
И еще раз - большое спасибо!

Том1
1) Извините, я не понял вашей первой фразы... frown.gif
2) Об этом (наличии большого числа публикаций) я уже упоминал выше. В том-то у меня и сложность - наличие слишком большой литературы: они используют слишком разные и многочисленные подходы и критерии, а я из-за недостатка опыта (в том числе и в самой кандиде: я - "leukocyte-guy", а не "Candida-guy") я не знаю, какой подход для меня будет оптимальным, или хотя бы близким к такому. Очень не хочется завязнуть с этим надолго, разве что я себе найму на это постдока...
3) Вы имеете в виду - на изолированных органах? Если ин виво, то чаще всего (где-то в 40% публикаций) исследуют в первую очередь селезенку и сердце (может наиболее наглядно или легче?).
Спасибо!
Участник оффлайн! vb
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 08.07.2006 19:23     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #5 множественное цитирование

какие однако проблемы у людей...
а этот запрет тотальный? или это только в вашем учреждении? так чистый интерес.
Участник оффлайн! Mac-1
Постоянный участник
оттуда



 прочитанное сообщение 08.07.2006 19:37     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #6 множественное цитирование

Похоже - тотальный, по крайней мере по Штатам... frown.gif
Года 3 назад я еще мог (но с ОГРОМНЫМИ сложностями, доказывая, что не удалось гибридомы свои к реактору адаптировать плюс Биг Босс своим авторитетом помог) заказать асциты, а в прошлом году уже все: адаптируются-не адаптируются - в любом случае только реактор... Асциты делать "жестоко и негуманно"...
У нас, кстати, в департаменте был большой скандал месяц назад: один "русский" ПИ опубликовал "мышиную" статью и кто-то (скорее всего, из своих же, "русских) стукнул в анимал фасилити, что часть данных там получена с отклонением от утвержденного протокола. Была комиссия, протоколы опечатали и проверяли, ничего не нашли, но кровушки ей (ПИ) попили столько... frown.gif
Участник оффлайн! Griva
Постоянный участник
Philadelphia, PA, USA



 прочитанное сообщение 09.07.2006 05:55     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #7 множественное цитирование

Tom1- отнюдь. в первые часы-день от инфекции если действительно хромает у штамма вирулентность- можно наблюсти разницу. так делали и сгрибами и бактериями. понятно, что на день 10 надо в печени смотреть, а не в крови


[quote=Mac-1,08.07.2006 16:47]Ссылка на исходное сообщение  Грива,
Большое спасибо за советы! О "первых признаках дистресса" сказано в новых правилах. В утвержденном протоколе (коего я должен придерживатся - будут проверять) мы разработали модную сейчас "балльную систему": за

ОК. я просто говорил что если теряется 15-20% веса, то в этот момент мышь у же можно убить и внести в кривую смертности (и получить такую картинку), таким образом формально например во Франции обходят death endpoint.




>Собственно, по клеткам-мишеням мы вирулентность не определяли, т.к. тут >чуть другие задачи - мы же изучаем влияние этого белка на иммунную защиту.

ясно, Вы просто сказали про вируленность и я сразу подумал про то как активно фагоцитируется и выживает кандида.





>его может сделать грибок сверхвирулентным, т.к. организм не в состоянии с >ним боротся особенно на ранних стадиях инфекции. Ин витро макрофаги совершенно не узнают такой нокаутный грибок и не фагоцитируют его, а нейтрофилы не убивают его, т.к. они не инициируют в них "оксидативный бурст" (проверял все это. Есть и многие другие любопытные эффекты у этого белка, в т.ч. и потенциально "терапевтические" - но ин витро). Вот все это я и хочу выяснить.


то есть с одной стороны поначалу медленней растет, а с другой- не узнается макрофагами? это интересно. а белок в итоге не лиганд для Толлов, маннозного рецептора или еще чего патогенспецифического?




>Мне кажется, вы мне дали очень хорошую идею о высевании крови на 2,5..н >день, попробую проверить, когда буду отрабатывать метод. А можно

через несколько дней в крови может быть уже мало, в органы прорастет. может лучше в органах?

