 * |   |
|
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда |  Zbio-wikiNG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: |
|
Правила
* Определение вирулентности Candida albicans in vivo, на мышах. -- Может у кого-то есть опыт? --
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.
   |
 Mac-1Постоянный участник оттуда  |
 07.07.2006 23:40
Когда я их ранее планировал - то представлял себе дизайн эксперименов так: я вызываю у мышей инвазивный кандидоз, а затем просто считаю дохлых мышей (системный кандидоз даже при интенсивном лечении имеет ~80% летальность). Но сейчас нам запретили "death as endpoint", и мне разрешили эксперименты с мышами только при условии, что я буду их "сакрафис при первых признаках дистресса". Т.е. мне придется мышей препарировать и, вероятно, определять количество грибковых клеток в крови и органах, возможно и степень разрушения внутренних органов (селезенка, сердце, печень - так это описано в литературе, причем в разных статьях, обращают внимание на заное...). А я в гистологической технике новичок - с клетками работал много, а вот органы никогда не препарировал, сейчас вот впервые буду. Статей по этому поводу немало, я их читаю, но я все же хотел бы спросить (в самой общей форме), может кто-то здесь имеет опыт сходных работ по определению вирулентности микроорганизмов, не обязательно кандиды? Что мне делать, с чего лучше мне начать и как, может быть мне все эти методы будут не нужны? Нужно ли мне красить эту кандиду в тканях (есть поликлоны), или просто под микроскопом клетки считать итп... Грубо говоря, когда принесут убиенного мыша с чего мне лучше начинать? |
|
Griva Постоянный участник Philadelphia, PA, USA |
08.07.2006 15:33
сама вирулентность in vitro уже определена на клетках-мишенях? 1) сравнить высеваемость кандиды wt и KO из крови и какого нибудь органа. На день 1, 5, 10....после инфекции. На начальные дни это будет в основном вирулентность, на поледующие- реакция иммунной системы. инфицировать мышей двумя разными дозами. например той, которая как LD50 для wt мыши и еще одной- на порядок меньше 2)сакрафис при первых признаках дистресса". - это жестко. Нельзя ли хотя бы rough coat и slow movement не считать за сильный дистресс. Я бы взвешивал мышей каждый день и тех кто теряет 20% веса забивал бы и обьявлял умершими в день взвешивания (это довольно надежный показатель). Так можно имитировать death as an endpoint эксперименты. Я бы не стал красить в тканях кандиду как основной метод определения ее количества, это не количественно. Я бы сделал высевы, а если будет эффект, то подобрал бы потом подходящие под этот эффект гистологические картинки, протсо была бы в статье лишняя красивая иллюстративная картинка. но делать важный вывод только на основе окрашивания грибы в органах я бы не стал. еще люди делают гриб или бактерию с люциферазой и потом меряют гомогенат органа на люминометре, вместо того чтобы высевы делать. Это гораздо быстрее, так как не надо выращивать и подходит например для БЦЖ и туберкулеза, подойдет наверное и для кандиды. органы из мышей для патологии я бы фиксировал и.или морозил. опять же если есть эфект на высевах и смертности, то потом можно подтянуть гистологию в качестве дополнительного иллюстративного материала.
|
|
Tom1 Постоянный участник |
08.07.2006 17:10
2. Макномер раз не ожидал в пубмеде вагон статей по тестированию гриба в модельном организме...... 3. Насколько я помню для тстирования грiба использую печень, но чаще почки.....
