Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
P.P.Gariaev Участник |
В этом направлении уже получены экспериментальные результаты и опубликованы. Их уже приводил здесь. Сейчас это существенно расширено, готовится к печати. |
P.P.Gariaev Участник |
|
P.P.Gariaev Участник |
|
Bear Постоянный участник Москва |
|
P.P.Gariaev Участник |
|
Bear Постоянный участник Москва |
(P.P.Gariaev @ 08.07.2020 12:11) Так у Вас же нет доказательств, что артефакты. Я же привожу доказательства. И предлагаю их повторить и развить. Всего-то забот - купить лазер ЛГН-303. Остальное у Вас есть. |
P.P.Gariaev Участник |
Ну, возразите же мне по сути, по делу. Нет возражений. Удивительные люди... Сообщение было отредактировано P.P.Gariaev - 09.07.2020 20:30 |
dk Постоянный участник Россия |
|
P.P.Gariaev Участник |
(dk @ 10.07.2020 12:10) Да не вопрос. Давайте, выкладывайте сюда последовательность праймеров и целевой регион, и ссылку на mp3'шку. Ну и протокол, как для ПЦРницы музыку играть. Хрен с ним, потрачу сто рублей на ненужны олиги да пару стрипов запачкаю, как время будет. Как раз вопрос. Не работает опция выкладывания статей и рисунков. Только что закончили очередное воспроизведение экспериментов с материализацией плазмиды. Могу в личку выложить полный отчет об этом. Лучше в Вашу электронную почту. Вот выводы из этой работы: Выводы: 1) Постановка многократных отрицательных контролей на чистоту реактивов с высокой степенью уверенности исключает вероятность засорения (контаминации) экспериментальных пробирок вещественной ДНК, так как пробирки не открывались с момента приготовления ПЦР-смесей. Если бы произошла контаминация, то она, скорее всего, проявилась бы в отрицательном контроле, а он был абсолютно чистым, что подтвердил денситометрический анализ. 2) Форезы с отрицательным контролем, как в системе со специфическими, так и неспецифическими праймерами, свидетельствуют об отсутствии фантомов записи плазмидного продукта, записанного в 2015 году. Кроме того многочисленные эксперименты с неспецифическими Random-праймерами показали, что синтеза какого-либо ДНК-продукта без вещественной ДНК матрицы и в отсуствии других факторов (например, звука лазера) не происходит. Поэтому это не подтверждает мысль о том, что какая-либо генетическая информация, например, коронавируса может без иницирующего фактора передаваться фантомным путём. Если бы это было так, мы поймали бы ДНК-шмеры в отрицательном контроле для ПЦР-системы с Random-праймерами. А мы много раз ставили эти контроли (в эксперименте с фотографией, в опыте с поджелудочной, в этом эксперименте). Все они были отрицательными, никаких фантомов не было поймано. И это хорошо, потому что, если бы были шмеры в отрицательном контроле, то трудно было бы доказать, что это не контаминация. Доказать, что-нибудь в этом случае невозможно. Чистота реактивов в отрицательном контроле – это главное условие ПЦР-анализа. 3) Прямая наработка ДНК-продукта со звуковой записи с использованием сразу специфических праймеров не получилась (см. Форез №2). Непрямая наработка ДНК-продукта со звуковой записи с использованием сначала неспецифических Random-праймеров, а затем специфических праймеров показала хорошую эффективность. Были наработаны вариабельные по своей интенсивности ДНК-продукты целевой длины 547 п.н. (см. Форез №5). 4) Таким образом, это показывает, что одни звуковые записи не несут настолько полноценной генетической информации, чтобы обеспечить синтез целевого ДНК-продукта сразу с использованием прямых ДНК-специфичных праймеров. Сначала нужно получить фракцию ДНК на неспецифических свободных (Random) праймерах, так как они обладают сродством к любой ДНК, а следовательно к любой генетической информации. Видимо этим праймерам легче взаимодействовать со звуковыми эквивалентами ДНК. А потом уже на втором этапе эта ДНК используется в ПЦР-системе со специфичными праймерами (в данном случае праймерами, фланкирующими участок плазмиды длиной 547 п.н.). 5) В дальнейшем нужно провести обязательное секвенирование полученных целевых ДНК-продуктов 547 п.н., как мы это делали ранее в статье 2016 г. Это подтвердит их принадлежность к исходной плазмиде. Это необходимо сделать для того, чтобы исключить вероятность синтеза другой ДНК-последовательности, которая обладает похожей длиной. Например, недавно в прошлом эксперименте мы получали продукты генов поджелудочной железы той же целевой длины, возможно, сохранились фантомы этой звуковой записи. |
P.P.Gariaev Участник |
Также как мы сделали их для генов из клеток поджелудочной. |
Шаолинь Постоянный участник |
(P.P.Gariaev @ 10.07.2020 23:44) Сиквенсы плазмиды запланированы. После отпуска. Также как мы сделали их для генов из клеток поджелудочной. вот тут система Лазер ПЦР |
P.P.Gariaev Участник |
|
Шаолинь Постоянный участник |
(P.P.Gariaev @ 10.07.2020 23:59) Могу выслать также и материалы по ПЦР и сиквенсам квант. эквивалентов (материализоанных) генов поджелудочной. Тоже пока не опубликовано. |
Шаолинь Постоянный участник |
(P.P.Gariaev @ 10.07.2020 23:59) Могу выслать также и материалы по ПЦР и сиквенсам квант. эквивалентов (материализоанных) генов поджелудочной. Тоже пока не опубликовано. Nature ждетс |
Шаолинь Постоянный участник |
(P.P.Gariaev @ 08.07.2020 09:05) В теме предполагается обсудить проблему ВЕЩЕСТВЕННО-ВОЛНОВОГО ДУАЛИЗМА В СИСТЕМЕ ЛАЗЕР---ПЦР В этом направлении уже получены экспериментальные результаты и опубликованы. Их уже приводил здесь. Сейчас это существенно расширено, готовится к печати. |
P.P.Gariaev Участник |
(Шаолинь @ 10.07.2020 23:56) Никакого отношения к нашей схеме это не имеет. Наша схема другая |
Шаолинь Постоянный участник |
(P.P.Gariaev @ 11.07.2020 00:10) Никакого отношения к нашей схеме это не имеет. Наша схема другая |
Шаолинь Постоянный участник |
(P.P.Gariaev @ 11.07.2020 00:10) Никакого отношения к нашей схеме это не имеет. Наша схема другая фник его знает эта схема в Nature |
Шаолинь Постоянный участник |
(P.P.Gariaev @ 11.07.2020 00:10) Никакого отношения к нашей схеме это не имеет. Наша схема другая |
P.P.Gariaev Участник |
--------- Но надо учитывать, что, как мы уже видели, что квант. эквиваленты ДНК не предсказуемо (пока) флуктуируют во времени. Поэтому идея волновой трансляции геномов вирусов, по крайней мере, некоторых, нуждается в более длительной проверке. |
dk Постоянный участник Россия |
|
Шаолинь Постоянный участник |
(P.P.Gariaev @ 11.07.2020 09:10) 2) Форезы с отрицательным контролем, как в системе со специфическими, так и неспецифическими праймерами, свидетельствуют об отсутствии фантомов записи плазмидного продукта, записанного в 2015 году. Кроме того многочисленные эксперименты с неспецифическими Random-праймерами показали, что синтеза какого-либо ДНК-продукта без вещественной ДНК матрицы и в отсуствии других факторов (например, звука лазера) не происходит. Поэтому это не подтверждает мысль о том, что какая-либо генетическая информация, например, коронавируса может без иницирующего фактора передаваться фантомным путём. Если бы это было так, мы поймали бы ДНК-шмеры в отрицательном контроле для ПЦР-системы с Random-праймерами. --------- Но надо учитывать, что, как мы уже видели, что квант. эквиваленты ДНК не предсказуемо (пока) флуктуируют во времени. Поэтому идея волновой трансляции геномов вирусов, по крайней мере, некоторых, нуждается в более длительной проверке. |
P.P.Gariaev Участник |
(dk @ 11.07.2020 09:20) Для воспроизведения "эксперимента" не нужны здесь никакие картинки. Просто, буковками, выложите прямо в этой ветке: 1. последовательность праймеров; 2. целевой регион (или просто ссылку на плазмиду, уж на неё не проблема наложить олиги); 3. ссылку на "музыку"; 4. протокол эксперимента. Я не думаю что этим будут раскрыто какие-то страшные тайны и ноу-хау, но многим участникам МолБиола будет интересно "шо цэ такэ". Как музыку плазмиды выложить? Остальное вставлю. |
Шаолинь Постоянный участник |
(P.P.Gariaev @ 11.07.2020 09:43) UV laser technique UV laser irradiation of living cells was performed using a Quanta-Ray pulsed Nd:YAG laser (Model GCR-150, Spectra Physics) equipped with an HG-2 harmonic generator (Spectra Physics) and dichroic mirrors (DHS-2 Quanta-Ray dichroic harmonic separator) to give monochromatic light at 266 nm. The laser beam was focused by a fused silica lens, deviated by 90° and adjusted to fit the surface of the sample area. The laser energy at the sample position was determined using a Power/Energy Meter (Nova, Ophir Optronics Ltd.) equipped with a Power Thermal Sensor (Model 10A-P-SH, Ophir Optronics Ltd.). The parameters for UV laser irradiation were as follows: pulse duration 5 ns, repetition rate 10 Hz, energy per pulse 50 mJ, diameter of the laser beam 6 mm. |
Шаолинь Постоянный участник |
(P.P.Gariaev @ 11.07.2020 09:43) |
P.P.Gariaev Участник |
Прямое получение ДНК-продуктов со звуковой записи спектров мШЭИ лазера (Wave файл), произведённых с участка плазмиды длиной 547 п.н., с использованием специфичных праймеров. В этой части эксперимента мы пытались получить ДНК-продукт напрямую в ходе ПЦР с использованием исходных ПЦР-праймеров и звуковой записи наработанного в ходе ПЦР участка плазмиды длиной 547 п.н. То есть использовались те же ПЦР-праймеры, фланкирующие участок плазмиды 547 п.н., который использовали для записи на лазере. Запись ПЦР-продукта участка плазмиды была осуществлена 01.12.2015 и продемонстрировала свою эффективность в предыдущих экспериментах (см. соответствующий отчёт за 2015 год). Условия проведения эксперимента: 1) 1-й этап: приготовление исходных ПЦР-пробирок. Готовились стандартные реакционные смеси для ПЦР-анализа в количестве 21-й. Приготовление смесей осуществлялось в стерильном ПЦР-боксе, предварительно обработанном УФ-излучением для предотвращения контаминации. Все ПЦР-реактивы, включая стерильную воду, хранились в замороженном виде при -20° С в холодильнике и размораживались непосредственно перед приготовлением ПЦР-смесей. Каждая ПЦР-смесь содержала: стерильную специально очищенную воду, магний-содержащий буфер, смесь трифосфатов (dNTPs), ДНК-специфичные праймеры, фланкирующие целевой участок плазмиды, термостабильную Taq ДНК-полимеразу. После приготовления смесей все пробирки, за исключением положительного контроля, закрывались и больше не открывались до этапа электрофоретического анализа результатов ПЦР (очень важно для доказательства безматричного синтеза). Все ПЦР-пробирки хранились в холодильнике при +6-+8° С, чтобы обеспечить сохранность реактивов. Использовали следующие специфические ПЦР-праймеры для участка плазмиды длиной 547 п.н.: TGCCCGCTTCCAAACCAATGCCT CCTTACGTCAGTGGAGATGTCACA 2) 2-й этап: постановка отрицательного контроля ПЦР и оценка «чистоты реактивов» ПЦР-системы с ДНК-специфичными праймерами от контаминации. См. форез №1 Для это использовали первые 7 ПЦР-пробирок из исходных 21-й. 6 пробирок оставили без изменений (без открытия крышки с момента приготовления), в 7-ю пробирку была добавлена вещественная ДНК-матрица исходной плазмидной ДНК (положительный контроль ПЦР). Была проведена полимеразная цепная реакция в течение 35 циклов со следующим температурным режимом: первичная денатурация при 95° С – 3 минуты, в каждом цикле: денатурация 94° С – 1 минута, отжиг 68° С – 1 минута, элонгация 72° С – 1 минута, завершающая элонгация - 5 минут. Общая продолжительность ПЦР – 3,5 часа. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) была произведена на ДНК-амплификаторе DNA Engine Cycler PTC-200 фирмы Bio-Rad Laboratories (США). Результат: Контроль показал чистоту реактивов от контаминации. Сработал только положительный контроль (см. Форез №1). 3) 3-й этап: воздействие мр3 записи, произведённой с ПЦР-продукта участка плазмиды длиной 547 п.н., на ПЦР-систему с ДНК-специфичными праймерами. См. форез №2. ПЦР-программу для отрицательного контроля и для всех экспериментов получения ДНК со звуком осуществляли в интервале времени: 11.00-15.30. Для эксперимента со звуком использовали оставшиеся после проведения отрицательного контроля ПЦР-пробирки. Пять экспериментальных пробирок, не открывая крышки, чтобы предотвратить контаминацию вещественной ДНК, обрабатывали звуком с динамика, расположенного снизу в непосредственной близости (4-5 см) от них. Воздействие звуком осуществлялось в течение 30 минут непосредственно перед постановкой ПЦР. В пробирку с положительным контролем была добавлена вещественная ДНК-матрица исходной плазмиды. Условия проведения ПЦР были аналогичными постановке отрицательного контроля (см. п.2). Результат: Прямая наработка ДНК-продукта со звуковой записи с использованием ДНК-специфичных праймеров не получилась (см. Форез №2). Сработал только положительный контроль. Что ещё раз подтвердило чистоту реактивов от контаминации. 2-я часть эксперимента Непрямое получение ДНК-продуктов со звуковой записи спектров мШЭИ лазера (mp3 файл), произведённых с участка плазмиды длиной 547 п.н., с использованием сначала свободных Random праймеров, а потом специфических праймеров. Во второй части эксперимента мы пытались получить ДНК-продукт сначала с неспецифических Random-праймеров, а потом использовали специфические ПЦР-праймеры, фланкирующие участок плазмиды 547 п.н., который использовали для записи на лазере. Мы предположили эффективность этой схемы, так как она показала эффективность с другими записями биообъектов (например, поджелудочной железы). Условия проведения эксперимента: 4) 1-й этап: приготовление исходных ПЦР-пробирок. Готовились стандартные реакционные смеси для ПЦР-анализа в количестве 14 пробирок. Приготовление смесей осуществлялось в стерильном ПЦР-боксе, предварительно обработанном УФ-излучением для предотвращения контаминации. Все ПЦР-реактивы, включая стерильную воду, хранились в замороженном виде при -20° С в холодильнике и размораживались непосредственно перед приготовлением ПЦР-смесей. Каждая ПЦР-смесь содержала: стерильную специально очищенную воду, магний-содержащий буфер, смесь трифосфатов (dNTPs), Random-праймеры, термостабильную Taq ДНК-полимеразу. После приготовления смесей все пробирки, за исключением положительного контроля, закрывались и больше не открывались до этапа электрофоретического анализа результатов ПЦР (очень важно для доказательства безматричного синтеза). Все ПЦР-пробирки хранились в холодильнике при +6-+8° С, чтобы обеспечить сохранность реактивов. 5) 2-й этап: постановка отрицательного контроля ПЦР и оценка «чистоты реактивов» ПЦР-сиситемы с Random-праймерами от контаминации. См. форез №3 Для это использовали первые 7 ПЦР-пробирок из исходных 14-ти. 6 пробирок оставили без изменений (без открытия крышки с момента приготовления), в 7-ю пробирку была добавлена вещественная ДНК-матрица исходной плазмидной ДНК (положительный контроль ПЦР). Была проведена полимеразная цепная реакция в течение 40 циклов со следующим температурным режимом: первичная денатурация при 95° С – 3 минуты, в каждом цикле: денатурация 94° С – 1 минута, отжиг 30° С – 1 минута, элонгация 72° С – 1 минута, завершающая элонгация - 5 минут. Общая продолжительность ПЦР – 4,5 часа. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) была произведена на ДНК-амплификаторе DNA Engine Cycler PTC-200 фирмы Bio-Rad Laboratories (США). Результат: Контроль показал чистоту реактивов от контаминации. Сработал только положительный контроль (см. Форез №3). 6) 3-й этап: воздействие мр3 записи, произведённой с ПЦР-продукта участка плазмиды длиной 547 п.н., на ПЦР-систему с Random-праймерами. См. форез №4. ПЦР-программу для отрицательного контроля и для всех экспериментов получения ДНК со звуком осуществляли в интервале времени: 11.00-15.30. Для эксперимента со звуком использовали оставшиеся после проведения отрицательного контроля ПЦР-пробирки. Пять экспериментальных пробирок, не открывая крышки, чтобы предотвратить контаминацию вещественной ДНК, обрабатывали звуком с динамика, расположенного снизу в непосредственной близости (4-5 см) от них. Воздействие звуком осуществлялось в течение 30 минут непосредственно перед постановкой ПЦР. В пробирку с положительным контролем была добавлена вещественная ДНК-матрица исходной плазмиды. Условия проведения ПЦР были аналогичными постановке отрицательного контроля (см. п.2). Результат: Непрямая наработка ДНК-продукта со звуковой записи с использованием неспецифических Random-праймеров получилась (см. Форез №4). Наработка вариабельных ДНК-шмеров подтвердило эффективность использования универсальных неспецифических праймеров для получения ДНК-продуктов с использованием звуковых записей. 7) 4-й этап: воздействие мр3 записи, произведённой с ПЦР-продукта участка плазмиды длиной 547 п.н., на ПЦР-систему со Random-праймерами. См. форез №4. Пять экспериментальных ДНК-образцов (шмеров), полученных в предыдущей части эксперимента с использованием Random-праймеров при воздействии звука, использовали в ПЦР-системе с ДНК-специфичными праймерами, аналогично 1-й части эксперимента. Все этапы постановки ПЦР были такими же, как в 1-й части эксперимента. Для постановки ПЦР-реакций использовались оставшиеся в ходе первой части эксперимента ПЦР-пробирки. Чистота реактивов от контаминации была подтверждена ранее (см. Форез №1). Результат: Непрямая наработка ДНК-продукта со звуковой записи с использованием сначала неспецифических Random-праймеров, а затем специфических праймеров показала хорошую эффективность. Были наработаны ДНК-продукты целевой длины 547 п.н. (см. Форез №5). Фореграммы разделения продуктов ПЦР-реакций в 2% агарозном геле Форез №1: Предварительный Отриц. Контроль «на чистоту реактивов» ПЦР-системы со специфическими праймерами. 1-6 – Отрицательный контроль (фон до звука) – без добавления вещественной ДНК-матрицы. 7 – Положительный контроль ПЦР (добавлена плазмидная ДНК 50 нг). 8 – 100 bp маркер длин фрагментов, видны фрагменты 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500 п.н. Форез №2: Воздействие звука (mp3 файл) на ПЦР-систему со специфическими праймерами. Интервал воздействия звука: 10.30-11.00. Интервал проведения ПЦР: 11.00-15.00 1-5 – Экспериментальные пробирки, на которые воздействовал звук без добавления вещественной ДНК-матрицы (запись участка плазмиды 547 п.н. от 01.12.2015). 6 – Положительный контроль ПЦР (добавлена плазмидная ДНК 50 нг). 7 – Отрицательный контроль на момент постановки ПЦР (пробирка хранилась в другой комнате, чтобы предотвратить воздействие звуком). 8 – 100 bp маркер длин фрагментов, видны фрагменты 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500 п.н. Форез №3: Предварительный Отриц. Контроль «на чистоту реактивов» ПЦР-системы с неспецифическими Random-праймерами. 1-6 – Отрицательный контроль (фон до звука) – без добавления вещественной ДНК-матрицы. 7 – Положительный контроль ПЦР (добавлена плазмидная ДНК 50 нг). 8 – 100 bp маркер длин фрагментов, видны фрагменты 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500 п.н. Форез №4: Воздействие звука (mp3 файл) на ПЦР-систему с неспецифическими Random-праймерами. Интервал воздействия звука: 10.30-11.00. Интервал проведения ПЦР: 11.00-15.30 1-5 – Экспериментальные пробирки, на которые воздействовал звук без добавления вещественной ДНК-матрицы (запись от 01.12.2015). 6 – Положительный контроль ПЦР (добавлена плазмидная ДНК 50 нг). 7 – Отрицательный контроль на момент постановки ПЦР (пробирка хранилась в другой комнате, чтобы предотвратить воздействие звуком). 8 – 100 bp маркер длин фрагментов, видны фрагменты 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500 п.н. Форез №5: Наработка целевых ДНК-продуктов в ПЦР-системе со специфическими праймерами на основе суммарной фракции ДНК, предварительно полученной с использованием Random-праймеров. 1-5 – Экспериментальные пробирки, в качестве ДНК-матрицы использовались ДНК-образцы, полученные с помощью звука и Random-праймеров. 6 – Положительный контроль ПЦР (добавлена плазмидная ДНК 50 нг). 7 – Отрицательный контроль ПЦР на момент проведения ПЦР (пробирка хранилась в другой комнате, чтобы предотвратить воздействие звуком). 8 – 100 bp маркер длин фрагментов, видны фрагменты 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 и 1500 п.н. Денситометрический анализ уровней флуоресцентных сигналов образцов ДНК, полученных в ходе электрофоретического разделения Полученные электрофореграммы подвергали денситометрическому анализу в программе LabWorks (UVP BioImaging Systems. Cambridge, UK). Уровень сигналов оценивали по общей площади (Total Area) распределения флуоресцентного сигнала ДНК-образцов, окрашенных интеркалирующим красителем Bright Green DNA (аналог SYBR Green). Учитывалась площадь сигнала, соответствующая целевой длине ПЦР-продукта исследуемого участка плазмиды. При использовании Random-праймеров учитывалась общая площадь полученных ДНК-шмеров. См. Приложение: Денситометрический анализ образцов ДНК, полученных в ходе ПЦР. Выводы: 1) Постановка многократных отрицательных контролей на чистоту реактивов с высокой степенью уверенности исключает вероятность засорения (контаминации) экспериментальных пробирок вещественной ДНК, так как пробирки не открывались с момента приготовления ПЦР-смесей. Если бы произошла контаминация, то она, скорее всего, проявилась бы в отрицательном контроле, а он был абсолютно чистым, что подтвердил денситометрический анализ. 2) Форезы с отрицательным контролем, как в системе со специфическими, так и неспецифическими праймерами, свидетельствуют об отсутствии фантомов записи плазмидного продукта, записанного в 2015 году. Кроме того многочисленные эксперименты с неспецифическими Random-праймерами показали, что синтеза какого-либо ДНК-продукта без вещественной ДНК матрицы и в отсуствии других факторов (например, звука лазера) не происходит. Поэтому это не подтверждает мысль о том, что какая-либо генетическая информация, например, коронавируса может без иницирующего фактора передаваться фантомным путём. Если бы это было так, мы поймали бы ДНК-шмеры в отрицательном контроле для ПЦР-системы с Random-праймерами. А мы много раз ставили эти контроли (в эксперименте с фотографией, в опыте с поджелудочной, в этом эксперименте). Все они были отрицательными, никаких фантомов не было поймано. И это хорошо, потому что, если бы были шмеры в отрицательном контроле, то трудно было бы доказать, что это не контаминация. Доказать, что-нибудь в этом случае невозможно. Чистота реактивов в отрицательном контроле – это главное условие ПЦР-анализа. 3) Прямая наработка ДНК-продукта со звуковой записи с использованием сразу специфических праймеров не получилась (см. Форез №2). Непрямая наработка ДНК-продукта со звуковой записи с использованием сначала неспецифических Random-праймеров, а затем специфических праймеров показала хорошую эффективность. Были наработаны вариабельные по своей интенсивности ДНК-продукты целевой длины 547 п.н. (см. Форез №5). 4) Таким образом, это показывает, что одни звуковые записи не несут настолько полноценной генетической информации, чтобы обеспечить синтез целевого ДНК-продукта сразу с использованием прямых ДНК-специфичных праймеров. Сначала нужно получить фракцию ДНК на неспецифических свободных (Random) праймерах, так как они обладают сродством к любой ДНК, а следовательно к любой генетической информации. Видимо этим праймерам легче взаимодействовать со звуковыми эквивалентами ДНК. А потом уже на втором этапе эта ДНК используется в ПЦР-системе со специфичными праймерами (в данном случае праймерами, фланкирующими участок плазмиды длиной 547 п.н.). 5) В дальнейшем нужно провести обязательное секвенирование полученных целевых ДНК-продуктов 547 п.н., как мы это делали ранее в статье 2016 г. Это подтвердит их принадлежность к исходной плазмиде. Это необходимо сделать для того, чтобы исключить вероятность синтеза другой ДНК-последовательности, которая обладает похожей длиной. Например, недавно в прошлом эксперименте мы получали продукты генов поджелудочной железы той же целевой длины, возможно, сохранились фантомы этой звуковой записи. |
Шаолинь Постоянный участник |
|
P.P.Gariaev Участник |
Gariaev, P. P., Vladychenskaya, I. P. & Leonova-Gariaeva, E. A., PCR Amplification of Phantom DNA Recorded as Potential Quantum Equivalent of Material DNA. DNA Decipher Journal | March 2016 | Volume 6| Issue 1 | pp. 01-11 |
P.P.Gariaev Участник |
Этап секвенирования образцов ПЦР-продуктов, полученных в эксперименте со звуковой записью участка плазмиды длиной 547 п.н. (Запись wave файл от 01.12.2015) Секвенированию подвергались чёткие целевые ПЦР-продукты, полученные во второй части эксперимента. Это ПЦР-продукты, полученные со звуковой записи спектров мШЭИ лазера (wave файл) с использованием сначала свободных Random праймеров, а потом специфических праймеров. Это дорожки 1-6 на форезе №5 (см. предыдущий отчёт): 1-5 – Экспериментальные пробирки, в качестве ДНК-матрицы использовались ДНК-образцы, полученные с помощью звука и Random-праймеров. 6 – Положительный контроль ПЦР (добавлена исходная плазмидная ДНК - 50 нг, содержащая целевую синтетическую вставку длиной 547 п.н.). Секвенирование производилось на генетическом анализаторе фирмы Applied Biosystems 3500 c использованием одного из пары исходных ПЦР-праймеров. Название праймера Последовательность Длина полного целевого ПЦР-продукта с учётом обоих ПЦР-праймеров 547_GUSL-rev TGCCCGCTTCCAAACCAATGCCT 547 п.н. Использовался следующий праймер для секвенирования ПЦР-фрагментов: Каждый из образцов ПЦР-продуктов нужной целевой длины был предварительно экстрагирован из агарозного геля при проведении аналитического электрофореза с помощью набора для очистки ДНК с использованием специального буфера и магнитных частиц производства компании Sileks (Россия). Полученные с секвенатора данные анализировались в программе Chromas Lite в формате «.ab1» и переводились в текстовый формат представления нуклеотидных последовательностей FASTA для последующего анализа нуклеотидных гомологий с целевой последовательностью участка плазмиды. Анализу гомологий полученных нуклеотидных последовательностей с целевой последовательностью подвергались значимые области секвенирования (отмечены чёрным цветом) за вычетом начальной нестабильной зоны отжига секвенирующего праймера и добавочных А-нуклеотидов по краям ПЦР-фрагмента, которые являются особенностью синтеза ДНК с помощью Taq-полимеразы и не учитываются при анализе. Незначимая для сравнительного анализа область отмечена красным цветом (см. FASTA последовательности результатов секвенирования). FASTA последовательности результатов секвенирования Образец 1 >S_ sequence exported from 547(W1)_GUSL-rev_A1.ab1 AATGATCTGAATGGAAAGGTCGCAATTTACATGAAAGCACCACGATGCCATGTTCATCTGCCCAGTCGAGCATCTCTTCAGCGTAAGGGTAATGCCAGGT ACGGTAGGAGTTGGCCCCAATCCAGTCCATTAATGCGTGCAATAAAGTTTCTTAAGATTGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATCATATAATTTC TGTTGAATTACGTTAAGCATGTAATAATTAACATGTAATGCATGACGTTATTTATGAGATGGGTTTTTATGATTAGAGTCCCCCAATTATACATTTAATA CGCGATAGAAAACAAAATATAGCGCGCAAGGACAGTAGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCTATCATTCAAGAT GCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTTGATTGAT GTGACATCTCCACTGACGTAAGGA Образец 2 >S_ sequence exported from 547(W2)_GUSL-rev_A2.ab1 AAAGATCTGAATGGAAGGCTCGCAAATTTACATGAAAGACCACCACGATGCCATGTTCATCTGCCCAGTCGAGCATCTCTTCAGCGTAAGGGTAATGCCA GGTACGGTAGGAGTTGGCCCCAATCCAGTCCATTAATGCGTGCAATAAAGTTTCTTAAGATTGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATCATATAAT TTCTGTTGAATTACGTTAAGCATGTAATAATTAACATGTAATGCATGACGTTATTTATGAGATGGGTTTTTATGATTAGAGTCCCCCAATTATACATTTA ATACGCGATAGAAAACAAAATATAGCGCGCAAGGACAGTAGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCTATCATTCAA GATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTTGATT GATGTGACATCTCCACTGACGTAAGGA Образец 3 >S_ sequence exported from 547(W3)_GUSL-rev_A3.ab1 AATGAGGGAATTAAGCGACAGCAGCAAGTTTCATCAATCACCACGATGCCATGTTCATCTGCCCAGTCGAGCATCTCTTCAGCGTAAGGGTAATGCCAGG TACGGTAGGAGTTGGCCCCAATCCAGTCCATTAATGCGTGCAATAAAGTTTCTTAAGATTGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATCATATAATTT CTGTTGAATTACGTTAAGCATGTAATAATTAACATGTAATGCATGACGTTATTTATGAGATGGGTTTTTATGATTAGAGTCCCCCAATTATACATTTAAT ACGCGATAGAAAACAAAATATAGCGCGCAAGGACAGTAGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCTATCATTCAAGA TGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTTGATTGA TGTGACATCTCCACTGAACGTAAGGA Образец 4 >S_ sequence exported from 547(W4)_GUSL-rev_A4.ab1 ATGATCTGAATGGAAGGCTCGCAATTTACATGTAAGACGACCACGATGCCATGTTCATCTGCCCAGTCGAGCATCTCTTCAGCGTAAGGGTAATGCCAGG TACGGTAGGAGTTGGCCCCAATCCAGTCCATTAATGCGTGCAATAAAGTTTCTTAAGATTGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATCATATAATTT CTGTTGAATTACGTTAAGCATGTAATAATTAACATGTAATGCATGACGTTATTTATGAGATGGGTTTTTATGATTAGAGTCCCCCAATTATACATTTAAT ACGCGATAGAAAACAAAATATAGCGCGCAAGGACAGTAGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCTATCATTCAAGA TGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTTGATTGA TGTGACATCTCCACTGACGTAAGGA Образец 5 >S_ sequence exported from 547(W5)_GUSL-rev_A5.ab1 AATGATCTGAATCGAAAGGTCGCAATTTACATGTAAGCACCACGATGCCATGTTCATCTGCCCAGTCGAGCATCTCTTCAGCGTAAGGGTAATGCCAGGT ACGGTAGGAGTTGGCCCCAATCCAGTCCATTAATGCGTGCAATAAAGTTTCTTAAGATTGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATCATATAATTTC TGTTGAATTACGTTAAGCATGTAATAATTAACATGTAATGCATGACGTTATTTATGAGATGGGTTTTTATGATTAGAGTCCCCCAATTATACATTTAATA CGCGATAGAAAACAAAATATAGCGCGCAAGGACAGTAGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCTATCATTCAAGAT GCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTTGATTGAT GTGACATCTCCACTGACGTAAGGA Образец 6 >S_ sequence exported from 547(K+)_GUSL-rev_A6.ab1 AATGATCGTAATCGACCGAAGGCAGGСAGTTTCATCAATCACCACGATGCCATGTTCATCTGCCCAGTCGAGCATCTCTTCAGCGTAAGGGTAATGCCAG GTACGGTAGGAGTTGGCCCCAATCCAGTCCATTAATGCGTGCAATAAAGTTTCTTAAGATTGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATCATATAATT TCTGTTGAATTACGTTAAGCATGTAATAATTAACATGTAATGCATGACGTTATTTATGAGATGGGTTTTTATGATTAGAGTCCCCCAATTATACATTTAA TACGCGATAGAAAACAAAATATAGCGCGCAAGGACAGTAGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCTATCATTCAAG ATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTTGATTG ATGTGACATCTCCACTGACGTAAGGA Анализ секвенирования образцов ПЦР-продуктов, полученных с помощью звуковой записи участка плазмиды длиной 547 п.н. (Запись wave файл от 01.12.2015) Название образца Описание образца Общий размер секвенированного ПЦР-продукта с учётом праймера для секвенирования и добавочных нуклеотидов по концам Общий размер секвенированной области без учёта секвенирующего праймера Размер значимой секвенированной области без зоны нестабильного отжига праймера и добавочных концевых нуклеотидов Размер нестабильной зоны начального секвенирования Процент идентичности целевой генной последовательности по данным анализа значимой области секвенирования 1. 547(W1)_GUSL-rev_A1 Эксперимен-тальный 547 п.н. 524 п.н. 483 п.н. 40 п.н. 100% идентичности 2. 547(W2)_GUSL-rev_A2 Эксперимен-тальный 550 п.н. 527 п.н. 483 п.н. 43 п.н. 100% идентичности 3. 547(W3)_GUSL-rev_A3 Эксперимен-тальный 549 п.н. 526 п.н. 484 п.н. 41 п.н. 100% идентичности 4. 547(W4)_GUSL-rev_A4 Эксперимен-тальный 548 п.н. 525 п.н. 483 п.н. 41 п.н. 100% идентичности 5. 547(W5)_GUSL-rev_A5 Эксперимен-тальный 547 п.н. 524 п.н. 483 п.н. 40 п.н. 100 % идентичности 6. 547(K+)_GUSL-rev_A6 контрольный 548 п.н. 525 п.н. 504 п.н. 20 п.н. 100% идентичности ЗАКЛЮЧЕНИЕ: 1) Экспериментальные образцы ПЦР-продуктов, полученные с использованием звуковой записи участка плазмиды длиной 547 п.н., как донора генетической информации, абсолютно идентичны контрольному образцу и исходной последовательности, с которой производилось считывание по данным анализа значимой области секвенирования (100% идентичности). 2) Наличие стопроцентной идентичности исходной последовательности по данным анализа значимой области секвенирования свидетельствует о возможности дистанционной передачи генетической информации с помощью звука с высокой степенью точности и специфичности. Звуковая запись была произведена несколько лет назад и сохранила свою активность, что свидетельствует о её долговременности и возможности использования для долгосрочного хранения и передачи генетической информации. Однако запись имеет ограничения точности передачи генетической информации в начальный момент отжига праймеров. 3) Размер начальной нестабильной зоны секвенирования, связанный с возможной нестабильностью отжига секвенирующего праймера, при хорошем качестве секвенирования не должен превышать 20-30 п.н. Эта зона, обычно не учитывающаяся при анализе нуклеотидных последовательностей, резко различается при сравнении образцов, полученных на геномной матрице (контрольный образец) и образцов, полученных с помощью звука. Нестабильная зона начального секвенирования для образца положительного контроля, полученного на геномной матрице, составила всего 20 п.н. Эта зона резко возросла в экспериментальных образцах до 40-43 п.н, полученных с помощью звука. Это выше допустимого уровня и свидетельствует о возможном искажении записи генетической информации в месте отжига секвенирующего праймера. Аналогичные данные мы получили и в других экспериментах со звуком. 4) Интересен факт, что все экспериментальные образцы характеризовались идентичной зоной значимой области секвенирования, то есть области со стабильной нуклеотидной последовательностью. Складывается впечатление, что сохранился довольно устойчивый фон неискажённой генетической записи, характерный для участка именно в 483 п.н. Остальной участок, прилегающий к этой области левее очень вариабелен, что, видимо, связано с механизмом нестабильности начального отжига праймера на волновой матрице ДНК в первых циклах синтеза ДНК-продукта. 5) Эксперимент с использованием звуковой записи свидетельствует, что волновая ПЦР с использованием звука, как переносчика генетической информации, значительно более нестабильна в начальный момент элонгации праймеров, чем обычная ПЦР на вещественной ДНК-матрице. С одной стороны лазер может записывать и переносить генетическую информацию со 100% точностью, но начальная область в месте отжига праймера очень нестабильна, так как не понятна сама природа того, как и на чём отжигается праймер без вещественной ДНК, и, как начинается сам синтез ДНК на начальном этапе. Это следует учитывать с точки зрения генетической безопасности. 6) Синтез целевого ДНК-продукта в экспериментальном образце ПЦР-реакции в результате контаминации вещественной ДНК-матрицей маловероятен, так как проводились множественные отрицательные контроли на чистоту реактивов. При этом по сравнению с контрольными образцами, полученными с использованием геномной ДНК-матрицы, в экспериментальных образцах значительно возросло количество нуклеотидных несоответствий в начальной области секвенирования. В случае простой контаминации образцов все ПЦР-продукты должны быть идентичны друг другу и исходной последовательности. При этом зона начального нестабильного секвенирования не превышала бы 20-24 п.н., как показали многочисленные контрольные образцы на геномной матрице в нашей лаборатории. Дополнение: 7) Возможно влияние предыдущих звуковых записей, так как в течение прошедших месяцев мы использовали сходные по размерам генные последовательности, полученные со звуковых записей поджелудочной железы человека, а ещё ранее с детской фотографии. Однако анализ секвенирования показал, что вмешательства записанных ранее генных последовательностей не наблюдается. Это хорошо с точки зрения точности передачи генетической информации. Однако этот факт был установлен после использования геноспецифических ПЦР-праймеров, которые показывают высокую специфичность в отношении генных последовательностей. Нужно проверить исходный пул суммарной ДНК, полученный с помощью Random-праймеров, на наличие остаточной записи от предыдущих звуковых записей. Например, поискать там гены поджелудочной железы. Дело в том, что в обоих экспериментах (и с поджелудочной железой, и с записью участка 547 п.н., и с фотографией) на первом этапе мы использовали Random-праймеры. Этот этап идентичен, поэтому, возможно неспецифические праймеры захватили волновые копии не только ДНК плазмиды, но и фантомный остаток ДНК звуковой записи поджелудочной железы или фотографии. 8) Будет важно найти, например, панкреатические гены в общем пуле суммарной ДНК, полученной для эксперимента с участком плазмиды. Ведь это докажет, что универсальные праймеры со свободной нуклеотидной последовательностью, которые в живых организмах могут использоваться, например, в РНК-форме, для начала транскрипции генов или репликации ДНК, могут создавать общий пул, который может образовываться с использованием волновых эквивалентов генов. Мпжно поискать гены от предыдущих записей сейчас, пока сохранился фантом записей, который сможет сработать на пуле суммарной ДНК, полученной с Random-праймеров. Если мы их найдём, то нужен будет сиквенс для подтверждения. |
P.P.Gariaev Участник |
Сообщение было отредактировано P.P.Gariaev - 11.07.2020 11:05 |
Шаолинь Постоянный участник |
(P.P.Gariaev @ 11.07.2020 10:11) Вот ссылка на первую статью по Плазмиде. Там полный протокол. Gariaev, P. P., Vladychenskaya, I. P. & Leonova-Gariaeva, E. A., PCR Amplification of Phantom DNA Recorded as Potential Quantum Equivalent of Material DNA. DNA Decipher Journal | March 2016 | Volume 6| Issue 1 | pp. 01-11 сам написал ссылку в PubMed не индексирован |
Шаолинь Постоянный участник |
(P.P.Gariaev @ 11.07.2020 11:52) сэр я не читаю фигню не индексируваную в PubMed |
Шаолинь Постоянный участник |
(P.P.Gariaev @ 11.07.2020 10:11) Вот ссылка на первую статью по Плазмиде. Там полный протокол. Gariaev, P. P., Vladychenskaya, I. P. & Leonova-Gariaeva, E. A., PCR Amplification of Phantom DNA Recorded as Potential Quantum Equivalent of Material DNA. DNA Decipher Journal | March 2016 | Volume 6| Issue 1 | pp. 01-11 |
dk Постоянный участник Россия |
|
P.P.Gariaev Участник |
(dk @ 11.07.2020 13:36) Ну хоть выяснили что это pPLV. Правда, там есть несколько замен, ну да ладно. Но вот я даже не представляю где этот вектор найти-то. Ну почему было не взять что-то более распространённое. Может кто подскажет где такое чудо водится? Пока же можно с праймерами и "музыкой" поиграться, без +контроля. Играйтесь на своё усмотрение. Воспроизведете - будет не слабо. А музыку откуда взяли? Я только задумал переслать её через свой сайт |
dk Постоянный участник Россия |
|
Шаолинь Постоянный участник |
(P.P.Gariaev @ 11.07.2020 16:03) Играйтесь на своё усмотрение. Воспроизведете - будет не слабо. А музыку откуда взяли? Я только задумал переслать её через свой сайт |
P.P.Gariaev Участник |
(dk @ 11.07.2020 17:13) А почему опция закачки файлов не работает? Прямо бы через нее и выслал бы запись звука плазмиды. Попросил сотрудника выслать Вам запись. |
vb Постоянный участник |
|
vb Постоянный участник |
|
P.P.Gariaev Участник |
Сообщение было отредактировано P.P.Gariaev - 12.07.2020 08:37 |
P.P.Gariaev Участник |
Впереди - Речь генов с замыканием на Сознание. А горизонты этого уходят в беЗконечность. |
dk Постоянный участник Россия |
|
vb Постоянный участник |
(P.P.Gariaev @ 12.07.2020 09:39) dk и vb сделали большой шаг вперед в понимании, что есть Жизнь и Сознание. Впереди - Речь генов с замыканием на Сознание. А горизонты этого уходят в беЗконечность. не-не-не, я такое не курю папрашу меня сюда не приплетать. |
P.P.Gariaev Участник |
(vb @ 12.07.2020 22:21) А что же пискнули не в свою дудку? |
P.P.Gariaev Участник |
(dk @ 12.07.2020 20:03) Есть такая штука - файлообменники. Есть вариант с тем же Яндекс.Диском. Лично я выступаю за максимальную открытость - пусть будет официальный протокол, с официальным авторской mp3'шкой. А то потом будет 100500 обвинений. Праймеры закажу вместе со своими в "Еврогене" - к ним нареканий не было, варят мне уж не один год. pPLV не нашёл, мои знакомые таким вектором не пользуются. Фиг с ним, обойдёмся без него - уж точно ничем не законтоминируется! Ведь "непорочное зачатие" должно произойти от "музыки" - вот и проверим. Хотя во всех лабораториях, где ставять минус-контроль кроме как от "засёра" в пустых пробирках ПЦР-продукт не возникает. Просто мне лично надоело из года в год одно и то же "волногониво" на этом форуме пережёвывать. Вы жуете себя. Предложил Вам прислать "музыку плазмиды" по эл. почте. Вас не устраивает почему-то. Создайте отдельную почту, пришлю по ней. И файлообменник не нужен. Протокол наших экспериментов по "непорочному зачатию" опубликован в нашей статье 2016 года. Ссылку приводил многократно. Прислал новый протокол, см. выше. ПЦР-ы не могу выложить, опцию заливки картинок убрали (для меня?). Что-то виляете, dk. |
P.P.Gariaev Участник |
|
dk Постоянный участник Россия |
Пока же мы имеем официальный протокол такой: Праймеры - 5'-TGCCCGCTTCCAAACCAATGCCT-3' 5'-CCTTACGTCAGTGGAGATGTCACA-3' Программа ПЦР - первичная денатурация при 95° С – 3 минуты, в каждом цикле: денатурация 94° С – 1 минута, отжиг 68° С – 1 минута, элонгация 72° С – 1 минута, завершающая элонгация - 5 минут. Дизайн эксперимента: формируем ПЦР-микс с праймерами но без матрицы, играем "музыку", ставим ПЦР, на геле должен быть продукт реакции. Всё верно? Автор методики с этим согласен? |
P.P.Gariaev Участник |
PPG: Сколько угодно можно ставить минус-контроли и будете получать ДНК-мусор, если грязно в лаборатории и сами не очень чисты. Но если проэспонировать минус-контрольное (ЧИСТОЕ) пространство, где ставите ПЦР, и при этом получаете ДНК продукт при использовании универсальных праймеров, ловящих любую ДНК и дающих размытую полосу ДНК шмеров, то это другое дело. Читайте наш протокол. Это будет означать, что в окружающем пространстве есть фантомы (квантовые эквиваленты) ДНК. Если шмеры сконцентрировать, экспонировать окружающее пространство ими и использовать спец. праймеры на определенные последовательности ДНК, то их и можно вытащить и секвенировать. Как мы и делали, вытаскивая определенные гены клеток поджелудочной железы из ДНК-шмеров. Но вы получите ПЦР продукты генов, если предварительно экспонировали пространство ПЦР мШЭИ клеток поджелудочной железы, либо шмерами, полученными после экспонирования ими. Если не поняли это, бесполезно работать с Вами, "понявшим" сказанное сейчас как "волногониво". |
P.P.Gariaev Участник |
(dk @ 13.07.2020 12:14) Ещё раз - выложите свою, официальную mp3'шку через файлообменник или ещё как - именно лично от П.П.Гаряева. Чтобы ни у кого на МолБиоле не было сомнений в чистоте эксперимента. Пока же мы имеем официальный протокол такой: Праймеры - 5'-TGCCCGCTTCCAAACCAATGCCT-3' 5'-CCTTACGTCAGTGGAGATGTCACA-3' Программа ПЦР - первичная денатурация при 95° С – 3 минуты, в каждом цикле: денатурация 94° С – 1 минута, отжиг 68° С – 1 минута, элонгация 72° С – 1 минута, завершающая элонгация - 5 минут. Дизайн эксперимента: формируем ПЦР-микс с праймерами но без матрицы, играем "музыку", ставим ПЦР, на геле должен быть продукт реакции. Всё верно? Автор методики с этим согласен? Все верно. Только не могу переслать Вам мп3 запись ДНК фрагмента плазмиды (547пн). Вы не даете свою эл. почту или разовую эл. почту только для пересылки 547пн. Давно готов сделать это. Дайте почту. Никаких проблем. |
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |