Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
pHLIP |
Уже снится вся эта ахинея, есть какие-нибудь догадки, куда копать? :щалл: Сообщение было отредактировано pHLIP - 23.03.2017 19:39 |
ship Постоянный участник Moscow |
зачем дефосфолирировать вектор ппри липком лигировании по двум разным сайтам? не занимайтесь ерундой. вставку надеюсь не дефосфорилировали? ибо из текста это не очевидно. зачем вообще пцр с колоний? не судьба выделить минипрепы и порезать бам-хинд? как положительный контроль может быть без вставки? это контроль на то, что пцр в целом идет? "форез показал наличие вставки" - фореза показал что, чтото отПЦРилось. вы вектор в итоге резали по бам-хинд или только на пцр смотрели?? |
MMM Постоянный участник |
|
sceptique Постоянный участник временной жизни |
Сообщение было отредактировано sceptique - 28.03.2017 13:57 |
ship Постоянный участник Moscow |
(sceptique @ 28.03.2017 11:57) Клонируйте вставку по тупым концам, не майтесь этим всем. Потом задачей останется лишь найти инсерт в правильной ориентации, а это Вы уже умеете, судя по посту. Ай да совет! А про рамку считывания ты не слышал? Или тупое клонирование у нас стало эффективнее и проще липкого? Да еще и клоны потом с ориентацией отбирать... Или людям надо сменить вообще стратегию и делать новую вставку с тупым сайтом, вместо двух липких и удобных? Ради дополнительного гемора? |
sceptique Постоянный участник временной жизни |
Рамка считывания - это вообще красиво сказано да, лишних 3 нуклеотида нового старт-кодона во флаг воткнуть в праймер 5` - это очень сложно, да. Сообщение было отредактировано sceptique - 28.03.2017 20:26 |
Esya Постоянный участник PA, USA |
совсем детский контроль - нанести лигазные смеси на форез -- если все порезано правильно и все лигируется - вставка должна образовывать тримеры, если неправильно - димеры и тримеры, также в случае успешного лигирования, векторная полоса уходит вверх (но в вашем случае, нужны разные концентрации агарозы, что утомительно...) ЗЫ для того чтобы увидеть это, лигировать нужно достаточно высокие концентрации |
ship Постоянный участник Moscow |
(sceptique @ 28.03.2017 18:24) Всегда это когда и где? Если ты так один раз сделал по какой то причине, то это не повод советовать это. Липкое клонирование по двум сайтам - удобнее, быстрее и и эффективнее. и тут даже говорить не о чем. У людей просто не клонируется - и надо выяснить почему, а не менять дизайн клонирования, да еще и в менее эффетивную и более затратную сторону. |
sceptique Постоянный участник временной жизни |
У людей с этими липкими концами могут быть десятки причин для нерешаемых проблем, которые выяснять и оптимизировать - это несколько месяцев возни с негарантированным результатом. Можно просто взять (если на векторе есть!) сайт для резки с тупыми концами под промотором и сделать быстро и без проблем всё. И поступать так всегда, поскольку это технологичнее (возня лишь с поиском колонии с инсертом в правильной ориентации, но если их на чашке вырастет хоть 20-30, то 2-3 гарантированно найдутся среди них с таким результатом, и как минимум 1 без мутаций). Если тянет быть умным - можно трахаться с траблами с липкими концами и полгода, и ничего на выходе не получить. Я же говорю о технологии убирания из протокола клонирования тупыми концами большинства тонких мест взамен небольшой возне с ПЦР-скринингом колоний в конце. По сути, тупые концы резко повышают шансы с любой криворукостью добиться получения целевого вектора с инсертом с первой же попытки, если время на итерации и траблшутинг с подбором условий лигирования и отношения в нём инсерт/вектор, инактивацией рестриктаз, кучей очисток по дороге - не вариант. С тупыми концами порой бывает можно работать даже с не до конца инактивированной рестриктазой в растворе. |