|
|
Mac-1 Постоянный участник оттуда |
08.07.2006 18:47
Большое спасибо за советы! О "первых признаках дистресса" сказано в новых правилах. В утвержденном протоколе (коего я должен придерживатся - будут проверять) мы разработали модную сейчас "балльную систему": за взъерошеную шерсть - столько то баллов, за "хенчед посче" - столько очков, за "закаченные глаза" - очки, за "ограничение подвижности" - очки, потеря веса - очки итд. Когда мыша наберет определенную сумму баллов (15) - ее будут эвтаназировать. Признаки дистресса оценивать в очках мне помог мой технолоджист - она очень опытная в работе с мышами (живыми), но с Кандидой работать будет впервые тоже. Она же и будет следить за мышами 2-3 раза в день (комиссия потребовала). Собственно, по клеткам-мишеням мы вирулентность не определяли, т.к. тут чуть другие задачи - мы же изучаем влияние этого белка на иммунную защиту. Зато я определял кандидацидную активность нейтрофилов и макрофагов ин витро, а также фагоцитоз кандиды. При системном заражении (попадании в кровь), дрожжевая форма кандиды прикрепляется к внутренним органам и переходит в мицелиальную форму, образовавшиеся гифен и псевдогифен прорастают в эти органы и разрушают их. Этот белок, что мы нашли, он очень интересный - он существует в двух формах: как нормальный белок клеточной стенки он участвует в образование гифен, и нокаутные штаммы грибка прорастают в органы хозяина значительно медленнее. Кроме того, он участвует и в начальном прикреплении дрожжевой формы к органам хозяина ("адгезивный белок"), а также возможно участвует в питании грибка. Этот белок также в большом количестве секретрируется грибком в окружающую среду, и, очевидно, служит "растворимой приманкой" (soluble docoy, по принципу "Протеина А" у Стафиллококус ауреус) - он конкурирует с "грибковосвязанной формой" этого белка за лейкоцитарные рецепторы, а также вызывает у лейкоцитов хемокинетическую реакцию - т.е. дает им сигнал для "детачмента", мешает адгезировать к грибкам и фагоцитировать их. Очень интересный пример борьбы паразита с защитой хозяина. Т.е. с одной стороны, его вырубание значительно уменьшает общий вред, который причиняет этот грибок, и следовательно уменьшает вирулентность. А с другой стороны, поскольку он - главная и чуть ли не единственная прямая мишень для системы клеточного иммунитета - вырубание его может сделать грибок сверхвирулентным, т.к. организм не в состоянии с ним боротся особенно на ранних стадиях инфекции. Ин витро макрофаги совершенно не узнают такой нокаутный грибок и не фагоцитируют его, а нейтрофилы не убивают его, т.к. они не инициируют в них "оксидативный бурст" (проверял все это. Есть и многие другие любопытные эффекты у этого белка, в т.ч. и потенциально "терапевтические" - но ин витро). Вот все это я и хочу выяснить. Мне кажется, вы мне дали очень хорошую идею о высевании крови на 2,5..н день, попробую проверить, когда буду отрабатывать метод. А можно пробовать посчитать самих грибков в крови? Открутить, и на гемацитометр? В некоторых статьях вирулентность выражали, как число грибков в крови и в отдельных органах. Прокрашивание я думал использовать для оценки степени прорастания гифен внутрь органов. Значит вы не советуете с этим возится? С лициферазой сейчас очень не хочется возится, кроме того, боюсь мне потом придется доказывать рецензентам, что люцифераза не влияет на вирулентность... Однако, буду это иметь в виду, если другое не поможет, а также при реньювэл гранта на будующее.  Эвтаназия при потере 20% веса предусмотрена протоколом, это сразу дает 15 "баллов", а мыши и будут "сакрафис" при достижении 15 баллов в любом наборе (10% потеря веса - 12 баллов). Наверное, это будет мне очень удобно - морозить органы на патологию на "потом", и "если понадобится" - я уже упоминал, что в гистологии я - новичек. Как мне лучше это делать - морозить непрепарированнные органы целиком, или сделать все же сначала срезы и препараты с них, а уже потом морозить? И как вы посоветуете фиксировать? Может еще что-нибудь посоветуете? И еще раз - большое спасибо! Том1 1) Извините, я не понял вашей первой фразы...  2) Об этом (наличии большого числа публикаций) я уже упоминал выше. В том-то у меня и сложность - наличие слишком большой литературы: они используют слишком разные и многочисленные подходы и критерии, а я из-за недостатка опыта (в том числе и в самой кандиде: я - "leukocyte-guy", а не "Candida-guy") я не знаю, какой подход для меня будет оптимальным, или хотя бы близким к такому. Очень не хочется завязнуть с этим надолго, разве что я себе найму на это постдока... 3) Вы имеете в виду - на изолированных органах? Если ин виво, то чаще всего (где-то в 40% публикаций) исследуют в первую очередь селезенку и сердце (может наиболее наглядно или легче?). Спасибо! |
|
vb Постоянный участник |
08.07.2006 19:23
а этот запрет тотальный? или это только в вашем учреждении? так чистый интерес. |
|
Mac-1 Постоянный участник оттуда |
08.07.2006 19:37
Года 3 назад я еще мог (но с ОГРОМНЫМИ сложностями, доказывая, что не удалось гибридомы свои к реактору адаптировать плюс Биг Босс своим авторитетом помог) заказать асциты, а в прошлом году уже все: адаптируются-не адаптируются - в любом случае только реактор... Асциты делать "жестоко и негуманно"... У нас, кстати, в департаменте был большой скандал месяц назад: один "русский" ПИ опубликовал "мышиную" статью и кто-то (скорее всего, из своих же, "русских) стукнул в анимал фасилити, что часть данных там получена с отклонением от утвержденного протокола. Была комиссия, протоколы опечатали и проверяли, ничего не нашли, но кровушки ей (ПИ) попили столько...
|
|
Griva Постоянный участник Philadelphia, PA, USA |
09.07.2006 05:55
[quote=Mac-1,08.07.2006 16:47]  Грива,Большое спасибо за советы! О "первых признаках дистресса" сказано в новых правилах. В утвержденном протоколе (коего я должен придерживатся - будут проверять) мы разработали модную сейчас "балльную систему": за ОК. я просто говорил что если теряется 15-20% веса, то в этот момент мышь у же можно убить и внести в кривую смертности (и получить такую картинку), таким образом формально например во Франции обходят death endpoint. >Собственно, по клеткам-мишеням мы вирулентность не определяли, т.к. тут >чуть другие задачи - мы же изучаем влияние этого белка на иммунную защиту. ясно, Вы просто сказали про вируленность и я сразу подумал про то как активно фагоцитируется и выживает кандида. >его может сделать грибок сверхвирулентным, т.к. организм не в состоянии с >ним боротся особенно на ранних стадиях инфекции. Ин витро макрофаги совершенно не узнают такой нокаутный грибок и не фагоцитируют его, а нейтрофилы не убивают его, т.к. они не инициируют в них "оксидативный бурст" (проверял все это. Есть и многие другие любопытные эффекты у этого белка, в т.ч. и потенциально "терапевтические" - но ин витро). Вот все это я и хочу выяснить. то есть с одной стороны поначалу медленней растет, а с другой- не узнается макрофагами? это интересно. а белок в итоге не лиганд для Толлов, маннозного рецептора или еще чего патогенспецифического? >Мне кажется, вы мне дали очень хорошую идею о высевании крови на 2,5..н >день, попробую проверить, когда буду отрабатывать метод. А можно через несколько дней в крови может быть уже мало, в органы прорастет. может лучше в органах? >пробовать посчитать самих грибков в крови? Открутить, и на гемацитометр? В некоторых статьях вирулентность выражали, как число грибков в крови и в отдельных органах. да, но там наверняка не под миксроскопом считали, я сеяли и считали сколько колоний вырастет из 1 мл крови или гомогентата органа? мне кажется высев количественней >Прокрашивание я думал использовать для оценки степени прорастания гифен внутрь органов. Значит вы не советуете с этим возится? я не советую делать это вместо посевов и на основании одного лишь прокрашивания органов делать вывод. >>Наверное, это будет мне очень удобно - морозить органы на патологию на "потом", и "если понадобится" - я уже упоминал, что в гистологии я - новичек. Как мне лучше это делать - морозить непрепарированнные органы целиком, или сделать все же сначала срезы и препараты с них, а уже потом морозить? И как вы посоветуете фиксировать? Может еще что-нибудь посоветуете? половина органа в 10% формалин- пойдет на гематоксилин, акике нибудь антителтные окрашивания, TUNEL и какие нибудь гриб-специфичные окрашивания. хранить в формалине или в виде парафинового блока. вторую половину органа заморозить в ОСТ compound для криосрезов и так хранить. тут можно будет антителами иммунные клетки красить, так как не все антитела на формалине работают. Я обычно храню ввиде блоков. потом режу и сразу крашу. Но можно нарезать слайды, зафиксировать холодным ацетоном , air dry изаморозить на -70 до окрашивания. Ничем другим кроме ацетона я лично сам не фиксировал, хотя знаю что люди пользуют спирт и параформальгегид тоже....
|
|
Mac-1 Постоянный участник оттуда |
09.07.2006 20:42
ПОнял о чем говорил Том! В первые часы после инфекции высев крови наверняка даст значительное число колоний - системмный кандидоз в подавляющем большинстве случаев вызывают введением 5 х 10е4 - 10е5 бластоконидий кандиды в хвостовую артерию. ОК. я просто говорил что если теряется 15-20% веса, то в этот момент мышь у же можно убить и внести в кривую смертности (и получить такую картинку), таким образом формально например во Франции обходят death endpoint. Вы не только это сказали - вы еще и описали именно ту "бальную систему", которую мне рекомендовал использовать ветеринар, который консультировал мой животный протокол. И я попробую тоже так обойти этот запрет: может "суммарные баллы" и дадут достаточную информацию.то есть с одной стороны поначалу медленней растет, а с другой- не узнается макрофагами? это интересно. а белок в итоге не лиганд для Толлов, маннозного рецептора или еще чего патогенспецифического? НО-грибок хуже адгезирует к органам и медленнее вростает в них. Лейкоциты узнают кандиду единственным рецептором: "Первым антигеном макрофагов" - Мас-1 (CR3, alfaMbeta2, CD11b/CD18). Этот же рецептор узнает также и бактериальные липопротеины (не только гликопротеины грибков). альфаМ субьединица действительно имеет лектиновый домен и участвует в связывании кандиды (блокируется маннозой), но в узнавании также участвует и алфаМ-I-domain и бета2 I-like domain. Это - все уже опубликованно. А бета2 субьединица взаимодействует с эндоцитозным рецептором LRP. А вот очень похожий p150,95 (alfaXbeta2, CD11c/CD18), по-видимому, не участвует в этом (но еще провериять буду на мышах).через несколько дней в крови может быть уже мало, в органы прорастет. может лучше в органах? Количество мышей по этому протоколу у меня очень ограничено, всего где-то под 300 , я думал их умерщвлять только к 15 баллам... Обычно они (WT + WT) помирают на 15-20 день, на 30-м они все будут "сакрафис". Будет ли оправдано их препарирование на более ранних стадиях, для получения органов? Кровь ведь можно на анализ отбирать и без умерщвления мыша...да, но там наверняка не под миксроскопом считали, я сеяли и считали сколько колоний вырастет из 1 мл крови или гомогентата органа? мне кажется высев количественней Не под микроскопом... Это моя сырая идея: взять кровь, лизировать все мышиные клетки, добавить вайолет блю и считать с гемацитометром... В таком духе я определял кандидацид и фагоцитоз ин витро в системе с очищенными нейтрофилами и макрогафами. Думаете ин виво не сработает? Значит вы советуете мне остановится в первую очередь на высевах в агарозные чашки, и использовать это, как главный инструмент, а гистологию привлекать в основном для иллюстраций? |
|
Griva Постоянный участник Philadelphia, PA, USA |
13.07.2006 02:14
Количество мышей по этому протоколу у меня очень ограничено, всего где-то под 300 , я думал их умерщвлять только к 15 баллам... Обычно они (WT + обратите внимание на то, что если мыши двух разных групп будут при смерти или очень плохи (типа Ваших 15 баллов), то может оказаться что титр гриба в них одинаковый на этой стадии, так как им уже все равно п..ц и они его не могут контролировать и следовательно он разрастается насколько максимально может. >WT) помирают на 20 день, на 30-м они все будут "сакрафис". Будет ли >оправдано их препарирование на более ранних стадиях, для получения органов? думаю да, см. выше. мой опыт с бактериями мне подсказывает что если мышам плохо и они собрались умереть, то патогена в них скорей всего уже стало одинаково много. а патология органов- одинаково сильная. > духе я определял кандидацид и фагоцитоз ин витро в системе с >очищенными нейтрофилами и макрогафами. Думаете ин виво не сработает? победителей не судят. если получалось раньше и ревьюерам/шефу нравилось, то ОК. >Значит вы советуете мне остановится в первую очередь на высевах в ?>агарозные чашки, и использовать это, как главный инструмент, а гистологию >привлекать в основном для иллюстраций? я бы так посоветовал.
|
|
tempp IP-штамп: fr/eFUcux3Q2c гость |
05.10.2006 12:24
|
| « Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |
 |
· Викимарт - все интернет-магазины в одном месте · Доска объявлений Board.com.ua ·
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---
Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Powered by Invision Power Board(Trial) v2.0.0 © 2019 IPS, Inc.