Rambler's Top100
Лёгкая версия форума* Виртуальная клавиатура  English  
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы
Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Междисциплинарный биологический онлайн-журналZbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ


Темы за 24 часа  [ Вход* | Регистрация* ]  
   



Форум: 
 

Щёлкните, чтобы внести в Избранные Темы* Осаждение белков сульфатом аммония -- comments to a permanent page of the site --
ИнтерЛабСервис - передовые технологии молекулярной диагностики
Тема связана с: Осаждение сульфатом аммония
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.


Добавить сообщение в темуСоздать новую темуСоздать голосование
Участник оффлайн! Forum robot
Постоянный участник
на сервере в Москве



 прочитанное сообщение 11.01.2006 03:32     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #1 множественное цитирование

Комментарии к постоянной странице сайта: Осаждение белков сульфатом аммония

Осаждение белков сульфатом аммония. Классический (дешёвый и удобный) метод биохимии белков.
_pmaria_
IP-штамп: frftLGqhpFF.A
гость



 прочитанное сообщение 11.01.2006 03:32     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #2 множественное цитирование

Растворимость сульфата аммония в воде при 20 С около 5.7М, причем при 0 градусов снижается примерно на 0,5М, не верите, возьмите справочник, или проверьте сами.
_nafanin_
IP-штамп: frftLGqhpFF.A
гость



 прочитанное сообщение 11.01.2006 03:47     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #3 множественное цитирование

В разделе осаждение белков сульфатом аммония в примере с рассчётом ионной силы(второй случай), по-моему необходимо читать:I=1/2*(2*(1)^2+1*(2)^2), поскольку заряд сульфат иона, записанный в скобках во втором слагаемом, равен 2. Тогда и ответ получается верным
Участник оффлайн! genseq
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 12.01.2006 10:41     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #4 множественное цитирование

Изучал высаливание билихромопротеидов (фикоцианина и фикоэритрина) синезелёных водорослей в 1974 году. Белки ярко окрашены и за их поведением очень удобно наблюдать. При этих наблюдениях выяснилось, что "в действительности всё совсем не так, как на самом деле". Для полного перехода белков из раствора в осадок достаточно изменить насыщенность раствора сульфата аммония всего на 0,1...0,2%. Но осадок вблизи этой концентрации (точки осаждения) очень неустойчив. Растворяется даже от вибрации центрифуги. Поэтому для его отделения от раствора можно использовать только фильтрование, причём с очень низкими скоростями (1...2 мл/см2 в минуту). Сам знаю, что это противоречит всем канонам, но это было подтверждено не только фильтрованием, но и измерением оптической плотности растворов при различных концентрациях соли. При длительном стоянии растворов с повышающимися концентрациями сульфата аммония без вибрации и перемешивания оптическая плотность окрашенных белков на графике растворимости падает почти отвесно.
Гость
IP-штамп: frQN44LwKXabE
гость



 прочитанное сообщение 01.06.2006 13:51     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #5 множественное цитирование

Для осаждения иммуноглобулинов из желтка яиц, я использовал аммония сульфат в конечной концентрации 50%, однако центифугированием никак не удалось осадит преципитат.Во всех случаях получался пленка состаяшаяся из липопротеидов и иммуноглобулинов.
Участник оффлайн! Vladimir Matveev
Постоянный участник
Санкт-Петербург



 прочитанное сообщение 15.06.2006 10:58     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #6 множественное цитирование

Новейшие данные о рядах Гофмейстера читайте в статье:
Lo Nostro P, Ninham BW, Milani S, Lo Nostro A, Pesavento G, Baglioni P.
Hofmeister effects in supramolecular and biological systems.
Biophys Chem. 2006 Apr 26; (корректура)

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): bukach
Участник оффлайн! Майя




 прочитанное сообщение 04.03.2007 09:36     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #7 множественное цитирование

скажите пожалуйста как влияет размер белка на эффективность его высаливания сернокислым аммонием,
есть ли какая либо зависимость типа чем меньше белок тем хуже высаливается?
Участник оффлайн! Алексей Соколов
Постоянный участник
Санкт-Петербург



 прочитанное сообщение 04.03.2007 12:55     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #8 множественное цитирование

Для эффективности высаливания важнее конечная концентрация белка в растворе и соотношение гидрофильных и гидрофобных аминокислотных остатков на поверхности глобулы. Конечно, белки меньше 5-10 кДа высаливать труднее, потому что мелкие гидрофобные частицы слипаются и осаждаются хуже. Правда тут есть ухищрения: можно добавить несколько баластных белков (выпадающих при разных насыщающих концентрациях и, от которых потом легко избавиться) с ними легче соосаждаются маленькие белки в низкой концентрации.
Участник оффлайн! Fritz
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение Сообщение на английском  04.03.2007 14:30     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #9 множественное цитирование

2 Maya: A eshe mojno precipitirovat "bolshie" belki,esli takovie prisutstvujut v smesi,s pomoshju poliethylenglykolja 6000.Interesujushaja Vas "meloch" budet v supernatante plavat.Vy ego prosto skoncentrirujte potom v slide-A-lysere polojiv etu kameru s rastvorom na Sephadex ili PEG smile.gif
Guest
IP-штамп: fr3PpYUagJAXg
гость



 прочитанное сообщение 04.03.2007 17:50     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #10 множественное цитирование

Зависимость о размера есть, но не прямая. Лучше высаливаются кислые белки. Желательно работать при высокой концентрации белков. При низкой образование осадка идёт медленнее. По этой причине обычно рекомендуется использовать высаливание на самой первой стадии - для грубых экстрактов, содержащих большое количество примесей. При этом идёт сильное соосаждение, т.е. целевой белок захватывается осадком даже помимо своего "желания". Оптимальный вариант - это экстракционное высаливание, т.е. сначала осаждаете белок со всеми примесями, а потом растворяете осадок в дистиллированной воде и добавляете насыщенный раствор сульфата аммония в требуемой пропорции. Осадок растворяете и высаливаете повторно, но соотношение воды и соли понижаете, и т.д. Ко всем полученным супернатантам добавляете насыщенный раствор соли, центрифугируете и получаете серию осадков, в которых ищете свой белок. Если точка высаливания известна, то сразу ориентируетесь на требуемое соотношение воды и насыщенного раствора соли. Ступенчатую экстракцию можно проводить повторно и с различными интервалами процента насыщения раствора соли. Для крупных белков можно добиться осаждения в интервале 1...2% насыщения, причём без существенных потерь. Для мелких интервал требуется немного шире (3...5%).

Главное - дистиллированную воду брать только свежекипячёную. Иначе белки погибнут от "кессонной болезни".
Участник оффлайн! bukach
Постоянный участник
Geneva, Switzerland



 прочитанное сообщение 04.03.2007 22:59     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  ICQ
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #11 множественное цитирование

наверное, в общем и целом, маленькие белки будут высаливаться хуже. но и зависимость от других их свойств и от присутствия в растворе других белков тоже будет немалой.

помимо вышеуказанных способов, эффективность высаливания можно повысить еще
1. изменением рH. вблизи pI растворимость белка уменьшается.
2. увеличением температуры. например, до комнатной. с увеличением температуры гидрофобные взаимодействия, на которых преимущественно высаливание и зиждется, услиливаются. но это подойдет если интересующий белок достаточно термостабилен и не сильно подвержен протеолизу.

Сообщение было отредактировано bukach - 04.03.2007 23:01
Участник оффлайн! kenny




 прочитанное сообщение 04.03.2007 23:33     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #12 множественное цитирование

боюсь, с pH не шибко получится, потому что:
1) сернокислый аммоний сам изменяет рН - закисялет, так что вопрос - хватит ли буферной емкости
2) если и хватит - тот же самый сернокислый аммоний создает немалую ионную силу, так что кулоновские взаимодействия, на которых в основном основывается изоэлектрическое осаждение, будут невелироваться, думается

с температурой согласен
Участник оффлайн! bukach
Постоянный участник
Geneva, Switzerland



 прочитанное сообщение 05.03.2007 00:34     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  ICQ
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #13 множественное цитирование

(kenny @ 04.03.2007 23:33)
Ссылка на исходное сообщение  боюсь, с pH не шибко получится, потому что:
1) сернокислый аммоний сам изменяет рН - закисялет, так что вопрос - хватит ли буферной емкости
2) если и хватит - тот же самый сернокислый аммоний создает немалую ионную силу, так что кулоновские взаимодействия, на которых в основном основывается изоэлектрическое осаждение, будут невелироваться, думается


1. рН можно довести после добавления СА
2. правда ваша. но, думается, уменьшение электростатического отталкивания при приближении к pI будет способствовать лучшему "слипанию" и за счет гидрофобных взаимодействий.
как бы то ни было, но это работает. например, один из методов очистки ГАФД на этом основан.
Участник оффлайн! Fritz
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение Сообщение на английском  05.03.2007 11:03     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #14 множественное цитирование

2 Maya: A vy sluchem ne FEN NGU zakanchivali?
guest: Гость
IP-штамп: frVcIL7EFwe1.
гость



 прочитанное сообщение 09.04.2007 14:36     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #15 множественное цитирование

тиоцинат амония
Guest
IP-штамп: frDQwa9k7riYg
гость



 прочитанное сообщение 08.08.2007 06:02     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #16 множественное цитирование

При осаждени белка персульфатом аммония насколько важно чтоб центрифугирование проводилось с охлаждением? и достаточно ли 10000 т.о. (на цф типа эппендорф) минут пяти?
Участник оффлайн! форма жизни




 прочитанное сообщение 08.08.2007 08:44     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #17 множественное цитирование

Вы слегка перепутали. Персульфат аммония - реактив, который используется обычно для инициации полимеризации акриламидного геля. Белки фракционируют сульфатом аммония. Для осаждения (переосаждения) белков сульфатом не обязательно охлаждать все в процессе ц/ф. Вполне можно обойтись настольной высокооборотной центрифугой (эппендорф очень даже подходит). Условия ц/ф (время и обороты) зависят от конечной концентрации сульфата аммония в растворе.
Если конечная концентрация сульфата не превышает 0,8 насыщения (это около 3,2М или 0,55 г/мл) то можно крутить 10-12 тыс. об/мин, 3-4 мин. Только перед ц/ф предварительно охладите пробирки в холодильнике (лучше в морозилке, но не переусердствуйте, чтобы не замерзло все).
Guest
IP-штамп: frDQwa9k7riYg
гость



 прочитанное сообщение 08.08.2007 10:08     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #18 множественное цитирование

спасибо!
да что-то у меня замкнуло приписать ПЕР к сульфату...
guest: ммм
IP-штамп: frwzUkJeG5fZ.
гость



 прочитанное сообщение 08.08.2007 12:30     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #19 множественное цитирование

Кстати, иногда при высоких концентрациях сульфата белки не тонут, а всплывают.

Табличка насыщения сульфата дана при 0С, при комнате растворимость сульфата выше и следовательно процент насыщения при той же концентрации ниже. Но все это фигня, потаму чта сульфат есть грубый реагент и никакие тонкости не повысят точность фракционирования.
Участник оффлайн! genseq
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 09.08.2007 11:55     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #20 множественное цитирование

(guest: ммм @ 08.08.2007 10:30)
Ссылка на исходное сообщение  Кстати, иногда при высоких концентрациях сульфата белки не тонут, а всплывают.

... все это фигня, потаму чта сульфат есть грубый реагент и никакие тонкости не повысят точность фракционирования.


Белки могут всплывать как при высоких, так и при низких концентрациях сульфата аммония. При растворении соли выделяются микропузырьки воздуха, которые придают осадкам белка положительную плавучесть. Для борьбы с этим желательно:
1. Растворять исходный препарат белка в свежекипячёной воде (буфере).
2. Добавлять не соль, а её насыщенный раствор.
3. Если осадок всё-таки всплыл, то его можно не отцентрифугировать, а отфильтровать.

Сульфат - очень тонкий реагент, позволяющий фракционировать даже близкие по свойствам белки. Мне удавалось при помощи высаливания разделить фикоцианин и фикоэритрин синезелёной водоросли, отличающиеся только хромофорной группой. Высаливание при этом проводилось изменением насыщения соли на 0,1%.

Есть множество тонкостей, позволяющих повысить точность фракционирования при высаливании белков.
guest: ммм
IP-штамп: frwHRv5zEzGDY
гость



 прочитанное сообщение 13.08.2007 13:39     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #21 множественное цитирование

--Сульфат - очень тонкий реагент, позволяющий фракционировать даже близкие по свойствам белки. Мне удавалось при помощи высаливания разделить фикоцианин и фикоэритрин синезелёной водоросли, отличающиеся только хромофорной группой. Высаливание при этом проводилось изменением насыщения соли на 0,1%.

НЕ ВЕрю!!! Особенно, если в смеси была хотябы еще парочка десятков других белков в значимой концентрации. Хотя с конкретно этими белками я не знаком возможно это и так, но это скорее исключение чем правило.

Есть множество тонкостей, позволяющих повысить точность фракционирования при высаливании белков.

А клоны антител не пробовали делить из поликлональных сывороток. smile.gif

Белки могут всплывать как при высоких, так и при низких концентрациях сульфата аммония.

Ага! А плотность раствора соли тут ни при чем. smile.gif
Guest
IP-штамп: fr3PpYUagJAXg
гость



 прочитанное сообщение 13.08.2007 15:39     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #22 множественное цитирование

(guest: ммм @ 13.08.2007 13:39)
Ссылка на исходное сообщение  --Сульфат - очень тонкий реагент, позволяющий фракционировать даже близкие по свойствам белки. Мне удавалось при помощи высаливания разделить фикоцианин и фикоэритрин синезелёной водоросли, отличающиеся только хромофорной группой. Высаливание при этом проводилось изменением насыщения соли на 0,1%.

НЕ ВЕрю!!! Особенно, если в смеси была хотябы еще парочка десятков других белков в значимой концентрации.  Хотя с конкретно этими белками я не знаком возможно это и так, но это скорее исключение чем правило.


Высаливание проводилось из грубого лизата синезелёных водорослей, содержащего десятки основных и тысячи дополнительных белковых примесей.

"НЕ ВЕрю!!! "

С тех пор я не верю учебникам, описывающим красивую теорию высаливания белков.

Спустя пару десятков лет развлекался с выделением пероксидазы хрена. У неё точка высаливания где-то на 68 % насыщения. Точнее не определял, но основную часть примесей удавалось убрать высаливанием в интервале 5% насыщения. tongue.gif
Участник оффлайн! форма жизни




 прочитанное сообщение 13.08.2007 15:49     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #23 множественное цитирование

Вообще-то воможность проводить тонкое фрационирование белков, меняя концентрацию сульфата аммония на 0,1% вызывает ОЧЕНЬ большие сомнения. Сульфат-аммонийное фракционирование прекрасный метод, он особенно хорош для фракционирования лизатов-гомогенатов, сывороток и т.д., легко маштабируется, хорошо воспроизводится, но не надо делать из него какую-то "сверхметодику сверхочистки". Что касается флотации белка после высаливания, то "всплывание" белка определяется и концентрацией сульфата аммония и природой белка.
Например, при фрационировании гомогената печени 0,7 насыщения сульфата, белок всплывает, а У.З.-лизат E.coli - осаждается. Это еще зависит и от скорости высаливания - genseq абсолютно прав насчет микропузырьков воздуха. Вот только фильтровать сульфатаммонийный осадок - задача непростая и неблагодарная. Лучше открутить (если есть на чем), т.к. при 20000g в 0,8 насыщения сульфате на стенки пробирки садится любой осадок. Если вам пришлось высаживать белок сульфатом до полного насыщения, то тогда или фильтровать или крутить на ультраценрифуге при 80000-100000g.
Guest
IP-штамп: frwHRv5zEzGDY
гость



 прочитанное сообщение 13.08.2007 20:10     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #24 множественное цитирование

--С тех пор я не верю учебникам, описывающим красивую теорию высаливания белков.

По учебникам как раз получается, что возможно все. smile.gif
Это были Вы, Ильич?

--Например, при фрационировании гомогената печени 0,7 насыщения сульфата,

Та, язный пень, чем больше липидов связано с белками, тем легче оне взплывають, как на парашюте.
Участник оффлайн! genseq
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 14.08.2007 09:13     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #25 множественное цитирование

(форма жизни @ 13.08.2007 13:49)
Ссылка на исходное сообщение  Вообще-то воможность проводить тонкое фрационирование белков, меняя концентрацию сульфата аммония на 0,1% вызывает ОЧЕНЬ большие сомнения.


Не сомневайтесь. Интервал 1...2% вполне работоспособен. С интервалом 0,1% будут заморочки, но и это вполне реально. Нужно только использовать не повышение концентрации, а экстракционное высаливание с понижающейся концентрацией. Могу поделиться секретами и тонкостями этого метода, но боюсь, что это уже никому не нужно frown.gif . Народ давно уверовал в гель-хроматографию, иоообменники, HPLC и прочие навороты. Бороться со сторонниками общепринятых подходов - занятие крайне неблагодарное weep.gif .
Участник оффлайн! genseq
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 14.08.2007 09:14     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #26 множественное цитирование

(Guest @ 13.08.2007 18:10)
Ссылка на исходное сообщение  --С тех пор я не верю учебникам, описывающим красивую теорию высаливания белков.

По учебникам как раз получается, что возможно все. smile.gif
Это были Вы, Ильич?


Это был Витальич.
Участник оффлайн! NBSC
Постоянный участник
Петербург



 прочитанное сообщение 14.08.2007 09:21     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #27 множественное цитирование

(genseq @ 14.08.2007 07:13)
Ссылка на исходное сообщение  Не сомневайтесь. Интервал 1...2% вполне работоспособен. С интервалом 0,1% будут заморочки, но и это вполне реально. Нужно только использовать не повышение концентрации, а экстракционное высаливание с понижающейся концентрацией. Могу поделиться секретами и тонкостями этого метода, но боюсь, что это уже никому не нужно frown.gif . Народ давно уверовал в гель-хроматографию, иоообменники, HPLC и прочие навороты. Бороться со сторонниками общепринятых подходов - занятие крайне неблагодарное weep.gif .