ship Постоянный участник Moscow |
(sceptique @ 29.03.2017 11:34) Всегда - это всегда и везде. Клонирование по тупым концам - удобнее, быстрее и эффективнее, и тут действительно не о чем говорить. У людей с этими липкими концами могут быть десятки причин для нерешаемых проблем, которые выяснять и оптимизировать - это несколько месяцев возни с негарантированным результатом. Можно просто взять (если на векторе есть!) сайт для резки с тупыми концами под промотором и сделать быстро и без проблем всё. И поступать так всегда, поскольку это технологичнее (возня лишь с поиском колонии с инсертом в правильной ориентации, но если их на чашке вырастет хоть 20-30, то 2-3 гарантированно найдутся среди них с таким результатом, и как минимум 1 без мутаций). Если тянет быть умным - можно трахаться с траблами с липкими концами и полгода, и ничего на выходе не получить. Я же говорю о технологии убирания из протокола клонирования тупыми концами большинства тонких мест взамен небольшой возне с ПЦР-скринингом колоний в конце. По сути, тупые концы резко повышают шансы с любой криворукостью добиться получения целевого вектора с инсертом с первой же попытки, если время на итерации и траблшутинг с подбором условий лигирования и отношения в нём инсерт/вектор, инактивацией рестриктаз, кучей очисток по дороге - не вариант. С тупыми концами порой бывает можно работать даже с не до конца инактивированной рестриктазой в растворе. Это все твои фантазии и теоретические изыскания , ничего не имеющие общего с реальностью. Мастер теоретического клонирования. Сразу видно что сам ничего не делал. Но на форуме очень хочется что-то написать. |
R.J.Dio Постоянный участник |
Думаю, проблма как раз не в лигировании, а в ПЦР с колоний. С каких праймеров скринили, сколько циклов давали, и вообще, как ставили этот пресловутый ПЦР- с колоний сразу, или ресуспендировали в чем-либо и брали аликвоту- все это влияет на циклы. Что пришло на "положит." контроле, кторый, по факту, суть отрицательный. Ну и тп. У нас эти рЕТы пачками идут, и проблем уже годы и годы, как никаких нет, ни с рестрикцией, ни с послед. манипуляциями. Ну, и конечно, никаких дефрсфорилирований в данном случае, это автора топика запугали старшие товарисчи, которые еще из того поколения, кторое умело читать, хотя бы и Маниатиса. Нынешнее только ОК, Гугл знает, а там голос зачитывает искомое |
Tuco Ramires Постоянный участник Rio Grande |
(sceptique @ 29.03.2017 14:34) Всегда - это всегда и везде. Клонирование по тупым концам - удобнее, быстрее и эффективнее, и тут действительно не о чем говорить. Картинки: WTF.gif — (1.6мб) |
R.J.Dio Постоянный участник |
|
sceptique Постоянный участник временной жизни |
(ship @ 29.03.2017 14:53) Это все твои фантазии и теоретические изыскания , ничего не имеющие общего с реальностью. Мастер теоретического клонирования. Сразу видно что сам ничего не делал. Но на форуме очень хочется что-то написать. Кому видно? Я как раз пробовал и то и то. И знаю о чем пишу. С клонированием по тупым концам любой школьник даже вообще без мозга справится с первого раза по инструкции к киту. Чего не скажешь о том же протоколе по липким. |
R.J.Dio Постоянный участник |
|
ship Постоянный участник Moscow |
