Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
watchesonline89 | Отправлен 25.12.2022 10:40 |
watchesbiz | Отправлен 10.11.2021 18:36 |
Carbon Copy | Отправлен 26.08.2019 17:43 |
(DK. @ 19.08.2019 21:05) У кого какие опыт/соображения на сей счет, кроме как "сами дальше и тестируйте"? Иногда свойства праймеров и проб меняются при хранении. Залепили как то тест по опубликованным (более того - рокомендованным CDC) праймерам и Такманам. Свежие реакции с праймерами и пробами из стоков работали нормально, но, стоило primer/probe mix постоять денёк в холодильнике на 4 оС - начинала лезть неспецифика на поздних циклах. То же было, если mix многократно замораживали/оттаивали. Чем объяснить - непонятно, скорее всего взаимодействием однонитевой ДНК в растворе в силу частичной комплиментарности сиквенсов. Оставили Такман и поменяли праймеры на самопальные - всё заработало нормально. Вобщем мораль - всё обязательно нужно тестировать и валидировать. Если лаба диагностическая, стабильность primer/probe mix, или в Вашем случае PCR mix, - валидация с подробной документацией обязательна. Кстати я бы лучше хранил приготовленные реакции на - 80 оС, а не - 20 оС. |
|
elektrikvasilij | Отправлен 20.08.2019 19:55 |
(X34 @ 20.08.2019 14:24) да все просто, чистые прямые руки. вот и все. по своим ощущениям праймеры, валяющиеся на +4 после синтеза (врать не буду) НО! -надцать лет работали получше свежих от современных евросинтологенов ну и стоки конечно вьюношам в руки не давать хотя не спорю, есть отдельные структуры (последовательности) которые сами сыпятся через пару дней после синтеза, но, как горит Карпов "наливай, сейчас я тебе что-то интересное расскажу, ты не поверишь, но бывает...." угу я в германии однажды заказал килограмм 60 нт олигов спотит микроарреи все сиквенсы перепутаны и фейк правда потом извинилис? но полгода онанизьма |
|
-Ъ- | Отправлен 20.08.2019 17:33 |
(X34 @ 20.08.2019 14:24) но, как горит Карпов "наливай, сейчас я тебе что-то интересное расскажу, ты не поверишь, но бывает...." |
|
X34 | Отправлен 20.08.2019 13:24 |
(DK. @ 20.08.2019 00:05) да все просто, чистые прямые руки. вот и все. по своим ощущениям праймеры, валяющиеся на +4 после синтеза (врать не буду) НО! -надцать лет работали получше свежих от современных евросинтологенов ну и стоки конечно вьюношам в руки не давать хотя не спорю, есть отдельные структуры (последовательности) которые сами сыпятся через пару дней после синтеза, но, как горит Карпов "наливай, сейчас я тебе что-то интересное расскажу, ты не поверишь, но бывает...." |
|
DK. | Отправлен 19.08.2019 23:05 |
Спрошу здесь. чтобы не множить темы. У нас для q-PCR используется небольшой инструмент "Nano" от Roche - четыре ряда для "цепочек" на 8 проб (7 образцов и контроль). Вдохновившись тем, что существуют киты с праймерами, лиофилизованными в лунках, стали разливать праймеры (4 мкл для конечной реакции 20 мкл) сразу на 12 и даже 24 "цепочки" (chains), залеплять плашку с "цепочками" плотно plate sealer-ом, центрифугировать, чтобы собрать раствор на дне - и хранить при -20С, используя по мере необходимости и избегая многократного размораживания-оттаивания и манипуляций с основным раствором праймеров. Удобно. Результаты между свежеразлитыми и хранившимися(по крайней мере до двух недель) праймерами ОК, в пределах ожидаемого разброса. Но все-таки это не лиофилизация - может, мне просто повезло со стабильностью праймеров? У кого какие опыт/соображения на сей счет, кроме как "сами дальше и тестируйте"? |
|
ship | Отправлен 13.02.2019 12:38 |
праймеры для сиквенса стоят разведенные на -20С годами и переживают десятки замораживаний-оттиваний. некоторые праймеры стоят по 10 лет - и работают на сиквенсе без проблем. считаю проблемы развала и деградации праймеров надуманной, если вода чистая и ничего не занесли, то ничего им и не будет. по поводу урны - зачем дерьмо хранить в чистой зоне? обычно мусорные ведра всегда стоят рядом, на полу. но если у вас лентивирусы например, то тогда, да, лучше скидывать все в урны под ламинаром, и потом это все дезинфицировать и тп. |
|
KCN | Отправлен 12.02.2019 12:28 |
С мечеными праймерами не работал, использовал только обычные + SYBR GREEN, как лиофилизированные так и разведенные аликвоты хранил на -20, желательно в nuclease free water если аликвотишь. Обычная ДНК не боится видимого света, только УФ, но стекло окон его большей частью не пропускает, поэтому во время работы вполне могут стоять на столе или в ламинаре. Но УФ , не убрав любую ДНК, включать нельзя. И, кстати, на трансилюминаторе ДНК в агарозе по часу тоже не желательно держать, нужно фоткать или резать быстро. Есть разные типы трансилюминаторов, отличаются по длине волны. Те, где волна короче, подсвечивают этидий бромид лучше, но и ДНК калечат быстрее. |
|
-Ъ- | Отправлен 12.02.2019 12:21 |
Кстати, о птичках... Недавно решил испытать лиофилизованные PCR мастермиксы, которые валялись более года на свету на столе, с TaqMan, даже с двумя - с FAM и ROX, и был "приятно удивлен" - незначительное статистически снижение сигнала! В деталях лень разбираться - это полимераза с антителами, dNTP, гидролиз праймеров-зондов или наконец фотолиз . Так что не так страшен черт... |
|
Посмотреть тему (откроется в новом окне) | |