Уважаемый genseg, не поделитесь ли секретами? Мне иногда приходится работать в "полевых условиях" при отсутствии прочих возможностей. Использую обычно высаливание сульфатом, процедура отработана уже. Но если есть тонкости процесса, буду очень благаодарна за помощь. Спасибо.
Участник оффлайн! genseq
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 14.08.2007 12:47     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #28 множественное цитирование

Основные принципы довольно просты, но мне уже неоднократно доставалось от местных всезнаек. По этой причине лучше обсуждать вопросы высаливания в приватной переписке. Если интерес серьёзен, то жмите на рисунок письма над этим сообщением и пишите на E-mail.
Участник оффлайн! форма жизни




 прочитанное сообщение 15.08.2007 10:47     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #29 множественное цитирование

Уважаемый genseq. Экстракционное высаливание действительно очень хорошая модификация сульфат-аамонийного фракционирования. Не требует ни какого специального оборудования или реактивов, дает неплохой выигрыш в очистке при существенном снижении потерь целевого белка на соосаждении с другими. На мой взгляд, эти плюсы с лихвой компенсируют незначительное удлинение всей процедуры. Правда, этот вариант требует гораздо большей тщательности и аккуратности в работе - просто более высокой биохимической культуры.
Но вот на счет работоспособности фракционирования с интервалом 1% и даже с еще меньшим интервалом...?!?!. Вам крупно повезло, что ваш конкретный белок, который вы выделяете из вашего источника можно фракционировать сульфатом со ступелькой 1% насыщения. Только на сколько целесообразно расширять такое везение, когда вы не знаете о каком белке, из какого источника и для каких целей (т.е. какая нужна чистота) его будет выделять гость? Есть три достаточно серьезных довода, из-за которых фракционирование сульфатом аммония с шагом менее 5% насыщения используется крайне редко независимо от модификации метода (прямое высаливание или экстракция):
1. Многие белки вообще не имеют четкой "точки высаливания" в силу своей природы. Наиболее известный пример (но, увы, далеко не единственный) - это нуклеозиддифосфаткиназа (NDPK). Этот фермент высаливается в интервале от 0,5 до 0,95 насыщения сульфата и все попытки сузить интервал концентраций сульфата или поменять высаливание на экстракцию только приводят к потерям целевого фермента.
2. Подобрать точную концентрацию сульфата, оптимальную для высаливания какого-либо белка, задача достаточно кропотливая. Как ни крути, но для любого варианта надо уметь определять содержание вашего целевого белка в некоторой фракции в присутствии высокой концентрации сульфата аммония. А если ваш белок - это фермент, активность которого подавляется сульфатом? Хорошо, если вы располагаете возможностью детектировать содержание вашего целевого белка напрямую по какой-нибудь экзотической флюорисценции или что-то в этом роде. А как насчет пробоподготовки для белкового э/ф из концетрированного раствора сульфата? Хлопотное и муторное это занятие, а мы , увы, все достаточно ленивы.
3. Всякий метод фракционирования (в том числе и белков) количественно оценивается по степени очистки. Во сколько раз вы очищаете ваш белок на конкретной стадии. Обычно очистка целевого белка до гомогенного состояния по э/ф требуется не часто и для многих задач вполне достаточно очистки по белку в 100-500 раз от исходного гомогената. Если ваш источник - не суперпродуцент вашего продукта, то такая очистка не очень высокая, но во многих случаях вполне приемлема. Сульфат-аммонийное фракционирование, даже самое тонкое, редко дает очистку по белку больше, чем в 4-5 раз. Мне всего однажды крупно повезло и искомый антиген чистился сульфатом аж в 11 раз, но это редкая удача и никакой моей заслуги в том не было - уж очень специфические условия высаливания оказались. Вся остальная очистка "добивалась" хроматографией.
Вообще, позволю себе "крамольную мысль" - сульфат аммония "лучше помогает" не при фракционировании белков. Вам приходилось выделять белки (или ферменты) не из сыворотки крови или культуральной жидкости, а из гомогената ткани? Представляете себе гомогенат печени крысы или минтая, гомогенат человеческой плаценты или икры морского ежа до оплодотворения или гомогенат эмбрионов морского ежа на средней бластуле? Сколько там всего "биологического материала" в растворе, кроме белка? Это не кристаллических змеинный яд и даже на гомогенат E.coli. Цвет и запах весьма специфические и как-то про хроматографию забываешь на прочь. А тут сульфат аммония - богом созданный реагент. Одно-два высаливания - и у вас "благородный белковый раствор". Очистка по белку 3-4 раза - это ерунда, но вы избавились от липидов, полисахаридов, каких-то пигметов, массы низкомолекулярной "шелухи" и даже частично от нуклеиновых кислот. После этого и на колонку не грех, и на э/ф пожалуйста.
Сульфат-аммонийное фракционирование - очень достойный и крайне полезный метод, но совсем не "волшебная палочка". Впрочем, думаю, что если вы поделителсь с менее опытными коллегами своим опытом, это будет просто замечательно за что вам заранее спасибо.

Всего благодарностей: 2Поблагодарили (2): genseq, Prof. Morkovkin
guest: ммм
IP-штамп: frwHRv5zEzGDY
гость



 прочитанное сообщение 15.08.2007 13:00     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #30 множественное цитирование

Форма жизни!!!

++11 beer.gif jump.gif
Участник оффлайн! genseq
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 15.08.2007 15:18     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #31 множественное цитирование

Огромное спасибо форме жизни. Постараюсь соответствовать заданному им уровню дискуссии и поделиться своим небольшим опытом в деле высаливания белков, тем более, что письма от NBSC я так и не получил rolleyes.gif .

В стародавние времена довелось мне делать дипломную работу в Ин-те биологии внутренних вод и водоёмов. Тамошние биологи пожелали сделать "что-нибудь биохимическое" и для этой цели выписали студента-биохимика (т.е. меня). Единственным объектом, с которым можно было успеть сделать хоть что-нибудь путное, оказались синезелёные водоросли, а единственным удобоваримым прибором - спектрофотометр СФ-4. Поневоле пришлось заняться ярко окрашенными белками - билихромопротеидами. Центрифуги там тоже не было (не говоря уж об ионообменниках) и кроме высаливания, причём с фильтрованием осадков, воспользоваться было не чем. Кстати, фильтров тоже не было, поэтому использовалась обычная стекловата, которой набивались сделанные из пипеток колонки.