(sceptique @ 29.03.2017 21:55) Кому видно? Я как раз пробовал и то и то. И знаю о чем пишу. С клонированием по тупым концам любой школьник даже вообще без мозга справится с первого раза по инструкции к киту. Чего не скажешь о том же протоколе по липким. киты для тупого клонированияя замечательная вещь и действительно все отлично работает. но есть один нюанс - это киты для клонирования ПЦР продуктов. Таким образом, получается, что ты советуешь топикстартеру сделать новые праймеры, поставить ПЦР и заклонировать его вставку в вектор для клонирования тупых ПЦР продуктов, вместо специфического экспрессионного вектора pET? или может Новаген выпуcтили кит для клонирования тупых фрагментов в их вектора pET? |
R.J.Dio Постоянный участник |
|
ship Постоянный участник Moscow |
(R.J.Dio @ 30.03.2017 10:02) да вы поймите- для прецизионного клонирования не может быть универсальных тупых векторов, о чем тут ваще... об этом и речь, жаль топикстартер пропал. |
bio101 |
|
bio101 |
|
bio101 |
|
sceptique Постоянный участник временной жизни |
(R.J.Dio @ 30.03.2017 13:02) да вы поймите- для прецизионного клонирования не может быть универсальных тупых векторов, о чем тут ваще... После того, как я начитался всякой хрени про великих разработчиков, которые 100 лет назад подсадили под Т7 аж 1399637193 сайтов для рестрикции и теперь все будут прецизионно втыкать свой инсерт в свою точку по липким концам, то верил что всё так и это и правда интересно и нужно. Но после первого же реального клонирования по тупым концам (я сейчас даже уже не помню что это за вектор был, pET какой-то из 20-ых), которое завершилось нормальной полосой белка после индукции на геле через месяц от получения плазмиды-шаблона с инсертом, причем я никуда не торопился и ничего не оптимизировал особо из стандартных реакций рестриктазы и др. ферментов и клеток, я просто понял что я был идиотом и читал не те учебники похоже. Которые сильно устарели, если нужен белок на выходе за кратчайшее время, а не траханье по ночам с подбором условий рестрикций, отношений инсерт-вектор и многократных пересевов и повторов лигазных реакций инсерт-вектор, на выходе которых после трансформации ничего не вырастает и ты постоянно занят траблшутингом никому не нужного и не интересного этапа вместо исследований целевого белка. Туко, воткни каку-нить тупую картинку в ответ опять, одминке они нравятся. Сообщение было отредактировано sceptique - 04.04.2017 11:34 |
bio101 |
|
Mykhaylo Постоянный участник Україна |
(ship @ 29.03.2017 12:53) Это все твои фантазии и теоретические изыскания , ничего не имеющие общего с реальностью. Мастер теоретического клонирования. Сразу видно что сам ничего не делал. Но на форуме очень хочется что-то написать. Да прямо таки. Ну и я клонирую в 95% по тупым лежат себе в холодильнике 32a-c (про "сложность" рамки тут что-то было) уже порезаные, почищеные, дефосорилированые - работают до 2-3 лет. Когда нужно взял и заклонировал. И скринирую таки ПЦРом - по 10 кучей в одной смеси (обычно 3-4 реакции), потом позитивный десяток индивидуально, нужный - минипреп, рестрикция и на сиквенс. Неделя, максимум две времени. А что до "разницы в экспресии, активности и пр" по тупым и липким - просветите в чем разница если все сайты в полилинкере? Может чего нового узнаю А по теме топика - с компетентными все хорошо ибо когда получаю 5-10 колоний то предпочитаю другие компетентные взять, чем анализировать невесть что полумертвое. Тем более если с "газона" у вас ПЦР скрин прошел. Но смотрели то вы не отдельную колонию, а смесь (я же так понял что до отдельных Вы не рассевали? Хотя можно было газон петлей на 2-3 чашки рассеять и проанализировать уже отдельные колонии и с ними и работать дальше, если лень переделать). Ведь если бахнуть смесь колоний со вставкой и без оной - одному Богу известно что победит в неравной схватке, не говоря о том что вы же для экспресии делаете.
