molbiol.ru -> Не лигируется :(

> Все форумы > Тематические форумы > Молекулярная и клеточная биология

Zbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ

Правила FAQ* Поиск* Участники* Календарь* Избранные темы* Форум Форумов*

Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ]

Форум:

* Не лигируется :(

Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.

jelenarus

19.03.2018 13:06

URL #1

Всем привет)
Дело такое: порезали плазмиду Dpn1, все окей, форез отличный. Выделили ДНК из геля, концы фосфорилировали, осталось легировать, просто соединить 2 конца плазмиды по тупым. И все, на чашках не выросло! Ставили с Blunt Mix, потом поставили просто лигазой и лигазным буфером, опять ничего не растёт. Контроли отлично растут и ПЦРятся. Что может быть не так?

jelenarus

19.03.2018 13:20

URL #2

Ps. Все реактивы проверенные и были использованы до этого. И даже на этой же плазмиде. Просто резко все перестало идти

MMM
Постоянный участник

19.03.2018 13:53

URL #3

Возьмите лямбду и тупо порежте и лигируйте посмотрите, что получится на форезе. Скорее всего рестриктаза чудит. То что она режет на фрагменты нужной длины, еще не означает, что концы этих фрагментов это то, что вам нужно для лигирования, рестриктазы они могут всякие чудеса выдавать.

ship
Постоянный участник
Moscow

19.03.2018 16:38

URL #4

Резали по DpnI? Ой чтото не верится, это же 4ка, она в труху любую плазмиду пощепит
на вскидку - в pBluescript 15 сайтв DpnI

И для чего фосфорилирвать концы - если лигируется вектор сам на себя????

Как раз таки дефосфрилируют что бы вектор сам на себя не шился

Сообщение было отредактировано ship - 23.03.2018 11:51

Поблагодарили (1): criplenie

R-J-Dio
Постоянный участник

23.03.2018 04:39

URL #5

вы там определитесь, что вы делаете, фосфорилируете или ДЕфосфорилируете? На кой фосфорилировать рестрикт, коли фосфаты и так есть по определению. Алё, это какой-то гон

ASDF
Постоянный участник

23.03.2018 12:04

URL #6

После резки из геля такое бывает и не ПЦРится и не лигируется. Плохо QG отмыли. Зачем из геля то резать, вы там вставку выбивали что ли ? Обычный клианап и никаких проблем

R-J-Dio
Постоянный участник

23.03.2018 18:45

URL #7

как зачем? иногда необходимо. Более того, чаще всего необходимо или желательно. Не то говорите, причина в чем-то ином и весьма банальном

Поблагодарили (1): petr

ASDF
Постоянный участник

28.03.2018 10:41

URL #8

Что может быть банальнее плохо отмытого QG? Случайная капелька на крышке колонки и все, ищи потом более банальную причину.

R-J-Dio
Постоянный участник

29.03.2018 18:01

URL #9

капелька на крышке после центрифугирования? Интересная техника работы- тогда помимо QG проблемы будут

-Ъ-
Постоянный участник
Москва

30.03.2018 11:21

URL #10

что это такое?

Esya
Постоянный участник
PA, USA

31.03.2018 05:41

URL #11

это хаотропный буфер
да, иногда стоит два раза спиртягой промывать колонки

R-J-Dio
Постоянный участник

31.03.2018 07:35

URL #12

да руки поотрывать и гнать из профессии, вот и весь сказ. пусть идет в биоинформатики или оборудование продавать

Поблагодарили (1): X34

Tom1
Постоянный участник

31.03.2018 16:27

URL #13

Еся повелась на троллинг от " комерсанта"....
)))))

-Ъ-
Постоянный участник
Москва

02.04.2018 11:36

URL #14

(Esya @ 31.03.2018 06:41)

это хаотропный буфер
да, иногда стоит два раза спиртягой промывать колонки

Ах хаотропный буфер так Каджини назвал труднозапоминаемо и хитроумненько.

Там этой соли гуанидина так много

, что два раза спиртягой не факт что отмоешь. Надо самогоном 60% попробовать.

X34
Участник

02.04.2018 16:20

URL #15

(R-J-Dio @ 31.03.2018 08:35)

первый раз от академика дельный на все 100 совет, убивать таких на вступительных экзаменах, тьфу ты, ЕГЭ же нынче

watchesbiz
Постоянный участник

20.11.2021 18:05

URL #16

https://www.uptrennd.com/post-detail/hints-...-watch~ODY3MDU2
https://anotepad.com/note/read/mqg8p5jm
https://www.crokes.com/replicarolexwatches/profile/
https://ko-fi.com/post/Watches-Shopping-Gui...-Watc-E1E13PZV9
https://www.merchantcircle.com/blogs/replic...x-Watch/1966540
https://www.nairaland.com/6427528/watches-s...de-finding-fake
https://www.vingle.net/posts/3587193
https://fortunetelleroracle.com/sport/replica-watches-280478
https://www.goodreads.com/story/show/132736...ake-rolex-watch
https://www.diigo.com/item/note/85twz/phwr?...2395edb2dac07ea
https://github.com/ReplicawatchesUK/Replica...ake-Rolex-Watch
https://www.reddit.com/user/Bestreplicawatc...ke_rolex_watch/
https://slashdot.org/submission/13306958/wa...ake-rolex-watch
https://www.wattpad.com/1030107359-replica-...guide-finding-a
https://www.instructables.com/member/Fakero...licPreview=true

watchesonline89
Постоянный участник

26.12.2022 11:39

URL #17

https://omegawatches89.simplesite.com/452939033
https://dailygram.com/index.php/blog/116219...eplica-watches/
https://plaza.rakuten.co.jp/omegawatches89/...y/202208040000/
https://blog.easyfie.com/how-to-prepare-you...on/#comment-285
https://form.jotform.com/223253786289064
https://discussions.ubisoft.com/user/omegawatches89
https://www.worldranklist.com/profile/108194
https://blog.udn.com/omegawatches89/176226568
https://penzu.com/p/56f52c40
https://62e8ce2ae5d50.site123.me/blog/tips-...replica-watches
https://omegawatches91.mystrikingly.com/
https://ameblo.jp/omegawatches89/entry-12756647425.html
https://telegra.ph/Where-To-Find-Elegant-An...es-Online-08-03
https://omegawatches89.seesaa.net/article/490300768.html
https://medium.com/@omegawatches89/reasons-...ar-e16d1fabc26f
https://omegawatches89.simplesite.com/452939109
https://teletype.in/@omegawatches89/bVw2sShID4x
https://www.pearltrees.com/omegawatches89#item456651209
https://dailygram.com/index.php/blog/116219...eplica-watches/

Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.

Имя:

Отправка сообщений использует JavaScript операции. В вашем броузере не
установлено/отключено выполнение JavaScript программ. Используйте Netscape Navigator
или Internet Explorer (не ранее 3 версии); убедитесь, что выполнение JavaScript
программ разрешено в настройках вашего броузера.