Первые же эксперименты показали, что для отделения осадков наиболее критичным параметром является скорость фильтрования. Если она превышала 1...1,5 мл/мин*см2, то ярко-синие осадки уходили в проскок. Но на малой скорости и при последовательном повышении концентраций окрашенные белки нарушали все известные теории - при достижении критической концентрации сульфата аммония растворимость ярко-синего фикоцианина падала до нуля, причём очень резко - при изменении насыщения раствора сульфатом аммония всего на 0,1-0,2%. Правда, испортить весь опыт могла даже небольшая вибрация рабочего стола. На синих белках это было очень хорошо заметно.

Для подтверждения подобного "аномального" высаливания фикоцианина был поставлен незасимый эксперимент - растворы с разной концентрацией сульфата аммония были приготовлены прямо в кюветах спектрофотометра, и образование осадков оценивалось по снижению оптической плотности раствора. Графики высаливания и в этом случае оказались аномальными - растворимость падала практически отвесно, но осадки вблизи точки высаливания были чрезвычайно лабильными - переходили опять в раствор даже при незначительных вибрациях, связанных с перемещением кювет.

Впоследствии такой характер высаливания был продемонстрирован и на гемоглобине крови. От экспериментов с кровью у меня до сих пор остался небольшой шрам на руке weep.gif .

Основной вывод таков:
описанные в литературе формулы и кривые растворимости белков, обоснованые экспериментами на вибрирующих центрифугах, описывают не истинную картину высаливание белков, а устойчивость белковых осадков к вибрациям центрифуги umnik.gif .

Ну а следствия этого вывода и способы использования данного феномена для тонкой очистки белков с помощью высаливания постараюсь описать завтра. Сейчас уже пора убегать tongue.gif .
Ъ
IP-штамп: frNwv0U1khjS.
гость



 прочитанное сообщение 15.08.2007 19:31     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #32 множественное цитирование

Форму Жизни я тоже благодарю beer.gif Уважаю smile.gif А Генсека стал еще больше уважать beer.gif
Участник оффлайн! klav
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 16.08.2007 09:07     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #33 множественное цитирование

Прикрепить сию полезную тему к методическому разделу форума!
umnik.gif umnik.gif smile.gif
Вот например сюда http://molbiol.ru/protocol/17_15.html
Участник оффлайн! genseq
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 16.08.2007 18:07     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #34 множественное цитирование

Похоже, пора от преамбулы переходить к амбуле - к хитростям, которые должен знать каждый начинающий высаливатель белков.

1. Кессонная болезнь, т.е. образование микропузырьков при растворении соли или при смешивании её насышенного раствора с водой. Это приводит к значительным потерям, поскольку осадки начинают всплывать, а часть белков в них необратимо денатурируется. При однократном высаливании этими потерями можно пренебречь, но при многократном высаливании теряется всё.

Проблема решается использованием для растворения осадков перед повторным их осаждением свежекипячёной ("обезгаженной") воды.

2. Соосаждение, т.е. захват осадками белков, которые при данной концентрации соли ещё вполне растворимы.

Если высаливать белки повышением концентрации соли, то их соосаждение приводит к получению очень невнятных результатов. а вот если идти не снизу в верх, а сверху вниз, и проводить экстракционное высаливание, то с соосаждением можно бороться повторной экстракций.

В общих чертах экстракционное высаливание выглядит следующим образом:
а) к смеси белков в буфере добавить равный объём насыщенного раствора сульфата аммония (если начинать с 50% насыщения);
б) отцентрифугировать и слить супернатант в отдельную пробирку (фракция >50% насыщения);
в) осадок растворить в 5,5 мл "обезгаженной" воды и смешать с 4,5 мл насыщенного раствора сульфата аммония;
г) отцентрифугировать и слить супернатант в отдельную пробирку (фракция 45...50% насыщения).
д) см. сказочку про попа и его собаку. Отличается только соотношение воды и раствора соли - 6:4; 6,5:3,5; 7:3.

При таком подходе можно повторять пункты в) и г) тем же соотношанием 5,5:4,5. При этом из осадка извлекаются белки, которые обязаны пребывать во фракции 45...50%.

Ко всем полученным супернатантам (по 10 мл) можно добавить по 1 мл насыщенного раствора соли, получить осадки и провести повторное экстракционное высаливание с интервалом 1...2% насыщения. Потери, связанные с соосаждением белков, будут уже намного меньше.

Кстати, чем чище препарат белка, тем меньше проявляются фокусы, связанные с соосаждением.

Продолжу завтра rolleyes.gif .

Сообщение было отредактировано genseq - 16.08.2007 18:10
Участник оффлайн! Яра

Оболенск



 прочитанное сообщение 16.08.2007 21:53     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #35 множественное цитирование

Класс! С нетерпением буду ждать продолжения yes.gif
Но, если можно, поподробнее confused.gif насчет субъединичных белков. Как вся эта роскошь работает с ними?
А то у меня в работе белок уже рефолдированный eek.gif
guest: NBSC
IP-штамп: frIPUyB0jVJss
гость



 прочитанное сообщение 16.08.2007 22:49     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #36 множественное цитирование

Уважаемый genseq, извините за поздний ответ. Не всегда есть возможность воспользоваться интернетом. Все, что вы уже рассказали, безумно интересно! Сейчас постараюсь осознать собственные ошибки в работе и исправить положение. Если будет продолжение - всеми конечностями - за! Спасибо!!!
Участник оффлайн! genseq
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 17.08.2007 21:30     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #37 множественное цитирование

Боюсь, что девушки ждут молока от старого козла. Ну-ну... rolleyes.gif . Впрочем, на кое-что я ещё способен wink.gif .