|
ship Постоянный участник Moscow |
(Mykhaylo @ 04.04.2017 12:19) А что до "разницы в экспресии, активности и пр" по тупым и липким - просветите в чем разница если все сайты в полилинкере? Может чего нового узнаю это вообще о чем речь???? |
ship Постоянный участник Moscow |
(Mykhaylo @ 04.04.2017 12:19) Да прямо таки. Ну и я клонирую в 95% по тупым лежат себе в холодильнике 32a-c (про "сложность" рамки тут что-то было) уже порезаные, почищеные, дефосорилированые - работают до 2-3 лет. Когда нужно взял и заклонировал. И скринирую таки ПЦРом - по 10 кучей в одной смеси (обычно 3-4 реакции), потом позитивный десяток индивидуально, нужный - минипреп, рестрикция и на сиквенс. Неделя, максимум две времени. Я где говорил, что втупую нельзя клонировать? Нравится- пожалуйста. Рациональный и эффективный ли это путь? Нет. Неделя-две работы на одну плазмиду? Я правильно понял? После этого, как бы, дальше можно вообще ничего не обсуждать.
|
ship Постоянный участник Moscow |
(sceptique @ 04.04.2017 09:29) Которые сильно устарели, если нужен белок на выходе за кратчайшее время, а не траханье по ночам с подбором условий рестрикций, отношений инсерт-вектор и многократных пересевов и повторов лигазных реакций инсерт-вектор, на выходе которых после трансформации ничего не вырастает и ты постоянно занят траблшутингом никому не нужного и не интересного этапа вместо исследований целевого белка. То есть, не получилось липкое клонирование, но один раз получилось тупое, значит тупое эффективнее проще и лучше? Я тебе могу открыть несколько секретов клонирования по липким сайтам, если придешь ко мне на студенческий практикум. Я даже слоган придумал: Экспрессионная плазмида за 3 дня -миф или реальность? Или как перестать бояться и начать клонировать в липкую. |
NMR-guy Постоянный участник временной жизни |
По липким у меня получалось белка 2-3, не с первого раза конечно. Но некоторые "секреты" там я уяснил. Там их слишком много, даже. И они никому не нужны, поскольку есть тупые концы. Если пользовать порезанные по ним векторы как стоки - то и за 2 дня можно вектор готовый соорудить, а за 3 - засунуть сток в DH5a в криобиблиотеку, если нужен именно инсерт в плазмиде, и есть секвенатор для проверки. Если конечная цель - белок - то 4-5 дней, или неделя, чтобы пилотно индукцию проверить. Если работать спокойно - то 2 недели. Да, я в своей жизни ни от чего не зарекаюсь, но, боюсь, что клонировать мне что-либо в плазмиды до конца моего земного существования уже незачем. |
ship Постоянный участник Moscow |
|
NMR-guy Постоянный участник временной жизни |
|
ship Постоянный участник Moscow |
(NMR-guy @ 04.04.2017 13:51) Угу, да. Тема как раз об этом. Напиши в личке топикстартеру и научи его всему - так хоть какая-то будет польза от этой древней технологии прошлого тысячелетия... |
Mykhaylo Постоянный участник Україна |
(ship @ 04.04.2017 14:22) Неделя-две работы на одну плазмиду? Я правильно понял? После этого, как бы, дальше можно вообще ничего не обсуждать. Да с вами никто ничего и не обсуждает, это вы всех жизни учите Да, 1- 2 недели на цикл (а одна там вставка или 6 (больше никогда не делал) уже особо роли не играет). Это от ПЦР до сиквенса и пробной экспресии (иногда с нашими реалиями сиквенс затягивается и на месяц, но то такое). Я не занимаюсь потоковыми клонированиями на продажу, мне торопиться некуда. И можете меня называть хронофагом и т.д., но за 27 лет работы я понял, что лучше потратить лишний день, чем переделывать что-то неделю Я (ну или студентов подпрягаю для тренировки не суть важно) еще и, представте, первичные трансформы перекалываю по квадратам - штук так 40 колоний на 2 чашки и только на след день уже их скринирую, а вторая чашка с резерве стоит. И плазмиды выделяю не китом, а щелочным за 30 мин. И если у кого-то фломастеры другого цвета - это не значит , что ими писать нельзя
|
bio101 |
|
Mykhaylo Постоянный участник Україна |
|
Tuco Ramires Постоянный участник Rio Grande |
(NMR-guy @ 04.04.2017 16:38) По липким у меня получалось белка 2-3, не с первого раза конечно. Но некоторые "секреты" там я уяснил. Там их слишком много, даже. То есть 2 - 3 и не с первого раза. Но ты уже все понял. В первую очередь - что секретов много... (sceptique @ 04.04.2017 12:29) а не траханье по ночам с подбором условий рестрикций, отношений инсерт-вектор и многократных пересевов и повторов лигазных реакций Брат, скажи, что я делаю не так? Я просто смешиваю порезанные по липким (иногда и по тупым - но это ничего не меняет) концам и очищенные вектор и вставку, лигирую, трансформирую - и получаю десятки или сотни колоний. Проверяю пару, редко три-четыре - и все. Готово. И так уже много сотен лигирований. Какие еще в задницу подборы условий рестрикции (чистая ДНК, работающий фремент и четкое следование протоколу - все! Все порежется), какие нахер отношения инсерт-вектор (если аликвоты вектора и вставки различимы в геле - все залигируется; если же нет - возможно тоже; поэтому частенько даже не смотрю на форезе аликвоты перед лигированием). Как мне добиться такой насыщенной ночной работы и многократных пересевов, как у тебя? Сообщение было отредактировано yack - 06.04.2017 11:03
|
bio101 |
(Tuco Ramires @ 05.04.2017 12:58) О возлюбленный брат мой, сколько лет сколько зим, прости что сразу не признал! А ведь мог бы: по тому, как уверенно и безапелляционно ты несешь херню... Так будоражащая тебя Одминка - она в "Беседе", а ты сейчас на профильный форум забрел. То есть 2 - 3 и не с первого раза. Но ты уже все понял. В первую очередь - что секретов много... Брат, скажи, что я делаю не так? Я просто смешиваю порезанные по липким (иногда и по тупым - но это ничего не меняет) концам и очищенные вектор и вставку, лигирую, трансформирую - и получаю десятки или сотни колоний. Проверяю пару, редко три-четыре - и все. Готово. И так уже много сотен лигирований. Какие еще в задницу подборы условий рестрикции (чистая ДНК, работающий фремент и четкое следование протоколу - все! Все порежется), какие нахер отношения инсерт-вектор (если аликвоты вектора и вставки различимы в геле - все залигируется; если же нет - возможно тоже; поэтому частенько даже не смотрю на форезе аликвоты перед лигированием). Как мне добиться такой насыщенной ночной работы и многократных пересевов, как у тебя? тренироваться надо, любить это дело, много о нем говорить, и вообще, цель- ничто, движенье -все. А Вы, понимашь...слил, добавил, посеял. Опять получилось 100%, как всегда. Скукотища...
|
NMR-guy Постоянный участник временной жизни |
Как только возник обход всякой хрени собачьей, с которой он у себя воюет - сразу выползли все мастера клонирования и стали обливать своим величием тех, кто знает путь в обход, пользуется им и не заморачивается. Клонируйте по липким концам - клонируйте, если считаете, что у вас получается, и дайте жить и работать тем, кто умеет работать по-другому и более надежно. |
bio101 |
|
LMP Постоянный участник |
(NMR-guy @ 06.04.2017 10:07) Ну тут же часть оппонентов из фирм (иногда даже понятно каких). Они секретами не торгуют Но частенько не берут в расчет того, что не все и не всегда могут легко купить то, на чем они рутинно делают свои бабки, включая супер-хорошо работающие ферменты.
|
bio101 |
|
NMR-guy Постоянный участник временной жизни |
Мир пошел уже давно клонированием по тупым концам, этого уже не изменить, как не изменить того, что прочитать геном скоро будет дешевле, чем определить 10 точечных мутаций в геноме 20 лет назад. |
bio101 |
|
Tuco Ramires Постоянный участник Rio Grande |
Брат, честно скажу: я раньше с благоговением и почтением внимал твоим текстам, посвященным NMR etc. (сам-то я в этом ни уха, ни рыла). Но теперь, когда я наблюдаю такие же апломб и уверенность в вопросе, в котором я худо-бедно разбираюсь, меня начинают терзать смутные сомнения в твоей компетентности вообще Да и в целом сам предмет дискуссии доставляет невероятно... Тупоконечники схватились с липкоконечниками, понимаешь! ....Поводом к войне послужили следующие обстоятельства. Всеми разделяется убеждение, что вареные яйца при употреблении их в пищу испокон веков разбивались с тупого конца; но дед нынешнего императора, будучи ребенком, порезал себе палец за завтраком, разбивая яйцо означенным древним способом. Тогда император, отец ребенка, обнародовал указ, предписывающий всем его подданным под страхом строгого наказания разбивать яйца с острого конца. Этот закон до такой степени озлобил население, что, по словам наших летописей, был причиной шести восстаний, во время которых один император потерял жизнь, а другой – корону. Мятежи эти постоянно разжигались монархами Блефуску, а после их подавления изгнанники всегда находили приют в этой империи. Насчитывают до одиннадцати тысяч фанатиков, которые в течение этого времени пошли на казнь, лишь бы не разбивать яйца с острого конца. Были напечатаны сотни огромных томов, посвященных этой полемике, но книги Тупоконечников давно запрещены, и вся партия лишена законом права занимать государственные должности. В течение этих смут императоры Блефуску часто через своих посланников делали нам предостережения, обвиняя нас в церковном расколе путем нарушения основного догмата великого нашего пророка Люстрога, изложенного в пятьдесят четвертой главе Блундекраля (являющегося их Алькораном). Между тем это просто насильственное толкование текста, подлинные слова которого гласят: Все истинно верующие да разбивают яйца с того конца, с какого удобнее.... |
bio101 |
|
Tuco Ramires Постоянный участник Rio Grande |
|
sceptique Постоянный участник временной жизни |
|
RYM Постоянный участник |
(pHLIP @ 23.03.2017 19:37) Приветствую всех участников форума! Помогите кто чем сможет! В общем проблема такая: имеется вектор pET32а+; размер - 5900 п.о., имеется вставка - 135 п.о. Режу вектор и вставку рестриктазами BamH1 и Hind3, смотрю на форезе, выделяю из геля, дефосфорилирую, смотрю на форезе, выделяю из геля, ставлю быстрое лигирование, трансформирую компетентные клетки (XL Blue), на следующий день - по 5-6 колоний в среднем, ставлю ПЦР с колоний, в качестве положительного контроля - колония трансформированная тем же pET32а+ без вставки, в результате - ПЦР прошел только с положительным контролем. Проделываю уже который раз, ничего не меняется. В последний раз была та же история, но когда трансформированные клетки подросли в приличную "мазню", и когда я зачерпнул нехилый кусок колонии для ПЦР, то ПЦР прошел, форез показал наличие вставки в векторе, НО, полосы были ЕЛЕ видны! Тем не менее, обрадовавшись данному великому событию, поставил колонию на ночную культуру, на следующий день выделил вектор, однако форез показал намного более яркий бэнд совсем не там, где надо! Уже снится вся эта ахинея, есть какие-нибудь догадки, куда копать? :щалл: Топик-стартер разместил 1 сообщение на форуме и исчез. Видимо, проблема решена? Но тем временем на ветке разгорелись бои тупоконечников и липкоконечников. Я в эту битву вступать не хочу - прекрасно работает и то, и другое, если всё правильно сделано. Выскажу лишь мое мнение о том, почему, на мой взгляд, у ТС вначале ничего не получалось. 