>пробовать посчитать самих грибков в крови? Открутить, и на гемацитометр? В некоторых статьях вирулентность выражали, как число грибков в крови и в отдельных органах.

да, но там наверняка не под миксроскопом считали, я сеяли и считали сколько колоний вырастет из 1 мл крови или гомогентата органа? мне кажется высев количественней


>Прокрашивание я думал использовать для оценки степени прорастания гифен внутрь органов. Значит вы не советуете с этим возится?

я не советую делать это вместо посевов и на основании одного лишь прокрашивания органов делать вывод.

>>Наверное, это будет мне очень удобно - морозить органы на патологию на "потом", и "если понадобится" - я уже упоминал, что в гистологии я - новичек. Как мне лучше это делать - морозить непрепарированнные органы целиком, или сделать все же сначала срезы и препараты с них, а уже потом морозить? И как вы посоветуете фиксировать? Может еще что-нибудь посоветуете?

половина органа в 10% формалин- пойдет на гематоксилин, акике нибудь антителтные окрашивания, TUNEL и какие нибудь гриб-специфичные окрашивания. хранить в формалине или в виде парафинового блока.

вторую половину органа заморозить в ОСТ compound для криосрезов и так хранить. тут можно будет антителами иммунные клетки красить, так как не все антитела на формалине работают. Я обычно храню ввиде блоков. потом режу и сразу крашу. Но можно нарезать слайды, зафиксировать холодным ацетоном , air dry изаморозить на -70 до окрашивания. Ничем другим кроме ацетона я лично сам не фиксировал, хотя знаю что люди пользуют спирт и параформальгегид тоже....

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): Mac-1
Участник оффлайн! Mac-1
Постоянный участник
оттуда



 прочитанное сообщение 09.07.2006 20:42     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #8 множественное цитирование

Грива,
ПОнял о чем говорил Том! В первые часы после инфекции высев крови наверняка даст значительное число колоний - системмный кандидоз в подавляющем большинстве случаев вызывают введением 5 х 10е4 - 10е5 бластоконидий кандиды в хвостовую артерию.

ОК. я просто говорил что если теряется 15-20% веса, то в этот момент мышь у же можно убить и внести в кривую смертности (и получить такую картинку), таким образом формально например во Франции обходят death endpoint.


Вы не только это сказали - вы еще и описали именно ту "бальную систему", которую мне рекомендовал использовать ветеринар, который консультировал мой животный протокол. smile.gif И я попробую тоже так обойти этот запрет: может "суммарные баллы" и дадут достаточную информацию.

то есть с одной стороны поначалу медленней растет, а с другой- не узнается макрофагами? это интересно. а белок в итоге не лиганд для Толлов, маннозного рецептора или еще чего патогенспецифического?


НО-грибок хуже адгезирует к органам и медленнее вростает в них. Лейкоциты узнают кандиду единственным рецептором: "Первым антигеном макрофагов" - Мас-1 smile.gif (CR3, alfaMbeta2, CD11b/CD18). Этот же рецептор узнает также и бактериальные липопротеины (не только гликопротеины грибков). альфаМ субьединица действительно имеет лектиновый домен и участвует в связывании кандиды (блокируется маннозой), но в узнавании также участвует и алфаМ-I-domain и бета2 I-like domain. Это - все уже опубликованно. А бета2 субьединица взаимодействует с эндоцитозным рецептором LRP. А вот очень похожий p150,95 (alfaXbeta2, CD11c/CD18), по-видимому, не участвует в этом (но еще провериять буду на мышах).

через несколько дней в крови может быть уже мало, в органы прорастет. может лучше в органах?


Количество мышей по этому протоколу у меня очень ограничено, всего где-то под 300 frown.gif, я думал их умерщвлять только к 15 баллам... Обычно они (WT + WT) помирают на 15-20 день, на 30-м они все будут "сакрафис". Будет ли оправдано их препарирование на более ранних стадиях, для получения органов? Кровь ведь можно на анализ отбирать и без умерщвления мыша...