Как правило, при высаливании ориентируются на минимальную концентрацию сульфата аммония (процент насыщения), при которой требуемый белок выпадает в осадок. Более продвинутые специалисты предпочитают использовать интервал концентрации соли, который обычно составляет от 10 до 20% насыщения и очень редко - 5%. Метод считается очень грубым и используется на самой первой стадии, когда требуется избавиться от липидов, грубого дебриза, углеводов и низкомолекулярных примесей, способных загубить дорогостоящия колонки (см. форму жизни). При этом большие потери считаются нормой жизни.

В действительности всё совсем не так, как на самом деле. Высаливание пригодно и для грубой очистки (причём без особых потерь), и для тонкого фракционирования.

Для грубой очистки необходимо знать интервал насыщения, при котором белок выпадает в осадок (10...20% насыщения). Основные потери связаны с соосаждением целевого белка, ну а способ борьбы с этим (повторное экстракционное высаливание) мы уже обсуждали. Впрочем, из каждого правила есть исключения - например, захват белка осадком может быть обусловлен и межмолекулярной сшивкой сульфгидрильных групп, но подобные фокусы и способы борьбы с ними нужно обсуждать отдельно.

Итак, после экстракционного высаливания грубого лизата (центрифугированного гомогената) с интервалом насыщения 10...20% обычно получается белковый осадок кремового цвета, содержащий основную часть целевого белка и пригодный, например, для гель-хроматографии. После этого можно переходить к высаливанию с интервалом 2...5%. Только не нужно забывать о том, что для каждого белка характерен не интервал, а точка высаливания, значение которой отличается исключительной стабильностью. Многократные центрифугирования (или фильтрования) необходимы только для максимально точного определения этой точки. В дальнейшем головной боли от жужжания центрифуги будет намного меньше.

Скорость формирования осадков при высаливании белков очень сильно зависит от их концентрации. Разведённые растворы (<мг/мл) выпадают в осадок очень медленно. Их приходится оставлять в холодильнике на ночь. Следовательно, лучше работать с концентрированными растворами. Это значит, что если вы получили 1...2 г (или мл) белкового осадка, то не нужно его разводить слишком сильно. Воды должно быть достаточно для растворения осадка (3...6 мл), но не намного больше (100...200 мл). Для работы с граммовыми количествами осадков вполне достаточно центрифужных пробирок на 10...50 мл, а с сотнями миллиграмм можно работать и в эппендорфовских пробирках.

Концентрация сульфата аммония в осадке обычно близка к той, которую Вы собираетесь использовать на следующей стадии экстракционного высоливания, поэтому ей обычно можно пренебречь, т.е. если 1...2 г осадка получено из интервала 40...50% насыщения, то его можно растворить в 5,2 мл воды ("обезгаженной") и добавить 4,8 мл насыщенного раствора соли. При этом в растворе останется фракция 48...50%, а в осадке останутся белки, выпадающие при 40...48%. Концентрация соли в исходном осадке (50% насыщения) сместит (повысит) пороговую концентрацию на 10..20%, но это от 2% интервала, т.е. истинное смещение составит 0,02...0,04%. При повторной экстракции этого же осадка, проводимой для извлечение соосаждённого белка, смещение концентрации осадком будет уже совсем незначительным.

Если точка высаливания Вашего белка известна и равно 49% насыщения, то предыдущие разглагольствования можете считать методикой его очистки. Интервал высаливания при этом - 2%. После этого можно добавить к объединённым супернатантам немного (до 50...55% насыщения) сульфата аммония, отцентрифугировать, растворить осадок (100...200 мкл) в 0,5 мл воды и провести гель-хроматографическую доочитску, а заодно и обесссоливание.

Впрочем, можно продолжить и высаливание полученной белковой фракции, но уже с интервалом концентрации соли 0,2...0,5% насыщения. Кстати, это делается уже на миницентрифуге.

Проблем и хитростей ещё очень много, но на сегодня, по-моему, достаточно.

Уф. mol.gif
Участник оффлайн! genseq
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 18.08.2007 08:10     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #38 множественное цитирование

Кстати, о высаливании. Этот вопрос уже обсуждался на форуме:
http://molbiol.ru/forums/lofiversion/index.php/t152632.html

Вопрос был сформлирован следующим образом:
Майя, 04.03.2007 07:36
скажите пожалуйста как влияет размер белка на эффективность его высаливания сернокислым аммонием, есть ли какая либо зависимость типа чем меньше белок тем хуже высаливается?

Ну а мой ответ не слишком сильно отличался от всего вышесказанного:

"Зависимость от размера есть, но не прямая. Лучше высаливаются кислые белки. Желательно работать при высокой концентрации белков. При низкой образование осадка идёт медленнее. По этой причине обычно рекомендуется использовать высаливание на самой первой стадии - для грубых экстрактов, содержащих большое количество примесей. При этом идёт сильное соосаждение, т.е. целевой белок захватывается осадком даже помимо своего "желания". Оптимальный вариант - это экстракционное высаливание, т.е. сначала осаждаете белок со всеми примесями, а потом растворяете осадок в дистиллированной воде и добавляете насыщенный раствор сульфата аммония в требуемой пропорции. Осадок растворяете и высаливаете повторно, но соотношение воды и соли понижаете, и т.д. Ко всем полученным супернатантам добавляете насыщенный раствор соли, центрифугируете и получаете серию осадков, в которых ищете свой белок. Если точка высаливания известна, то сразу ориентируетесь на требуемое соотношение воды и насыщенного раствора соли. Ступенчатую экстракцию можно проводить повторно и с различными интервалами процента насыщения раствора соли. Для крупных белков можно добиться осаждения в интервале 1...2% насыщения, причём без существенных потерь. Для мелких интервал требуется немного шире (3...5%).
Главное - дистиллированную воду брать только свежекипячёную. Иначе белки погибнут от "кессонной болезни".
Участник оффлайн! Яра

Оболенск



 прочитанное сообщение 18.08.2007 20:12     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #39 множественное цитирование

(genseq @ 17.08.2007 22:30)
Ссылка на исходное сообщение  Боюсь, что девушки ждут молока от старого козла. Ну-ну...  rolleyes.gif . Впрочем, на кое-что я ещё способен wink.gif .


