Rambler's Top100
Лёгкая версия форума* Виртуальная клавиатура  English  
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы
Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Междисциплинарный биологический онлайн-журналZbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ


Темы за 24 часа  [ Вход* | Регистрация* ]  
   



Форум: 
 

Щёлкните, чтобы внести в Избранные Темы* Оптимизация эффективности реал-тайм пцр (TaqMan)
ИнтерЛабСервис - передовые технологии молекулярной диагностики
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.


 
Добавить сообщение в темуСоздать новую темуСоздать голосование
Участник оффлайн! alkhimmikk

UQ



 прочитанное сообщение 21.12.2009 18:49     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #1 множественное цитирование

Здраствуйте!

у меня в процесе оптимизации реал тайма возникли некоторые трудности, может вы, у кого есть опыт в таких делах, чем-то поможете и/или посоветуете.

так вот. имеем: мультиплекс пцр такмановский (красители - фам и р6ж), составляющие - силексовские и интерлабовские реактивы, полимераза - самодельная, праймеры - синтоловские. аппарат - Ротор3000.
причем мультиплексных систем - 2.

Эффективность считаем по Тихопаду (с маленькими модификациями)
1. по красителям получеться, что фам дает эффективность 1,04-1,06, а по р6ж - 1,22-1,26.
в дальнейшем выбрана была одна система для экономии реактивов.
2. проводилась оптимизация смеси по всем компонентам смеси - как количественно, так и качественно.
3. додавались следующие адьюванты: ДМСО, бета-меркаптоэтанол, БСА, Твин-20, калий хлорид и аммоний сульфат. изменения эффективности были зафиксированы в рамках статистической погрешности - 0,01-0,05.

что еще можно сделать - просто не охота изголяться математически.

Спасибо за ответы...
Участник оффлайн! Derro
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 21.12.2009 22:12     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #2 множественное цитирование

Картинки дайте.
Участник оффлайн! Statin
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 21.12.2009 22:25     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #3 множественное цитирование

Согласен, "картинку в студию". И что-то напрягают интерлабовские реактивы и полимераза собственная, вы в них уверены?

Сообщение было отредактировано Statin - 21.12.2009 22:27
Участник оффлайн! alkhimmikk

UQ



 прочитанное сообщение 22.12.2009 12:37     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #4 множественное цитирование

Вот картинки - с последнего.
Если надо могу и сырые данные выложить...

Картинки:
 картинки уже нет на сайте: RT_PCR_curves.JPG RT_PCR_curves.JPG — (92.31к) 22.12.2009 — 05.01.2010  


Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): Galya4595
Участник оффлайн! Wola
Участник
Москва



 прочитанное сообщение 22.12.2009 16:10     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #5 множественное цитирование

А как это "эффективность считаем по Тихопаду", расскажите пож-та.

А еще - Вы по раздельности (не в мультиплексе) проверяли эффективность, она совпадает с эффективностью в мультиплексе?
Участник оффлайн! alkhimmikk

UQ



 прочитанное сообщение 22.12.2009 17:01     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #6 множественное цитирование

1. берем сырые данные, считаем производную и на накотором участке (определяеться по полученой производной). проверяем как полученая кривая ложиться на експоненциальную кривую, заданую некоторым уравнением (которое находим). получаем кравнение типа у=11,18+1,04^x, где 1,04 и будет эффективность.

2. что отдельно, что вместе - одинаково.
Участник оффлайн! Statin
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 22.12.2009 19:30     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #7 множественное цитирование

Эффективность действительно низкая, делайте другие праймеры, Таqman плохо поддается оптимизации, если уж не пошло (при простом подборе температуры), то лучше не тратить время и делать новые праймеры.
Участник оффлайн! Guest1
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 22.12.2009 20:29     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #8 множественное цитирование

(Derro @ 21.12.2009 23:12)
Ссылка на исходное сообщение  Картинки дайте.


smile.gif
Участник оффлайн! Guest1
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 22.12.2009 20:32     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #9 множественное цитирование

(Statin @ 22.12.2009 20:30)
Ссылка на исходное сообщение  Эффективность действительно низкая, делайте другие праймеры, Таяман плохо поддается оптимизации, если уж не пошло (при простом подборе температуры), то лучше не тратить время и делать новые праймеры.


угу 1. выделять ДНКу-РНКу, 2. "какая ссцуко подкинула микс" для ТакМан ?
а в остальном - "ДНК-Технология" с Ребриковым впридачу smile.gif
Участник оффлайн! Guest1
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 22.12.2009 20:36     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #10 множественное цитирование

(alkhimmikk @ 21.12.2009 19:49)
Ссылка на исходное сообщение  Здраствуйте!

у меня в процесе оптимизации реал тайма возникли некоторые трудности, может вы, у кого есть опыт в таких делах,  чем-то поможете и/или посоветуете.

так вот. имеем: мультиплекс пцр такмановский (красители - фам и р6ж), составляющие - силексовские и интерлабовские реактивы, полимераза - самодельная, праймеры - синтоловские. аппарат - Ротор3000. 
причем мультиплексных систем - 2.

Эффективность считаем по Тихопаду (с маленькими модификациями)
1. по красителям получеться, что  фам дает эффективность 1,04-1,06, а по р6ж - 1,22-1,26.
в дальнейшем выбрана была одна система для экономии реактивов.
2. проводилась оптимизация смеси по всем компонентам смеси - как количественно, так и качественно.
3. додавались следующие адьюванты: ДМСО, бета-меркаптоэтанол, БСА, Твин-20, калий хлорид и аммоний сульфат. изменения эффективности были зафиксированы в рамках статистической погрешности - 0,01-0,05.

что еще можно сделать - просто не охота изголяться математически.

Спасибо за ответы...


берите праймрты и гоните методом "украинского тыка" - ТакМан по другому не подгоните
Участник оффлайн! Guest1
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 22.12.2009 21:12     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #11 множественное цитирование

(Statin @ 22.12.2009 20:30)
Ссылка на исходное сообщение  Эффективность действительно низкая, делайте другие праймеры, Таяман плохо поддается оптимизации, если уж не пошло (при простом подборе температуры), то лучше не тратить время и делать новые праймеры.


smile.gif примерно : - "лиш бы дитя ни тешилось- лишь бы не вешалось" smile.gif
Участник оффлайн! Guest1
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 22.12.2009 21:18     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #12 множественное цитирование

(Statin @ 22.12.2009 20:30)
Ссылка на исходное сообщение  Эффективность действительно низкая, делайте другие праймеры, Таяман плохо поддается оптимизации, если уж не пошло (при простом подборе температуры), то лучше не тратить время и делать новые праймеры.


может и не ТакМан - объем смеси - 20 миклов не менее - протокол циклирования -
95 градусов - 15 секунд , 60 градусов- 1 минута - 40 циклов smile.gif
Участник оффлайн! Guest1
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 22.12.2009 21:20     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #13 множественное цитирование

(alkhimmikk @ 21.12.2009 19:49)
Ссылка на исходное сообщение  Здраствуйте!

у меня в процесе оптимизации реал тайма возникли некоторые трудности, может вы, у кого есть опыт в таких делах,  чем-то поможете и/или посоветуете.

так вот. имеем: мультиплекс пцр такмановский (красители - фам и р6ж), составляющие - силексовские и интерлабовские реактивы, полимераза - самодельная, праймеры - синтоловские. аппарат - Ротор3000. 
причем мультиплексных систем - 2.

Эффективность считаем по Тихопаду (с маленькими модификациями)
1. по красителям получеться, что  фам дает эффективность 1,04-1,06, а по р6ж - 1,22-1,26.
в дальнейшем выбрана была одна система для экономии реактивов.
2. проводилась оптимизация смеси по всем компонентам смеси - как количественно, так и качественно.
3. додавались следующие адьюванты: ДМСО, бета-меркаптоэтанол, БСА, Твин-20, калий хлорид и аммоний сульфат. изменения эффективности были зафиксированы в рамках статистической погрешности - 0,01-0,05.

что еще можно сделать - просто не охота изголяться математически.

Спасибо за ответы...


графики рисуйте в логарифме - кому нафик нужны ваши "картинки" smile.gif
Участник оффлайн! Guest1
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 22.12.2009 21:28     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #14 множественное цитирование

(alkhimmikk @ 21.12.2009 19:49)
Ссылка на исходное сообщение  Здраствуйте!

у меня в процесе оптимизации реал тайма возникли некоторые трудности, может вы, у кого есть опыт в таких делах,  чем-то поможете и/или посоветуете.

так вот. имеем: мультиплекс пцр такмановский (красители - фам и р6ж), составляющие - силексовские и интерлабовские реактивы, полимераза - самодельная, праймеры - синтоловские. аппарат - Ротор3000. 
причем мультиплексных систем - 2.

Эффективность считаем по Тихопаду (с маленькими модификациями)
1. по красителям получеться, что  фам дает эффективность 1,04-1,06, а по р6ж - 1,22-1,26.
в дальнейшем выбрана была одна система для экономии реактивов.
2. проводилась оптимизация смеси по всем компонентам смеси - как количественно, так и качественно.
3. додавались следующие адьюванты: ДМСО, бета-меркаптоэтанол, БСА, Твин-20, калий хлорид и аммоний сульфат. изменения эффективности были зафиксированы в рамках статистической погрешности - 0,01-0,05.

что еще можно сделать - просто не охота изголяться математически.

Спасибо за ответы...


хорошоб калибровку на плазмиде 1:10 выставить
Участник оффлайн! alkhimmikk

UQ



 прочитанное сообщение 23.12.2009 13:18     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #15 множественное цитирование

Спасибо всем за совето-ответы. smile.gif

для Guest1 - картинки в логарифмах.

о праймерах: они из статьи, там использувались расходники аби и призм 7700.
у нас же все отдельное - буфер, дНТП, полимераза и т.д..

режим 95 - 30с, 60 - 60с, 40 циклов, в 25мкл.

"тыкаюсь" уже в разных направлениях. может есть еще какие-то направления для "тыканья" smile.gif ?

Картинки:
 картинки уже нет на сайте: RT_PCR_curves_log.JPG RT_PCR_curves_log.JPG — (104.58к) 23.12.2009 — 06.01.2010  
Участник оффлайн! Qzak
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 23.12.2009 17:16     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #16 множественное цитирование

Привет!
Возьми заведомо рабочие праймеры и зонд (например те b2M что я оставлял) и прогони их на твоей системе. Сразу поймешь, в чем проблема - в qPCR системе или в праймерах.
Участник оффлайн! alkhimmikk

UQ



 прочитанное сообщение 23.12.2009 18:24     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #17 множественное цитирование

(Qzak @ 23.12.2009 17:16)
Ссылка на исходное сообщение  Привет!
Возьми заведомо рабочие праймеры и зонд (например те b2M что я оставлял) и прогони их на твоей системе. Сразу поймешь, в чем проблема - в qPCR системе или в праймерах.


Спасибо, точно, не подумал...

ЗЫ: привет! smile.gif

Сообщение было отредактировано alkhimmikk - 23.12.2009 18:25

*




Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.
Имя:

 преобразовывать смайлики · показать смайлики
Назначение кнопок:

   Поблагодарить автора сообщения — поблагодарить автора
   Удалить сообщение — удалить
   Редактировать сообщение — редактировать
   Поместить сообщение в колонку новостей — поместить в колонку новостей
   Цитировать — цитировать сообщение
   не входит в цитирование/входит в цитирование — цитировать несколько
   Отметить СПАМ-сообщение — обозначить спам
   Сообщение для модератора — связь с модератором
   Участник онлайн!/Участник оффлайн! — автор онлайн/оффлайн
   Фотография — фотография автора

   - остальные обозначения -
 
   *
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема »
Быстрый ответДобавить сообщение в темуСоздать новую тему

Rambler   molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов              

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Ваш форум  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама  ·  Дата и время: 12.11.19 02:27
Bridged By IpbWiki: Integration Of Invision Power Board and MediaWiki © GlobalSoft