да, но там наверняка не под миксроскопом считали, я сеяли и считали сколько колоний вырастет из 1 мл крови или гомогентата органа? мне кажется высев количественней


Не под микроскопом... Это моя сырая идея: взять кровь, лизировать все мышиные клетки, добавить вайолет блю и считать с гемацитометром... В таком духе я определял кандидацид и фагоцитоз ин витро в системе с очищенными нейтрофилами и макрогафами. Думаете ин виво не сработает?

Значит вы советуете мне остановится в первую очередь на высевах в агарозные чашки, и использовать это, как главный инструмент, а гистологию привлекать в основном для иллюстраций?
Участник оффлайн! Griva
Постоянный участник
Philadelphia, PA, USA



 прочитанное сообщение 13.07.2006 02:14     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #9 множественное цитирование

[quote=Mac-1,09.07.2006 18:42]Ссылка на исходное сообщение  
Количество мышей по этому протоколу у меня очень ограничено, всего где-то под 300 frown.gif, я думал их умерщвлять только к 15 баллам... Обычно они (WT +

обратите внимание на то, что если мыши двух разных групп будут при смерти или очень плохи (типа Ваших 15 баллов), то может оказаться что титр гриба в них одинаковый на этой стадии, так как им уже все равно п..ц и они его не могут контролировать и следовательно он разрастается насколько максимально может.


>WT) помирают на 20 день, на 30-м они все будут "сакрафис". Будет ли >оправдано их препарирование на более ранних стадиях, для получения органов?


думаю да, см. выше. мой опыт с бактериями мне подсказывает что если мышам плохо и они собрались умереть, то патогена в них скорей всего уже стало одинаково много. а патология органов- одинаково сильная.


> духе я определял кандидацид и фагоцитоз ин витро в системе с >очищенными нейтрофилами и макрогафами. Думаете ин виво не сработает?

победителей не судят. если получалось раньше и ревьюерам/шефу нравилось, то ОК.


>Значит вы советуете мне остановится в первую очередь на высевах в ?>агарозные чашки, и использовать это, как главный инструмент, а гистологию >привлекать в основном для иллюстраций?

я бы так посоветовал.

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): Mac-1
tempp
IP-штамп: fr/eFUcux3Q2c
гость



 прочитанное сообщение 05.10.2006 12:24     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #10 множественное цитирование

Мы тоже изучали системный кандидоз, оценивали биоцидность фагоцитов (крови, костного мозга, перитонеально-лаважной жидкости) с помощью хемилюминесцентного метода у мышей оппозитных линий (СВА и С57B/6). Получили интересные результаты, подавление окислительного взрыва, причём у разных линий разные типы фагоцитов (нейтрофилы и макрофаги) по разному реагировали. У одной линии изменение (снижение, с последующим повышением) продукции активных форм кислорода наблюдали у гранулоцитов, а у другой, сходные изменения - в макрофагах (нейтрофилы практически никак не реагировали). Интересно!:)

*




Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.
Имя:

 преобразовывать смайлики · показать смайлики
Назначение кнопок:

   Поблагодарить автора сообщения — поблагодарить автора
   Удалить сообщение — удалить
   Редактировать сообщение — редактировать
   Поместить сообщение в колонку новостей — поместить в колонку новостей
   Цитировать — цитировать сообщение
   не входит в цитирование/входит в цитирование — цитировать несколько
   Отметить СПАМ-сообщение — обозначить спам
   Сообщение для модератора — связь с модератором
   Участник онлайн!/Участник оффлайн! — автор онлайн/оффлайн
   Фотография — фотография автора

   - остальные обозначения -
 
   *
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема »
Быстрый ответДобавить сообщение в темуСоздать новую тему

Rambler   molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов              

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Ваш форум  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама  ·  Дата и время: 09.12.19 18:44
Bridged By IpbWiki: Integration Of Invision Power Board and MediaWiki © GlobalSoft