Сложные буфера

Рецепты приготовления и свойства буферов и растворов, применяемых в молекулярной биологии (крупнейшая коллекция в интернете). Все рецепты автоматически пересчитываются для произвольного объёма. Обычно указывается вес компонентов, так что раствор можно приготовить на весах без использования мерной посуды.



Здравствуйте. Помогите пожалуйста. Срочно нужна пропись приготовления 0,1 М фосфатного буфера(натриевого)рН-9,4. Я смотрела способ приготовления в древних книгах - там только до рН-8,5. Если кто знает пришлите, пожалуйста, на электронный адрес:
nataly-123@list.ru
Это очень важно и нужно для меня.
hista. Спасибо.



вы не написали какой объем буфера вам нужен. обозначу его V (в литрах)
берете навеску Na2HPO4 м=142*0,1*V масса в граммах. растворяете ее в объеме немного меньшем V, затем берете NaOH и на рН-метре доводите рН затем доводите объем до нужного. фсе.
иногда Na2HPO4 бывает в виде кристаллогидратов (на банке посмотрите)если это так, то вместо 142 в формулу нужно будет подставить мол. массу кристаллогидрата - 142+(колво молекул H20)*18
а вы уверены что вам нужет именно фосфатный буфер, а не боратный например? фосфат при 9.4 буферить не будет.



блин, не помню какой будет рН раствора Na2HPO4 достаточно щелочной, не помню, больше нужного вам или нет. если нет, то все ок. если да, то возьмите NaH2PO4 (его мол.масса 120) тоже бывает в виде кристаллогидратов.

все это скинула на мейл



оффтоп

фосфатный буфер - это паранойя!
я думаю, что Редактору надо на стартовой странице
привесить ссылку на "Метды приготовления Фосфатных БуферОв"



и не буферА они.... эти - совсем в дргом месте...
а бУферы
ну... не могу уже...



ох, Oleg Klychnikov, как жаль что дают цветочек добавить только один раз. за пост о "буферАх" я бы вам сакуру в цвету вырастила!
а еще ежели к названиям придираться, то и фосфатный буфер ну страсть какой сложный замутить чтоль тему в беседе с названием типа "умеете ли вы готовить фосфатный буфер"?

а вообще то с такого хочется ... хрень какая то с образованием... надо с этим бороцца...

за оффтопик -



Букач- "Почетный борез с народным образованием"



Ниже приводится, если кому-то интересно, состав буфера для переноса (иммуноблот), которым мы пользуемся. Приведено количество для двадцатикратного стока и готового однократного буфера.

Transfer buffer

FW x20, mM 500 ml 1000 ml

Bicin 163.17 500 40.79 81.59
Bis-Tris 209.24 500 52.31 104.62
EDTA*4H20 452.24 10.2 2.31 4.61
Chlorobutanol* 177.46 5.4 0.48 0.96

1x готовый transfer buffer (1 L)

20x transfer buffer - 50 ml
Methanol abs. - 100 ml
Вода - до 1 л

*1,1,1-trichloro-2-methyl-2-propanol hydrate



Если у Вас на сайте есть эти растворы и я их проглядел - простите великодушно. А то пусть будут.

Среда для заморозки клеток:(100 ml)
50 ml DMEM (containing 4.5 g/L glucose,
110 mg/L sodium pyruvate and 2 mM
L-glutamine)
40 ml heat-inactivated fetal bovine serum
10 ml dimethylsulfoxide (DMSO)
Filter sterilize

буфер HBS:
280 mM NaCl
1.5 mM Na2HPO4
50 mM HEPES
Adjust the pH to 7.10 with NaOH

раствор Trypsin-EDTA:
0.53 mM EDTA
0.05% trypsin



Где можно купить "Kit for Molecular weight for gel electrophoresis"?



Для создателей этих таблиц!!!
Я даже не знаю стоит ли верить тому что здесь написано...
Например в таблице расчета "Смесь для окрашивания олигонуклеотидных гелей" расписаны количества реагентов на 100 ml но если все слить так как указано получится 110 ml где ошибка? Для кого это сделано...



Такой вот вопрос про буферы, новичковый. Часто встречаю прописи одного и того же буфера с некоторыми отличиями и добавками. Например, PBS.
1. Он бывает с калиевыми фосфатными солями, а бывает с натриевыми, или с теми и другими.
2. В него добавляют NaCl, а иногда KCl.
3. Добавляют ПЭГ, Tween.
На что все это влияет? На что влияет концентрация буфера (кроме ионной силы)?
Чем принципиально отличается PBS от Tris буфера?
Зачем в буфер добавляют азид натрия NaN3?
Спасибо заранее!



-- Часто встречаю прописи одного и того же буфера с некоторыми отличиями и добавками. Например, PBS.

А кто вам сказал что это один и тот же буфер. Это слэнг в некотором смысле, обозначающий рраствор примерно изотонический физиологическому и забуференный фосфатными солями с небольшой буферной емкостью.
---Добавляют ПЭГ, Tween.
Просто PBS с ПЭГ ом и Тв не бывает. Обычно пишут, что PBS с добавками того, сего, пятого.

---На что все это влияет?

На такой вопрос - ответ: на все, и не на что.

---На что влияет концентрация буфера (кроме ионной силы)?
От концентрации буфера зависит его емкость.

---Чем принципиально отличается PBS от Tris буфера?
--"А почему вы спрашиваете?" <c>
Чем принципиально отличается билистиллят от милипоровской воды?

Вот например такой ответ: трис дороже раз в десять. Или трис более сладкий на вкус.

1) почитайте учебник по буферам или хотя бы вводную статью в справочнике Доусона.
2) Почитайте учебник по питательным средам для клеточных культур.
После этого перезадайте свои вопросы.
3) И еще какой-нибудь мануал по имунохимии.

Правильно поставленный вопрос содержит половину ответа.(по этому вопросу обратитесь к рассказу Шекли "Ответчик", кажется называется)

---Зачем в буфер добавляют азид натрия NaN3?
Что бы убить того кто этим PBS будет питаться. Консервант это весьма своеобразный для лабораторного употребления тс.



День добрый! Такой вот вопросик: для лизирующего буфера важно значение рН? А то имеется пропись раствора и не указано рН.



Вы что лизируете? и какой материал смотреть будете после лизиса? а так в принципе рН важно, но может быть разным в зависимости от задач.



А кто вам сказал что это один и тот же буфер. Это слэнг в некотором смысле, обозначающий рраствор примерно изотонический физиологическому и забуференный фосфатными солями с небольшой буферной емкостью.

О'K, это не принципиально. Я искала методику по иммуноцитохимии, нашла энное кол-во. Во всех, понятное дело, принцип сходный, а буферы везде разные. Пытаюсь выбрать подходящий мне.

--Добавляют ПЭГ, Tween.
Просто PBS с ПЭГ ом и Тв не бывает. Обычно пишут, что PBS с добавками того, сего, пятого.

Да. пишут. Так вот, зачем добавляют? Чтобы улучшить проникновение чего-либо куда-нибудь? Улучшают свзязывание чего-то с чем-то?


---На что влияет концентрация буфера (кроме ионной силы)?
От концентрации буфера зависит его емкость.

Спасибо.

---Чем принципиально отличается PBS от Tris буфера?
--"А почему вы спрашиваете?" <c>
Чем принципиально отличается билистиллят от милипоровской воды?

Вот например такой ответ: трис дороже раз в десять. Или трис более сладкий на вкус.
За ответ спасибо. Спрашиваю потому, что есть в одних вариантах метода тот, а в других другой. Надо же выбрать, на каком делать
Про дистиллят, я кстати, тоже не знаю. То есть чем получение отличается знаю, а чем результат - нет.

1) почитайте учебник по буферам или хотя бы вводную статью в справочнике Доусона.
2) Почитайте учебник по питательным средам для клеточных культур.
После этого перезадайте свои вопросы.
3) И еще какой-нибудь мануал по имунохимии.

Правильно поставленный вопрос содержит половину ответа.(по этому вопросу обратитесь к рассказу Шекли "Ответчик", кажется называется)

За советы спасибо. От ссылки на "учебник по буферам" совсем бы не отказалась
---Зачем в буфер добавляют азид натрия NaN3?
Что бы убить того кто этим PBS будет питаться. Консервант это весьма своеобразный для лабораторного употребления тс.

Здесь это вряд ли, т.к. буфером надо пользваться "здесь и сейчас", процедура на несколько часов. Может он (азид натрия) влиять на сохранение клеточных структур?



Ух! Мария, вы просто провокатор.

---Чтобы улучшить проникновение чего-либо куда-нибудь?
Используют вазэлын.
---Так вот, зачем добавляют?
Что бы ухудшить неспецифические белок белковые взаимодействия. ПЭГ просто это интересно(я не встречал) возможно немного увеличивает действующую концентрацию АТ.
И все это можно почитать в книжке по иммунохимии.

---Надо же выбрать, на каком делать.
Вы работаете в эксперементальной области, использование умозрительных заключений здесь очень ограничено, что бы их делать надо иметь большой опыт с разными препаратами и разными антигенами. А вам надо либо попробовать один вариант и если он вас не устроит искать другой, либо попробовать несколько и выбрать лучший.

---Здесь это вряд ли, т.к. буфером надо пользваться "здесь и сейчас", процедура на несколько часов.

"А мужаки то не знали..."<c> Ну и че? На один препарат буфера уходит меньше 0.5мл, а делают его от 50 до 500мл за раз, шож его в помойку выливать.

---- Может он (азид натрия) влиять на сохранение клеточных структур?
Ну! почитайте, как он действует на ферменты и какие и сами решите может или не может. Его действие аналогично действию цианида.

---От ссылки на "учебник по буферам" совсем бы не отказалась
Любой учебник по качественному анализу для химических специальностей спасет вас. Например Алексеев(хотя формально он не для химиков) Гольбрайх практикум по неорганике и тд



ммм, спасибо вам за ответы на мои провокационные вопросы



В рецепте приготовления ТВЕ приведено довольно странное количество EDTA в граммах (43.84g), которое якобы следует взять, чтобы получить 1 литр 10хТВЕ. Хотелось бы узнать, откуда аффтар взял такой молярный вес EDTA (2192 г/моль)??? :)



Podskazhite, pozhluysta, chem dovodit pH v bufere MES? (2-N-morpholino-ethanesulfonic acid. Dolzhen byt 5.0, a poka tolko 3 :(



--Podskazhite, pozhluysta, chem dovodit pH v bufere MES? (2-N-morpholino-ethanesulfonic acid. Dolzhen byt 5.0, a poka tolko 3

---щелочью, его щелочью содиевой.



ДОбрый день.Мне надо для промывки ткани после окрашивания написанно промывать RBS чем можно заменить попроще может можно NaCL 0,9%?



помимо раствора Леммли ,есть у кого рецепты растворов для экстракции белков из мышечной ткани после теплового воздействия (варки, прогрева до 60 градусов или даже стерилизации) для дальнейшего SDS-электрофореза на фастгеле с градиентом 10-15



Подскажите как приготовить раствор: в 10 mM трис-HCl буфере рН 8,0; 1,0 mM ЕДТА с 2,5%SDS и 5% меркаптоэтанола. Буду очень благодарна



Здравствуйте! Очень нужен состав промывочного буфера для выделения polyA мРНК при помощи магнитных стрептавидиновых бус. Заранее большое спасибо.




Смешиванием запасных растворов (исключение - меркаптоэтанол, он -чистое вещество). Берёте калькулятор в ручки (или бумагу и карандашик) и вперёд. Если не знаете, как посчитать - идите в уборщицы или в журналисты, всем будет от того благо великое, и Вам тоже.

А, простите за любопытство, для чего такое офигительное количество меркаптоэтанола в растворе применяется?





наверное волосы завивать



Спасибо господа за джентельменский ответ, господь воздаст вам за доброту вашу.




А какой ответ Вы хотели?

Ладно, так значить:
Молярный Трис, рН 8 разбавить в 100 раз
Полумолярный ЕДТА в пятьсот раз
10% СДС в 4 раза
Меркаптоетанол.... Ну зависит от того, какие проценты Вам потребны. Впрочем, я не думаю, что при таком количестве есть существенная разница. Скажем, в 20 раз.

И того на литр раствора (!):

10 мл Триса
2 мл ЕДТА
250 мл СДС
50 мл (ну если хочется масс-объёмные проценты найдите в справочнике плотность) меркаптоэтанола (Ужоссс!)

Полегчало? Кушайте на здоровьице.

Дело в том, барышня, что такие расчёты должны уметь делать школьники старших классов если они не из интерната для альтернативно одарённых. Если для Вас простое разбавление это великое таинство, то продолжать попросту не стоит, молекулярная биология и биохимия явно не Ваша стезя. Сами измучаетесь и окружающих изведёте.



Да, воды, если БМЕ брать по объёму, 688 мл :D



Да, воду обычно берут как минимум дистиллированую...



На волосах лучше не передерживать. А Вы правда натуральная блондинка?





и шыш после этого рН 8.0 получится. если грубите, то хотя бы ошибок не делайте при этом.


Дилетантка, вопрос ваш и вправду детсадовский. но если он не отпал, пишите мне в личку.



Ну а потом - аккуратненько доводить до нужного рН



исходно этого сказано небыло. с чего запросто можно сделать вывод, что грозный гость скурил коэффициенты активности.

и доводить с мэ и сдс. хи-хи. чтоб один вонял на всю лабу (а на 5%, да на мешалоччке еще и соседи придут в гости с недобрыми намерениями), а от другого электроды отмывать до посинения. так что не запутывайте деушку )

сначала трис, эдта и вода (чуть меньше, чем нужно), потом рН, потом мэ и сдс. ну и опять вода до нужного объёму.



Букач
Что хочу, то и делаю. Это не ошибка, это практика. Довольно общая. Про сдвиг рН при разведении я в курсе, равно как и про температурный сдвиг. Необходимость доведения сильно зависит от целей, с какими буфер применяется, и от того, доводили ли его те, кто методику придумал. Очень может быть, что не доводили. Я для хроматографии не довожу. Белки от этого грязнее не становятся и душа ни фига не болит.

Кроме того, если девочка задаёт такие вопросы, то разницы для конечного результата вообще нет. Из неё даже лаборант не получится.

А уж если докапываться до "ошИбок", то "шИш" пишется таки через И.




если вы взялись объяснять человеку КАК сделать, то делайте это по-человечески. а с таким подходом лучше б вы просто оставили последний абзац своего поста.

если методику пишут нормальные люди, то они видят разницу между "буфер с рН 8.0, разведённый во столько то раз" или "буфер с рН 8,0". так и пишут.
в вопросе было второе. потому ошибка.

ну нельзя так. не осуждайте. вполне возможно, что не повезло ей с учителями. может, если б ктонить ей толком один раз объяснил, как это делается, то и проблем бы не возникало.

и закончим на этом.
всем сорри за оффтоп.



Большое всем спасибо за ваше участие. Наверное вы правы, господа, биохимия не моя стезя. Попробую себя в ядерной физике, может там мое призвание? А блондинкой я была когда то, но работа с эфирами изменила мою внешность.



p = 1.103 у SSC - уж не ошибка(опечатка) ли? Может всё же p = 1.163?



где не могу понять у Вас натрий фосфатный буфер?



4 M guanidine thiocyanate, 0.2 M sodium acetate pH 5.0, 25 mM EDTA, 2.5% (w/v) PVP-40 potassiym acetate 1M помогите пожалуйста приготовить



в смысле сколько добавлять ацетата Na ph 5,0



--в смысле сколько добавлять ацетата Na ph 5,0
200mM на 1л готового раствора.



В американской методике упоминается буфер Trizma base (Sigma) кто нибуть знает с чего он состоит, можно ли приготовить самомому, или хотябы чем заменить можно?



Trizma base = Tris base (основной Трис, трис-гидроксиметиламинометан). Только это не буфер, а соль, на основе которой делают буферы.



Тогда это вообще бред какойто:

"The bacterial pellet was suspended in
100 mkl of TAE buffer (40 mM Tris acetate [pH 8.5]-2 mM
EDTA) and mixed with 200 mkl of alkaline solution containing
3 g of SDS, 0.6 g of Trizma base (Sigma Chemical Co., St.
Louis, Mo.), and 6.4 ml of 2 N NaOH in 100 ml of H20."

Сначала забуферивают систему рН 8.5, а потом сразу же поднимают его вверх, при чем опять с испольхованием триса (только с другим названием, видимо чтобы избежать тавтологии ).... Нет чтоб написать сразу - приливаем 300 мкл трис-буфера такогото рН, с ДДС и ЕДТА концентраций соответсвующих.

Еще один перл, оттудаже

"The supernatant of the mixture after centrifugation at 16,000 x g for 10 min was
mixed with 200 mkl of H20 and 50 mkl of 3 M sodium acetate
(pH 5.2)."

Спрашивается, а вода зачем? Почему не взять изначально ацетат натрия концентрации в 5 раз ниже? А 3 М раствор ацетата натрия что действительно имеет кислую реакцию, соль то вроде щелочная....



Деионизация формамида (мочевины, акриламида, глиоксаля).

п.5.хранить при -20C в банке тёмного стекла или завернув в фольгу

божемой, божемой... мочевину при -20? или акриламид???



По-моему в прописи ТВЕ закралась ошибка, если добавлять ЭДТА 43 г, то он будет не 20 мМ, а более чем 100 мМ, если исходить из концетраций и масс в прописи, то молекулярная масса ЭДТА получается равной 1241 :). Или я чего-то не понял, или это лажа.



пребываю в тихом шоке... понятно, что в науке чаще всего живут интроверты,
но невозможно же до такой степени упиваться собственной специфичностью!!!!
к нам же начинающие совсем ходить перестанут



Ребята, откликнитесь! Подскажите хороший лизирующий буфер БЕЗ сохранения целостности клеток! RIPA не тянет!!!!!! Если есть что-то скиньте на FIS82@rambler.ru Заранее благодарна



Помогите пож-та... нужен фосфатный буфер с pH 7,5 и ионной силой 0,05!!! как его получить?? Заранее спасибо!




Tough call ;-)

pH 7.5 roughly equals the 2nd pKa of the phosphoric acid (7.2). So at pH 7.5 you will have approx. equal concentrations of HPO4(2-) and H2PO4(-). Let us call this concentration X. You will also have potassium concentration that equals 2X+X=3X total. Thus, your ionic strenght equals 3X+X+X^2. Solving the equation

X^2+4X=0.05

we find that X=~0.125. So to make 1 L of buffer you have to take 0.125 mole of KH2PO4 and 0.125 mole of of K2HPO4 and adjust the pH to 7.5 with acid or alkali.



Скажите пожалуйста, а при приготовлении ТАЕ 50х можно и спользовать ЭДТА 0,5 М рН 8.0 вместо ЭДТА в виде соли? Спасибо заранее!



В ЭФ буферах ЭДТА только в виде свободной кислоты.



Спасибо за ответ. Можно ещё вопросик?
То есть присутствие ионов натрия категорически запрещается? Это каким-то негативным образом сказывается на форезе?
Просто я буфер готовила с добавлением двунатриевой соли ЭДТА и ничего вроде, а тут на форуме в прописях увидела, что ЭДТА надо добавлять не из стока и задумалась правильно ли я его готовлю...




Впервые слышу, коллега. Там натрия настолько мало, что едва ли он на чем-то скажется. Народ обычно берет готовый ЭДТА раствор из сигмовской банки 0.5 М динатриевая соль, и не берет в голову.



Такой общий ответ.
Криминала, конечно, никакого если используется р-р ЭДТА 0,5 М с рН 8.0.,, но лучше исключить (минимизировать) ионы сильных кислот и оснований из ЭФ буфера.
К тому же оказалось очень удобно смешивать сухие компоненты буферов (особенно в случае ТБЕ) и при этом я заменил динатриевую соль на свободную кислоту и тем самым снизил рН и ионную силу (проводимость) буфера.



Спасибо за ответ!



Доброго дня участникам и корифеям! У меня вопрос как раз в тему - нужен органический буфер с низкой проводимостью. Сейчас проверяю натрия салицитат, но хотелось бы избавиться от ионов натрия... чем бы Вы предложили "запаровать" салициловую кислоту, чтобы сделать буфер рН 8.5-9.0, не слишком дорогое и дефицитное? Как вариант, трис? Спасибо!




Если Трис не противопоказан, готовите Трис ОН 2М (!!!), это близкий к насыщенному раствор, также готовите максимально концентрированный раствор салициловой кислоты (для удобства тоже 2 М). Смешивая разные объемы эквимолярных растворов готовите 1М раствор Трис-салициловой кислоты нужного рН.
Я так готовлю 1М Трис-глициновый, то бишь Трицин, буфер с рН 8,5.



Ах, буфера...




Манияк...



Подскажите, пожалуйста, как правильно приготовить 0,1 М натрий-фосфатный буфер (рН=8,0, V=500 мл). Столько прописей нашлось, что в голове полная каша! Буфер необходим для биотинилирования белка. И еще вопрос, натрий-фосфатный буфер и PBS одно и тоже?




1. А давайте ваши прописи, лучше одну, обсудим...
2. PBS - это физраствор в фосфатном буфере.
Протокол приготовления:
Р-рить 8 г NaCI, 0,2 г КС1, 1,44 г Na2PO4 и
0,24 г KH2PO4 в 800-900 мл воды, довести
рН до 7,4 НС1. Довести до 1л водой.
Надо ли пересчитывать для 0,5 л?



Подскажите, пожалуйста, где можно найти в интернете методики по приготовлению буферов, в частности уксусно-аланинового, глицин-NaOH, фосфат-фосфатного.

Заранее благодарен.



Или может есть пособие какое-нибудь по буферам



--Или может есть пособие какое-нибудь по буферам
Справочник биохимика доусона почитайте главу про буферные растворы там вначале теория дается, а потом практика. Для начала вам хватит. А так возьмите хороший учебник по аналитической химии там много про буферные системы написано.



Извините за такой дилетантский вопрос:

Можно ли заменить фосфатный буфер Соренсена(0,1 М) с рН 7,2 обычным PBS c таким же рН.Нужен для С-бэндинга хромосом.



Если вы напишите состав обоих буферов рядом в столбик, то сами получите ответ.

По идее можно



Коллеги, ЕЩЕ раз подниму вопрос!
В прописи ТБЕ буфера действительно ошибка, не может там быть 43,84 г!

И, написано, ЭДТА рН 8, а коллега-Ъ- говорит, что натрий ни к чему.

Кто прав? А то я как идиот делал из ЭДТА фри асид соль, добавляя NaOH.



1) Вероятно авторы имели ввиду вес не сухого Трилона Б, а необходимый вес 0.5М раствора ЭДТА рН-8.0.

2)можете делать из кислоты, но тогда триса больше сыпать придется или боркиса меньше. Но на самом деле 2-5мМ натрия это такие малозначительные крохи, что можно и не забивать себе голову. А 0.5М ЭДТА рН-8 вещь вообще полезная в хозяйстве.



Люди,подскажите пожалуйста,где купить трис!В инете не нашла мелкие фасовки,только по 500гр и цена в евро.
Как определить 10ммоль трис-буфера,как высчитывать?Благодарю заранее.Биохимик начинающий,поэтому туговато
inessaviv@gmail.com



1) Хеликон
2) молярность по Трису, в чем проблема? Биохимик -то начинающий, а студент-то конченый? Вас не учили? Аналитики не было? Тогда зачем Вам трис, разводите марганцовку в воде, красиво и познавательно



--Люди,подскажите пожалуйста,где купить трис!
http://www.vekton.ru/e_sale/?gd=685 ( http://www.vekton.ru/e_sale/?gd=685 )
Только ч. покупать не рекомендую(хотя для экстрагирующих буферов и он подойдет)
Покупайте осч или имп. последний уточните откуда и какой марки.

--Как определить 10ммоль трис-буфера,как высчитывать?
Пересчитывать надо на молярность триса-основания(мол вес 121)



подскажите пожалуйста! надо приготовиться ПБС рН=7,2, но при этом к нему необходимо добавить 2,25% глицина. возможно ли это сделать и как (на каком этапе). при добавлении глицина рН очень резко падает до 5,9 и повысить ее никак не почается (5Н НаОХ)




НСI исключите из протокола.
А что за ругательская абр-тура, (5Н НаОХ)?



а какой финальный рН должен быть. может, 5.2 как раз что надо?





подозреваю, что это пяти- нормальная щелочь))



Нужно приготовить боратный раствор 200мМ борат натрия, 60мМ НаЦл, 1 мМ ЭДТА
как для этого растворить буру?



Так 200мм борат или тетра борат. В оде растворять, в воде



Тетраборат (бура) в воде плавает в виде взвеси и не растворяется. Попробывал в кипятке растворить при охлаждении выпали кристаллы



это не страшно, дайте отстояться и пользуйтесь. Все равно потом все на стенках выпадет, на скорость не влияет



http://replicarolexwatches.simpsite.nl/ ( http://replicarolexwatches.simpsite.nl/ )
https://www.smore.com/rj7kh-best-replica-watches ( https://www.smore.com/rj7kh-best-replica-watches )
https://www.athleticsnation.com/users/Replicarolexwatches ( https://www.athleticsnation.com/users/Replicarolexwatches )
https://pastebin.pl/view/ab0e458a ( https://pastebin.pl/view/ab0e458a )
https://mix.com/watcheshutukcom ( https://mix.com/watcheshutukcom )
https://www.woddal.com/post/359216_tiny-acc...nybody-039.html ( https://www.woddal.com/post/359216_tiny-accessories-such-as-jewelry-and-watch-go-quite-a-way-to-specify-anybody-039.html )
https://share.naturalnews.com/posts/3904099 ( https://share.naturalnews.com/posts/3904099 )
https://demo.wowonder.com/post/214429_the-i...-producers.html ( https://demo.wowonder.com/post/214429_the-imitation-watch-commerce-isn-039-t-a-doubt-one-large-reason-watch-producers.html )
https://rapichat.com/post/5369_our-purpose-...ible-there.html ( https://rapichat.com/post/5369_our-purpose-is-to-make-searching-for-replica-watches-as-simple-as-possible-there.html )
https://dashburst.com/replicarolexwatches/1 ( https://dashburst.com/replicarolexwatches/1 )
https://sway.office.com/KifcQvn36MK821G8 ( https://sway.office.com/KifcQvn36MK821G8 )
https://flipboard.com/@replicarolex24 ( https://flipboard.com/@replicarolex24 )
https://getpocket.com/redirect?url=https%3A...eshut.uk.com%2F ( https://getpocket.com/redirect?url=https%3A%2F%2Fwww.watcheshut.uk.com%2F )
https://www.openstreetmap.org/user/Hints%20...20Rolex%20Watch ( https://www.openstreetmap.org/user/Hints%20on%20Choice%20of%20a%20High%20Quality%20Employed%20Ladies%20Replica%20Rolex%20Watch )

Powered by Invision Power Board (http://www.invisionboard.com)
© Invision Power Services (http://www.invisionpower.com)