Вот что меня безумно радует в мужчинах yes.gif , так это их уникальное кокетство и способность напрашиваться на комплименты shuffle.gif
Участник оффлайн! genseq
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 19.08.2007 14:02     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #40 множественное цитирование

Вообще-то это была самокритика redface.gif .
Ъ
IP-штамп: frNwv0U1khjS.
гость



 прочитанное сообщение 19.08.2007 15:47     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #41 множественное цитирование

(genseq @ 19.08.2007 14:02)
Ссылка на исходное сообщение  Вообще-то это была самокритика redface.gif .

Генсек, уже поздно - Яна уже втюрилась виртуально. lol.gif Но вы же там соседи... smile.gif
Участник оффлайн! Яра

Оболенск



 прочитанное сообщение 19.08.2007 21:05     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #42 множественное цитирование

(Ъ @ 19.08.2007 16:47)
Ссылка на исходное сообщение  Генсек, уже поздно - Яна уже втюрилась виртуально.  lol.gif Но вы же там соседи... smile.gif

Во-первых, прошу не путать Яру с Яной, с детства этого не терплю shuffle.gif
Во-вторых, таки да, "тащусь от зрелых мужей и мифических чудовищ" lol.gif lol.gif lol.gif .
Ну что за инфантилизм: стоит даме сказать комплимент, как начинаются всякие инсинуации redface.gif
В-третьих, мне лично лекция очень понравилась cool.gif .

Сообщение было отредактировано Яра - 19.08.2007 21:11
Участник оффлайн! форма жизни




 прочитанное сообщение 20.08.2007 11:13     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #43 множественное цитирование

Уважаемый genseq. Завидую вашей удачливости. Вам удается растворять 1-2г белкового осадка в 5 мл воды (наверное, лучше все-таки буфера?). Увы, мне не везло с белками и растворы с концентрацией белко 100 мг/мл у меня не получаются. Наверное, мы недопонимаем друг друга. Я говорю о суммарном белке, концентрация которого измеряна (в соответствующем разведении, конечно) по Бредфорду или по Лоури. А вы о каком белке?
Кстати, об экстракции белков сульфатом. Все, что вы написали про переосаждение (по моему опыту) полностью соответстует получаемым мною результатам, за исключением растворимости белка. Обычно у меня не растворяется белковый сульфат-аммонийный осадок (например, из гомогената E.coli) в концентрации более 20 мг/мл.
Но есть весьма забавная модификация экстракции сульфатом. Для этого сначала вы высаживаете суммарный белок заведомо большей концентрацией (например, 0,8 насыщения, против 0,7, которое нужно для вашего белка). Отделяете осадок, супернатант (или фильтрат) отбрасываете, а осадок растворяете, но не в воде или в буфере, а в растворе сульфата аммония с концентрацией ниже той, которая необходима для высаливания вашего белка (например, 0,6 насыщения). Растворение лучше проводить ночь при +4 и соотношение осадок:раствор сульфата лучше брать 1:25 или 1:30. Полученную суспензию отцентрифугировать (или отфильтровать, если вам так привычнее) и теперь супернатант (или фильтрат) содержит ваш целевой белок с приличной очисткой. Добавьте к этому супернатанту опять сульфама аммония до нужной вам концентрации и получите очень приличную очистку целевого белка с небольшими потерями.

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): NBSC
Участник оффлайн! genseq
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 20.08.2007 11:16     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #44 множественное цитирование

(Ъ @ 19.08.2007 13:47)
Ссылка на исходное сообщение  Генсек, уже поздно - Яна уже втюрилась виртуально.  lol.gif Но вы же там соседи... smile.gif


Dear Ъ,

не думаю, что "уже поздно", но мне нравится ход твоих мыслей rolleyes.gif .
Участник оффлайн! genseq
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 20.08.2007 11:54     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #45 множественное цитирование

Спасибо форме жизни. Он совершенно прав, но я постараюсь быть ещё правее.

1. Белки, как правило, растворяют в буфере, предназначенном для поддержания заданного pH. Сульфат аммония - соль кислая. Её растворы имеют pH~5,0, а попытки защелочить их до привычного всем нейтрального или слабощелочного значения приводят к появлению аммиачной вони. Лучше просто не бояться кислых значений pH. Их денатурирующее воздействие на белки при высаливании, как правило, компенсируется повышением стабильности белков в концентрированных солевых растворах. Кстати, некоторые ферменты, плохо переносящие лиофилизацию (бета-галактозидаза и т.п.) хранятся и поставляются в виде суспензии в растворе сульфата аммония.

Скорее всего, из этого правила есть исключения. Тогда лучше использовать для высаливания забуференные растворы сульфата натрия или насыщенные растворы двузамещённого фосфата натрия (pH~8,6).


2. Растворимость белков очень сильно зависит от ионной силы растворов. При низкой ионной силе растворимость многих белков незначительна, а если ещё и pH соответствует изоэлектрической точке белка, то он может вывалиться в осадок полностью. На этом основан метод изоэлектрического осаждения, активно использовавшийся на заре энзимологии. При повышении ионной силы растворимость быстро увеличивается и может достигать запредельных значений. Наконец, при приближении концентрации соли к точке высаливания растворимость снижается. Если белок очищенный, то она падает практически отвесно. Если очень "грязный", то график имеет куполообразных характер, сглаженный эфектами соосаждения.

Форма жизни совершенно прав. В буферном растворе многие белки растворяются весьма посредственно. Но вот сульфат-аммонийные осадки в небольшом объёме воды растворяются необычайно хорошо. Можно, конечно, растворять их и в небольшом объёме буфера, но это приведёт к непредсказуемости pH, так что лучше использовать именно воду. Будет, конечо, кисловато, но лучше так, чем иметь головную боль от непредсказуемой pH или от постоянного запаха аммиака frown.gif .
Участник оффлайн! genseq
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 20.08.2007 12:01     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #46 множественное цитирование

(форма жизни @ 20.08.2007 09:13)
Ссылка на исходное сообщение ... Но есть весьма забавная модификация экстракции сульфатом. Для этого сначала вы высаживаете суммарный белок заведомо большей концентрацией (например, 0,8 насыщения, против 0,7, которое нужно для вашего белка). Отделяете осадок, супернатант (или фильтрат) отбрасываете, а осадок растворяете, но не в воде или в буфере, а в растворе сульфата аммония с концентрацией ниже той, которая необходима для высаливания вашего белка (например, 0,6 насыщения). Растворение лучше проводить ночь при +4 и соотношение осадок:раствор сульфата лучше брать 1:25 или 1:30. Полученную суспензию отцентрифугировать (или отфильтровать, если вам так привычнее) и теперь супернатант (или фильтрат) содержит ваш целевой белок с приличной очисткой. Добавьте к этому супернатанту опять сульфама аммония до нужной вам концентрации и получите очень приличную очистку целевого белка с небольшими потерями.


В целом горячо одобряю, а вот в частности Вы описали несколько ухудшенную модификацию экстракционного высаливания. Ухудшение заключается в том, что при растворении осадка (фракции 80% насыщения) в растворе сульфата аммония (60% насыщения) потери целевого белка будут выше, чем при полном растворении осадка. Слишком много его останется в соосаждённом виде с белками фракции 0...60%. Ну а как этого избежать мы уже рассматривали umnik.gif .
Участник оффлайн! klav
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 20.08.2007 12:54     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #47 множественное цитирование

Ну ни тема, а учебник по высаливанию!
Огромное спасибо девушкам, без которых этого бы не было! wink.gif beer.gif
Ъ
IP-штамп: frNwv0U1khjS.
гость



 прочитанное сообщение 20.08.2007 14:07     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #48 множественное цитирование

(klav @ 20.08.2007 12:54)
Ссылка на исходное сообщение  Ну ни тема, а учебник по высаливанию!
Огромное спасибо девушкам, без которых этого бы не было!  wink.gif  beer.gif

Среди нас только одна девушка - это Яра! Признаю. что Ярослава могла вдохновить мужчин на подвиги, а Генсека точно smile.gif .
Участник оффлайн! Redactor
admin.
Берлин, Германия



 прочитанное сообщение 20.08.2007 14:43     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес  ICQ
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #49 множественное цитирование

На форуме было по крайней мере три темы о высаливании. Сейчас они объединены в одну и эта тема прикреплена к методике высаливания в "Методах" (смотри первое сообщение в теме).

Всего благодарностей: 2Поблагодарили (2): genseq, NBSC
Участник оффлайн! genseq
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 21.08.2007 07:57     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #50 множественное цитирование

(Ъ @ 20.08.2007 12:07)
Ссылка на исходное сообщение  Среди нас только одна девушка - это Яра! Признаю. что Ярослава могла вдохновить мужчин на подвиги, а Генсека точно smile.gif .


Прошу прощения, но мне бы хотелось сказать "несколько тёплых слов" Ирине, участвующей здесь под ником NBSC.

У неё очень непростая задачка - выделение в полевых условиях физиологически активного высоколабильного белка из гемолимфы, причём осаждается он при 70...75% насыщения сульфата аммония. Основная задача - уменьшить потери, связанные как с высаливанием, так и с инактивацией.

Все белки сыворотки крови (и не только) на заре их препаративной химии были разделены на глобулины, осаждающиеся при 50% насыщения сульфата аммония, и альбумины, не выпадающие при этой концентрации соли в осадок. В соответствии с этой классификацией белок Ирины относится к альбуминам и является далеко не самым лучшим объектом для высаливания. Кроме того, известна только ориентировочная концентрация, при которой он выпадает в осадок (70...75% насыщения). Попытаюсь дать несколько самых общих советов, в правильности которых не слишком уверен. Дело в том, что при высаливании подобных белков исключений может быть не меньше, чем правил.

1. Определите концентрацию соли (нижнюю границу), при которой белок ещё не выпадает в осадок, или частично выпадает, но может быть экстрагирован (см. выше разглагольствования о соосаждении). Если это 60% насыщения, то удастся избавиться от всех глобулинов и даже от значительной части альбуминов. Хорошо бы высолить основной альбумин вашей гемолимфы. При этом и потери могут быть незначительными (стабилизирующее влияние высоких концентраций соли), и очистка весьма ощутимой.
2. Попытайтесь как можно точнее найти концентрацию соли, при которой происходит полное высаливание Вашего белка (верхняя граница). Для этого используйте не сумарный препарат гемолимфы, а её фракцию, не выпавшую в осадок при подборе нижней границы.

Похоже, Ваша проблема ещё и в том, что даже при 75% насыщения есть подозрения, что значительная часть белка остаётся в супернатанте. С более высокими концентрациями соли работать уже слишком проблематично. В таком случае лучше перейти с высаливания на другие способы концентрирования (ультрафильтрация, обратный осмос и т.п.).

Кроме того, требуемой физиологической активностью могут обладать несколько белков. В этом случае получить достаточно внятные результаты при солевом фракционировании будет невозможно.

Существуют и индивидуальные особенности белков, мешающие их очистке при помощи высаливания. В общем, возможны проблемы wall.gif , но из-за их непредсказуемости лучше сейчас не заморачивать Вам голову. Начните с поиска точного интервала высаливания, а там будет видно.

Успехов!

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): NBSC

*




Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.
Имя:

 преобразовывать смайлики · показать смайлики
Назначение кнопок:

   Поблагодарить автора сообщения — поблагодарить автора
   Удалить сообщение — удалить
   Редактировать сообщение — редактировать
   Поместить сообщение в колонку новостей — поместить в колонку новостей
   Цитировать — цитировать сообщение
   не входит в цитирование/входит в цитирование — цитировать несколько
   Отметить СПАМ-сообщение — обозначить спам
   Сообщение для модератора — связь с модератором
   Участник онлайн!/Участник оффлайн! — автор онлайн/оффлайн
   Фотография — фотография автора

   - остальные обозначения -
 
   *
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема »
Быстрый ответДобавить сообщение в темуСоздать новую тему

Rambler   molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов              

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Ваш форум  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама  ·  Дата и время: 18.10.18 19:43
Bridged By IpbWiki: Integration Of Invision Power Board and MediaWiki © GlobalSoft