molbiol.ru -> Осаждение белков сульфатом аммония

> Все форумы > Тематические форумы > Молекулярная и клеточная биология

Zbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ

Правила FAQ* Поиск* Участники* Календарь* Избранные темы* Форум Форумов*

Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ]

Форум:

* Осаждение белков сульфатом аммония -- comments to a permanent page of the site --

Тема связана с: Осаждение сульфатом аммония
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.

страницы (2): < 1 2

Гость
IP-штамп: frTlWdNmzlEpc
гость

21.08.2007 10:13

URL #51

Добрый день! Уважаемые коллеги!
У нас достаточно гидрофобный белок. В состав лизирующего буфера входит мочевина. Можно ли как-то использовать метод высаливания? Совместимо ли использование мочевины с этим методом?

форма жизни

21.08.2007 10:25

URL #52

Вообще-то, заниматься сульфат-аммонийным фракционированием белков в полевых условиях дело очень сложное. Правда, понятие "полевые условия" довольно растяжимое и зависит от конкретного "поля". Выделение из гемолимфы - значит объект беспозвоночные, скорее всего моллюски, и следовательно, объем исходного материала весьма ограничен. Лучше всего "засолить" белок сульфатом, собрать осадок (можно фильтрацией), довести до лаборатории и там с ним работать.
Не бойтесь высолить белок "с запасом", сделайте 0,9-0,95 насыщения при +4 и после ночного перемешивания отфильтруйте белок. Только не пытайтесь "подсушить" осадок, пусть будет влажным - иначе белок денатурирует. Часто высаливание лучше проводить из буфера, содержащего ДТТ (дитиотрейтол). Если вам известно, что белок легко окисляется или есть какие-то предположения на этот счет, то 5мМ ДТТ могут облегчить жизнь.

Поблагодарили (2): NBSC, genseq

форма жизни

21.08.2007 11:39

URL #53

Наличие мочевины в лизирующем буфере никак не мешает высаливанию белков. Только два замечания: 1) если концентрация мочевины в лизирующем буфере высокая, то уже свыше 0,5 насыщения сульфата белок будет флотировать. Это не страшно, но создает некоторые неудобства - надо ц\ф при более высоких оборотах чем обычно; 2) ваш белок из сульфат-аммонийного осадка скорее всего не будет растворяться в воде (буфере), если не добавить мочевины.
И еще имейте в виду, что присутствие мочевины изменит "точки высаливания" других белков, что для вас тоже может иметь значение.

Поблагодарили (1): NBSC

Гость
IP-штамп: frTlWdNmzlEpc
гость

21.08.2007 18:35

URL #54

Форма жизни, спасибо!

guest: NBSC
IP-штамп: frIPUyB0jVJss
гость

21.08.2007 22:16

URL #55

Форма жизни и genseq, спасибо! Ваша информация для меня очень важна.
У меня отработана методика получения нужного белка с помощью хроматографии после высаливания, с которой я работаю уже давно, но хочется попробовать еще и другие способы. Иногда получаются дополнительные варианты разделения.
Еще раз спасибо, отправляюсь на море работать. После возвращения напишу, помогло ли.

Guest
IP-штамп: frwCBzAO1VbsY
гость

24.10.2008 17:11

URL #56

Извините за глупый вопрос: а почему Нуклеиновые кислоты сульфатом не высаживатся? Почему сульфат от них с таким же успехом воду не отнимает?

guest: ммм
IP-штамп: fr//M2zwa77cE
гость

26.10.2008 00:20

URL #57

Нуклеиновые кислоты сильно гидрофильнее белка. Чтобы они выпали сами собой нужно либо добавить спирт. Либо создать специальные условия,например сильноразвитую поверхность, типа селикагеля, он же гласмилк.

Яна

28.10.2008 22:44

URL #58

(Ъ @ 19.08.2007 12:47)

Генсек, уже поздно - Яна уже втюрилась виртуально.

Но вы же там соседи...

Я так понимаю, что уже поздно что либо писать, но я Яна и реально существую на сайте уже давно, поэтому папрашу осторожнее с никами

только на сайт захожу очень редко поэтому только сейчас прочитала про "инсинуации" в мой адрес. А за тему спасибо, несколько полезных идей для себя подчерпнула.

Сообщение было отредактировано Яна - 28.10.2008 23:52

Guest
IP-штамп: frGqyYT8IU7LU
гость

29.10.2008 10:19

URL #59

Высаливание биополимеров ингода преподносит удивительные сюрпризы. Лет 20 назад был опубликован и запатентован весьма оригинальный способ выделения ДНК из молок лососевых раб с помощью высаливания. Суть очень проста. Гомогенат молок обрабатывается сульфатом аммония до 0,9 насыщения по сульфату и полученный весьма мутный раствор разбавляется водой в 10 раз. Выпадает в осадок (точнее всплывает) ДНП - комплекс ДНК-протамин, который легко отделяется от всего остального фильтрованием или центрифугированием. Затем ДНП растворяют в 2 М NaCl и теперь уже чистую ДНК отфильтровывают от денатурированного белка и высаживают спиртом. Фактически идет "игра" на разной растворимости ДНК, белков и комплекса ДНК-протамин (ДНП) в растворах солей разной концентрации. На Хабаровском химфармзаводе даже было изготовлено несколько партий ДНК по этой технологии.

Поблагодарили (1): genseq

Ъ
IP-штамп: frNwv0U1khjS.
гость

29.10.2008 11:30

URL #60

(guest: ммм @ 25.10.2008 23:20)

Нуклеиновые кислоты сильно гидрофильнее белка. Чтобы они выпали сами собой нужно либо добавить спирт.

... либо цетавлон...

Гость
IP-штамп: frlnAsDr.5x7A
гость

25.02.2009 21:18

URL #61

А вот как выяснилось да же без добавления спирта или участия сильноразвитой поверхности в осадок попадает низкомолекулярные НК уже при 70% от точки насыщения. Выпадают они сами по себе или по той причине что сами связыны с выпадающими белками-не проверялось, но теоритически в такой высокой ионной силе ионные взаимодействия неосуществимы, и если это действительно падение НК из-за связи с белком, то эти НК связаны с белками водородными связями. Короче так или иначе-падают НК при добавлении сульфата.

Guest
IP-штамп: frGqyYT8IU7LU
гость

26.02.2009 09:24

URL #62

Что-то вас занесло. Возьмите любую ДНК, которую вам не жалко и попытайтесь ее высолить любой концентрацией сульфата. Увы, осадок не образуется. Поэтому ваше "выяснилось" это просто некорректно поставленный эксперимент.
Соосаждение нуклеиновых кислот с белками при сульфат-аммонийном фракционировании - это рядовое хорошо известное явление. Клеточный лизат или разрушеная ткань или еще какой-либо первичный биологический источник нужного вам белка (фермента) фракционируют сульфатом аммония, но при этом все понимают, что на начальном этапе ВСЕГДА происходит соосаждение НК, точнее соосаждаются фрагменты нуклеиновых кислот весьма гетерогенные по мольвесу и составу. При дальнейшей очистке от НК отделяются.
Так что не путайте, пожалуйста, разные понятия. Высальвание белков сульфатом и соосаждение нуклеиновых кислот белковыми сульфат-аммонийными осадками - это разные процессы.

Гость
IP-штамп: frlnAsDr.5x7A
гость

12.03.2009 21:19

URL #63

=) Уважаемый критик, прочтите внимательно предпоследний пост:"в осадок попадает низкомолекулярные НК ...,Выпадают они сами по себе или по той причине что сами связыны с выпадающими белками-не проверялось".
"В осадок"-имеется ввиду осадок, обазующийся в клеточном лизате при добавлении к нему сульфата аммония.
Ясное дело что НК сульфатом из водного раствора не высадятся =), но вот то что не будет 100% очистки от них - показано.
Рад что факт соосаждения для вас-очевидная и общеизвестный процесс.

Гость
IP-штамп: frlnAsDr.5x7A
гость

26.03.2009 21:24

URL #64

*поправочка: "то что не будет 100% очистки от них(НК) ПРИ ОСАЖДЕНИИ БЕЛКОВ КЛЕТОЧНОГО ЛИЗАТА - показано"
*очевидный

guest: Алиса
IP-штамп: frMnW0t8R1Wd6
гость

13.10.2009 12:05

URL #65

Здравствуйте!
У меня вопрос не профессионала, а человека всего лишь интересующегося.
При высаливании сульфатом аммония различных фракций белков из плазмы крови что происходит с липопротеинами, не осаждаются ли они, не изменяют ли своих свойств?!! В справочниках по биохимии ничего по этому поводу не нашла!
Заранее спасибо большое!

guest: ммм
IP-штамп: frwHRv5zEzGDY
гость

13.10.2009 14:45

URL #66

--не осаждаются ли они

Должны.

--не изменяют ли своих свойств?

Строго говоря они их изменяют уже тогда, когда вы извлекли их из кровотока.
Но если подходить к этому вопросу грубо.
Не должны!

Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.

Имя:

Отправка сообщений использует JavaScript операции. В вашем броузере не
установлено/отключено выполнение JavaScript программ. Используйте Netscape Navigator
или Internet Explorer (не ранее 3 версии); убедитесь, что выполнение JavaScript
программ разрешено в настройках вашего броузера.