molbiol.ru -> Проявление ГДГ

> Все форумы > Тематические форумы > Молекулярная и клеточная биология

Zbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ

Правила FAQ* Поиск* Участники* Календарь* Избранные темы* Форум Форумов*

Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ]

Форум:

* Проявление ГДГ -- Помогите пожалуйста! --

Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.

Octava

31.10.2020 22:22

URL #1

Доброго времени суток всем! Помогите пожалуйста решить проблему проявления ГДГ тетразолиевым методом. Понимаю, метод старый, сейчас этим мало кто занимается, но нам очень надо. Возможно среди присутствующих есть кто нибудь , кто когда либо этим занимался, или знает к кому можно обратится.
Дело в том, что препараты из тканей( не очищенный фермент) прекрасно проявляются, однако стоит нам получить более- менее чистый фермент, как он перестаёт проявляться после ПААГ- электрофореза. И чего мы только не делали: ph- среды проявления меняли, концентрации субстратов меняли, изменяли % гелей и тп. понятное дело, что где то у нас есть какая то ошибка, но понять где мы не можем.
Пы.сы. С другими дегидрогеназами таких проблем у нас нет

MMM
Постоянный участник

01.11.2020 07:02

URL #2

ГДГ это что за дегидрогеназа?

---Дело в том, что препараты из тканей( не очищенный фермент) прекрасно проявляются.

Прекрасно проявляется после ПААГ???!!!

---стоит нам получить более- менее чистый фермент,

Какой протокол очистки???

Octava

01.11.2020 11:09

URL #3

Гдг- глутаматдегидрогеназа.
Протокол очистки разработали самостоятельно на основе литературы. Очистка включает в себя гомогенизацию, затем высаливание сульфатом аммония сначала 0-30, затем 30-70% насыщения с последующим получасовым центрифугирование. После обессоливаем на колонке g25, затем чистим последовательно на sefadex и g200.
После ПААГ у нас достаточно хорошо проявляются дегидрогеназы, при соблюдении всех необходимых условий. Хотя прекрасно , это весьма относительный момент.

MMM
Постоянный участник

01.11.2020 12:21

URL #4

Ваша глутамат дегидрогеназа определяется в экстракте посредством ПААГ фореза? Или просто в экстракте без фореза ферментной реакцией?

Сколько времени проходит после центрифугирования осадка в сульфате аммония и до анализа на ПААГ очищенного фермента и как он в это время хранится?

Octava

01.11.2020 13:47

URL #5

Не совсем поняла первый вопрос. Глутаматдегидрогеназа у нас проявляется при проведении ПААГ-электрофореза, например ,при гомогенизации биологического материла с последующим центрифугированием при 5000об / мин, проявлением фермента после ПААГ -электрофореза осуществляем тетразолиевым методом. Также, проявляются на электрофореграмме( зимограмме) и пробы из биологического материала, которые были очищены по нашей схеме до стадии пропускани через колонку sefadex.
Касаемо второго вопроса: препарат подвергшийся высаливание сульфатом аммония также окрашивается на электрофореграмме. Хранение препаратов осу

MMM
Постоянный участник

01.11.2020 14:10

URL #6

--Не совсем поняла первый вопрос.
И не надо. Ваш ответ удовлетворил меня и я снимаю этот вопрос.

Поясните, что значит "последовательно на sephadex и G200"? G200 - это же тоже sephadex!

И на каком этапе пропадает активность на этапе неизвестно какого sephadex'a или на этапе G200?

Octava

01.11.2020 15:53

URL #7

Опечатались, сначала на дэае sephacel , а затем на g200.
Активность не пропадает. При измерении активности спектрофотометрически она есть, при чем достаточно высокая. На всех этапах очистки. Но после очистки на g200 при наличии активности и по прямой и по обратной реакции белок на электрофореграмме не проявляется.

MMM
Постоянный участник

01.11.2020 16:55

URL #8

Т.Е. После G200 спектрофотометрически активность есть, а на форезе активности нет.

Условия озвучьте хроматографии на G200. Проба на G200 наносится на колонку сразу после Sephacel в высокосолевом буфере?
Каким буфером уравновешивается G200?
Условия фореза тоже неплохо бы озвучить:
прежде всего состав форезных буферов?
и процентность геля?
и соотношение акриламид/бис тоже?

Сообщение было отредактировано MMM - 01.11.2020 17:54

Octava

01.11.2020 18:03

URL #9

Все верно.

Пробу на g200 наносили всегда сразу после sephacela, то есть что получили на выходе, то и наносили( делали линейный градиент NaCl, концентрация хлорида натрия для разных проб различна , градиент от 150 до 350 мМ). G200 у нас уравновешен Трис НСl буфером.

Форез проводили в трис- глициновом буфере( ph8,3 ), концентрации гелей, и верхнего и нижнего меняли( верхний 3; 4; 5% нижний 4;5; 6%). В целом все как у Мауэра. Соотношение акриламид/бисакриламид( на 100 мл) : 30г акриламида на 0,8 г бисакриламида.

MMM
Постоянный участник

01.11.2020 18:36

URL #10

(Octava)

G200 у нас уравновешен Трис НСl буфером.

Вот просто Трис? С какой хоть концентрацией и рН? Че даже ЭДТА не добавляли?
И сколько это длилось и при какой температуре? Собирали, как я понимаю, самый первый пик?

(Octava)

нижний 4;5; 6%). В целом все как у Мауэра. Соотношение акриламид/бисакриламид( на 100 мл) : 30г акриламида на 0,8 г бисакриламида.

И че где была ваша глютаматдегидрогеназа в 6% геле?

Octava

01.11.2020 18:52

URL #11

100 мМ Трис НСL 7,4 , хотя и 8,0 тоже уравновешивали когда то. Эдта не добавляли. Длилось это примерно часа 3 при температуре 4С. Первый пик сходил примерно минут за 40, но собирали мы не только первый пик, но ни первый, ни последующие не проявляются.
Нигде не проявляется наша гдг, так что понятия не имею где она была в 6% геле

MMM
Постоянный участник

01.11.2020 19:08

URL #12

(Octava @ 01.11.2020 19:52)

А как же?

(Octava)

у нас проявляется при проведении ПААГ-электрофореза, например ,при гомогенизации биологического материла с последующим центрифугированием при 5000об / мин, проявлением фермента после ПААГ -электрофореза осуществляем тетразолиевым методом.

А спектрофотометрически после G200 определяется?

Octava

01.11.2020 20:28

URL #13

Не совсем поняла первый вопрос.
Касаемо второго:да.

MMM
Постоянный участник

01.11.2020 21:32

URL #14

А чего непонятного? Из вашей цитаты, которую я процитировал, вроде как получалось, что до G200 у вас получалось на форезе провести ферментную реакцию.

Я подозреваю, что форез разрушает олигомерную форму фермента, я не знаю активен ли мономер. Но если мономер не активен и в результате фореза олигомер разрушается, то фермента не будет видно.

Можно просто на чистую пластину геля капнуть препарат фермента ополоснуть ее и попробовать окрасить пластину с NBT. По идее окраска должна получиться. Если получится, то очевидно, что фермент теряет активность в порах геля под действием электрического поля.

Я бы рекомендовал использовать для таких вариантов форез в поддерживающей среде с большими порами типа в агарозе, может быть в крахмальных гелях.

Octava

01.11.2020 22:05

URL #15

Кажется , поняла.
Касаемо активности мономера: димерная и тетрамереая формы в других объектах по литературным данным обладают активностью. Однако, проявления этих форм вроде бы никто не делал.
Спасибо, попробуем проявить в агарозе.

watchesbiz
Постоянный участник

08.10.2021 20:20

URL #16

https://archives.profsurv.com/forum/Profess...ert/-67881.aspx
https://atlanta.bubblelife.com/community/an...ex_Watch_Online
https://gumroad.com/rolexrelicawatches/p/di...replica-watches
https://onmogul.com/stories/guide-on-how-to...ex-watch-online
https://list.ly/i/5704105
https://www.behance.net/gallery/114237003/Replica-Rolex
https://www.mlbdailydish.com/users/Replicarolexwatches
http://replicawatches24.simplesite.com/
https://watcheshutuk.cabanova.com/
https://www.pinterest.com/watcheshutuk/_saved/
https://www.linkedin.com/pulse/guide-how-pu...online-hei-bai/
https://justpaste.it/8t11q
https://padlet.com/watcheshutuk/in2opwnfmnmclce8
https://www.allforxi.com/users/Replicarolexwatches
https://profile.hatena.ne.jp/Rolexrelicawatches/profile

watchesonline89
Постоянный участник

25.12.2022 09:10

URL #17

https://medium.com/@omegawatches89/exciting...ne-17c41f48bce4
https://telegra.ph/Tips-For-Buying-Replica-Watches-08-03
https://disqus.com/by/omegawatches89/about/
https://plaza.rakuten.co.jp/omegawatches89/...y/202208040004/
https://omegawatches89.bigcartel.com/product/replica-watches
https://teletype.in/@omegawatches89/p6FG7kdedpw
https://dailygram.com/index.php/blog/116219...eplica-watches/
https://www.craftsforum.co.uk/member/209770-omegawatches89
https://forum.amando.it/members/omegawatches89-165008.html
https://www.academia.edu/88309718/https_www_watchesbiz_co_
https://codepen.io/omegawatches89/pen/KKRbyKj
https://musescore.com/user/54310503/sets/5621730
https://form.jotform.com/223253838439059
https://62e8da780bf7c.site123.me/blog/amazi...-watches-online
https://teletype.in/@omegawatches89/FclnTDwlkB1

Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.

Имя:

Отправка сообщений использует JavaScript операции. В вашем броузере не
установлено/отключено выполнение JavaScript программ. Используйте Netscape Navigator
или Internet Explorer (не ранее 3 версии); убедитесь, что выполнение JavaScript
программ разрешено в настройках вашего броузера.