1. 99% за то, что пресловутые 5-6 колоний были бэкграундом (колонии без инсертов). ТС не упомянул о том, делал ли он позитивные и негативные контроли - один из таких контролей должен был быть лигирование вектора без инсерта (порезанная и дефосфорилированная плазмида, буфер, лигаза). С вероятностью 99%, он получил бы на таком контроле те самые 5-6 колоний. Вообще - это слишком мало, само число 5 колоний должно было сказать, что эксперимент не получился. 2. ТС не упомянул, как была получена вставка 135 п.о. - вырезана из другого вектора или это ПЦР продукт, обработанный рестриктазами. Думаю, что вряд ли вырезана из другого вектора - ну какие проблемы могут быть при субклонировании? Скорей всего, это ПЦР продукт. Если так, то как далеко от концов праймеров расположены сайты рестрикции? Рестриктазы не режут на самых концах, надо добавить еще несколько нуклеотидов. Так что, если это ПЦР продукт и сайты рестрикции расположены на самых концах, то он просто не порезался. В векторе pET32а+, между сайтами BamHI и HindIII расположены 3 других рестрикционных сайта, этого расстояния должно хватить для разрезания, так что вектор можно считать порезанным. Хотя на агарозном геле отличить вектор, порезанный одной рестриктазой от вектора, порезанного и BamHI, и HindIII, не удастся. 3. Если колоний так мало, зачем проверять их при помощи ПЦР? Почему бы просто не сделать минипрепы, не порезать плазмиды теми же BamHI и HindIII и не посмотреть на форезе? Возникает вопрос насчет праймеров для ПЦР: если вставка 135 п.о. это ПЦР продукт и для проверки после клонирования использовались те же праймеры, что и для получения вставки, то на первых циклах ПЦР после клонирования надо было значительно понизить температуру отжига (annealing), по сравнению с ПЦР перед клонированием. Было ли это сделано? Наиболее вероятной причиной неудачи с клонированием в данном случае я считаю проблемы с рестрикцией. |
Veshka Постоянный участник Москва |
Давно не нужно ничего вырезать, берёшь квакоджин или ещё чего и чистишь. Фосфатаза, да - тоже причина, но её легко проверить, порезав любой вектор и запихав туда чего-нито контрольное. Bam и Hind хватает по три нуклеотида с концов, чтобы большая часть разрезалась. Меньше не ставил, рестриктазы куда более капризные тоже есть. Сообщение было отредактировано Veshka - 16.06.2017 06:26
|
RYM Постоянный участник |
(Veshka @ 16.06.2017 06:24) По-моему всё очевидно. Агароза г-но. Я не помню, когда последний раз даже агароза от Lonza была хорошей (а это бывшая FMC GTG агароза, между прочим, ЕВПОЧЯ). Давно не нужно ничего вырезать, берёшь квакоджин или ещё чего и чистишь. Фосфатаза, да - тоже причина, но её легко проверить, порезав любой вектор и запихав туда чего-нито контрольное. Bam и Hind хватает по три нуклеотида с концов, чтобы большая часть разрезалась. Меньше не ставил, рестриктазы куда более капризные тоже есть. Если агароза г-о - то от любой дряни можно избавиться, пропустив через Centri-Sep spin columns (Princeton Separations). Это гель-фильтрация при центрифугировании. Или приготовить аналогичные мини-колонки самому, используя Эппендорфы с фильтрами и подходящий Сефадекс/Сефарозу (намного дешевле выйдет). Или вообще залить вырезанный кусок агарозы 10V ТЕ, подержать 5 мин, вылить ТЕ. Налить новый ТЕ, подержать 5 мин, вылить ТЕ. Мелко накрошить агарозу. Заморозить-оттаять 3 раза. Перенести супернатант в другую пробирку, ц/ф. Перенести супернатант в другую пробирку - лигировать плазмиду и вставку. А насчет "Давно не нужно ничего вырезать, берёшь квакоджин или ещё чего и чистишь" - что-то я сомневаюсь. Или неправильно понял - детализируйте. Меньше 6 нуклеотидов на концах я обычно не ставил, для гарантии. |
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |