Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
KisA Постоянный участник SPb+Helsinki |
Мне было необходимо разогнать в ПААГ катионные пептиды с массой от 5 до 16 кДа. По аналогии взял методику разгонки гистонов Spiker, 1980 (ранее я сам белков вообще не гонял): Основной рабочий гель — 15%-го ПААГ в 0,9 М СН3СООН с 2,5 М мочевины. Над ним полимеризована полоска формирующего геля: 7,5% ПААГ в 0,375 М СН3СООNa с 2,5 М мочевины. Электрофорез при повышенном напряжении — за 1 — 2 ч. ЭФ буфером служил 5%-ный (0,9 М) раствор уксусной кислоты с добавлением 2,5 М мочевины. Форез гнал 1 ч при 160 В (длина геля 16 см). А результаты совсем не очень - пробы прошли только 1 см (даже в разделяющий гель не вошли). Я прошу не бить сапогами за глупый вопрос - в чем я был не прав? Какое напряжение в данном случае можно считать "повышенным" - я вообще боялся, что пробы уйдут? Может другую методику для катионных пептидов посоветуете? Заранее спасибо. |
guest: ммм IP-штамп: frHvyGooYAnV2 гость |
|
Utcn Постоянный участник |
|
guest: ммм IP-штамп: frHvyGooYAnV2 гость |
- верхний гель 63мМ калий ацетатного, прости Господи, буфера с рН=6.8 -разделяющий гель 0.375М калий ацетатного буфера с рН=4.3 -это практически чистый уксус. -ЭБ 0.35 моль глицин или аланин, 140мМ уксус, рН приблизительно 4.5(подводить не надо) Буферы все готовить на Ледяной уксусной подтитровкой КОН, кроме ЭБ(это просто смесь указанных количеств) Мочевину в ЭБ можно и не добавлять если она не полное Г, то из геля никуда не денется, а она хоть и дешевая, а на зря ее переводить не надо. Метода взята из старого мануала Фармации(она же Хойфер, она же Амершам, она же общая электрическая ) |
A Chemist Постоянный участник Минск |
Подозрительно высокая конц-ия ацетата Na в "формирующем" геле. Не "подозрительно", а катастрофически. Скорее всего, Вы проводили форез ацетат-ионов. А если хотите форезить белки, снижайте концентрации буферов в 20-50 раз. |
KisA Постоянный участник SPb+Helsinki |
|
Polika Kuopio |
[/quote] Т е состав разделяющего геля оставить без изменений, а 6М мочевину с 0,1М уксусной использовать как буфер для нанесения, это имеется в виду? |
Utcn Постоянный участник |
|
Polika Kuopio |
|
nigoal123 IP-штамп: fr4iy3.kHUw02 гость |
must be after reading fifty exam papers. |
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |