Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
vooden |
Есть интерес попробовать провести градиентный гель электрофорез, разделить низкомолекулярные белки (3-15 кДа). Встал вопрос как залить гель. Кто-нибудь может поделиться опытом сборки установки для заливки геля? Спасибо. |
metrim Постоянный участник Москва |
|
vooden |
Книжка прочитана. Там установка стандартная, но продавцы за два цилиндра просят столько, что весь интерес пропадает. Плюс самим нужно как получившийся гель равномерно между стеклами залить. Поэтому интересуют практические вопросы: где можно за адекватную цену собрать смеситель, как заливать гель. |
Grinar |
Вообще если хотите низко молекулярные белки гнать то вам нужен трициновый гель |
Tom1 Постоянный участник |
если есть таковые все просто аки мычание ( правда придется заливать по одному гелю). берете трубочку и стеклянныиь капиляр его опускаите на дно собранных стекол в которыс сделана пробка из аклриламида или агарозы и заливаите гель. Если смеситель не найден берете 2 стекляных цилидра находите стеклодува и он их соединяет стрклянноуй трубочкой и в одном делает стеклянныиь отводо на которй надеваите трубочку с крантиком ( зажимом). пы.сы. замечание о трициновом буфере верное |
dk Постоянный участник Россия |
Сообщение было отредактировано dk - 30.05.2018 18:01
|
MMM Постоянный участник |
Вам нужна трициновая система. Но кроме нее нужна ступенька(не градиент) в геле. Самый низ геля делаете по особенному где-то 15-20% от общей длины. Концентрация акриламида там порядка 18-20%, а вместо SDS 3-4M мочевина, остальной гель обычный трициновый с концентрацией акриламида 15-16%.
|
vooden |
(Grinar @ 30.05.2018 16:46) Можно конечно несколько растворов геля делать с постепенным увеличением концентрации акриламида (хоть 100 штук) и по очереди наслаивать. Собирать смеситель самому этот конечно интересно... Вообще если хотите низко молекулярные белки гнать то вам нужен трициновый гель Да, на трициновый буфер присматриваюсь. Градиент хочется попробовать, чтобы увеличить разрешения. Фокусировка на концентрирующем геле (даже с увеличением pH и T) на низкомолекулярных белках как-то не очень работает. В идеальном варианте это будет трицин с градиентом. Трицин обеспечит разделение, градиент - разрешение. Сообщение было отредактировано vooden - 31.05.2018 11:10 |
vooden |
(dk @ 30.05.2018 18:56) Да подобная "установка" делается за пол-часа просто "на коленке". Берёте 2 пластиковых стаканчика (размер прикиньте по объёму геля), проковыриваете в одном у дна 1 дырку (1), во втором - 2 дырки (2). Через дырки путём плотного впихания силиконовой трубочки соединяете 2 стаканчика, а второй отвод из стаканчика (2) - в камеру. На трубочки вешаете мед.зажимы, всё ставите на магн.мешалку. Магнит кидаете в стаканчик (2). Проверяете - всё ли нормально течёт куда надо и не течёт откуда не надо. Далее элементарно - на трубочку "в камеру" вешаете капилляр до дна камеры (или длинную иглу, особенно хороша для взятия пункции - но зависит от камеры), в (1) высококонц. гель, в (2) - низкоконц. Открываете трубочки, по мере смешения гелей и получаете градиент: сначало идёт низкоконц. гель из (2), потом он будет подниматься вверх всё более конц. из (1). Тут ещё нюанс есть подобрать конц. инициатора и катализатора, чтоб всё это дело и не заполимеризовалось в процессе, и градиент не потерять. Всё регулируется скоростью истекания, подбирайте по своей камере уже. В зависимости от кривизны рук раза с 3 даже у меня нормально получалось. Лично я ещё сверху ещё заливал "концентрирующий гель", чтоб фронт белка потоньше был. А можно и просто гребёнки сунуть, сверху, обычно, %% 2 должно быть. Зависит от материала и задачи. Если нужен 2D-форез с градиентом - просто аккуратно оставляете сверху запас под вырезанный гель и его туда заполимеризовываете. Так что поэкспирементируйте, не бойтесь - и всё у Вас получится! Спасибо. Думал есть какая-нибудь хитрость избежать подбора времени полимеризации и скорости заливки. Буду пробовать. |
MMM Постоянный участник |
Никакого фатального улучшения разрешения градиентный гель не дает, особенно в области малых размеров. Так картинка визуально посимпотичнее, но зато гель имеет форму веера. |
vooden |
(MMM @ 31.05.2018 12:20) Хитрости как раз - не существует. Даже в неградиентные гели нужно подбирать количества ТЕМЕД и персульфата от партии к партии. Никакого фатального улучшения разрешения градиентный гель не дает, особенно в области малых размеров. Так картинка визуально посимпотичнее, но зато гель имеет форму веера. А почему веер? заливка не равномерно идет, от капилляра к краям? |
MMM Постоянный участник |
|
Tom1 Постоянный участник |
(vooden @ 30.05.2018 23:32) Спасибо. Думал есть какая-нибудь хитрость избежать подбора времени полимеризации и скорости заливки. Буду пробовать. Свежий ПСА всегда и будет счатье.... |
Tom1 Постоянный участник |
(MMM @ 31.05.2018 03:04) Да потому что, когда вы гель фиксируете и промываете водой и уксусом, он там где больше концентрация АА больше набухает и больше увеличивается в размерах и получается такой веер. Большой любитель резких запахов.... давно уже не промываю уксусом.... 1 минута в воде в микрофолновке перед краской ну и 2-5 минут в воде там же после краски.... цвиточек выдан по ошибке... |
MMM Постоянный участник |
Посему-то вы решили в соседнем топике , что я настаиваю на отмывке горячим уксусом. Эта рас. А двас, если отмывать водой, то "веер" никуда не денется. ---давно уже не промываю уксусом....1 минута в воде в микрофолновке перед краской ну и 2-5 минут в воде там же после краски.... С возрастом вы становитесь более ленивее. --цвиточек выдан по ошибке... Поздняк метаться. Здеся - это наобратимо. |
watchesonline89 Постоянный участник |
|
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |