molbiol.ru -> 20S, 26S Proteasome, Ubiquitin

> Все форумы > Тематические форумы > Молекулярная и клеточная биология

Zbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ

Правила FAQ* Поиск* Участники* Календарь* Избранные темы* Форум Форумов*

Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ]

Форум:

* 20S, 26S Proteasome, Ubiquitin

Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.

Solo

13.03.2002 12:48

URL #1

Всем привет!
Ищу коллег по объекту исследования -протеасома.
Есть у кого(в России):
антитела к 26S Proteasome (а именно 19S части)?
антитела к убиквитину?
налаженная система убиквитинилирования белков in vitro?
опыт мутаций по PEST регионам?
Буду очень признателен за любую информацию.

Murat
Постоянный участник
RU

13.03.2002 18:15

URL #2

Приветствую, коллега! =) Я достаточно давно связан с этой, вернее, сопряженной тематикой: убиквитин, эндогенные белки-мишени, регуляция процессов убиквитилирования. Правда, не совсем в России, но надеюсь вскорости (в пределах неск. недель) продолжить и там. АнтиУби у меня есть, в т.ч. коммерческие от Сигмы и Дако, анти26S есть тут в Лаборе у коллег, могу спросить к которой части конкретно. Убиквитилирование ин витро тут налажено вовсю, дома - вряд ли, т.к. нет возможности (да и желания с необходимостью) работать с радиоактивно-мечеными субстратами.
Несколько встречных вопросов: Вы откуда сами будете? (В том смысле, что думаю было бы интересно связаться и контактировать) В каком разрезе Вас интересует протеосома и все связанное с Уби? Дабы не замусоривать Форум личными сообщениями, милости прошу в мыло, заранее извиняясь за возможные задержки с ответами - цейтнот, увы =(. Удачи!

Murat
Постоянный участник
RU

13.03.2002 18:53

URL #3

В догонку: Вы иммунопреципитацию с антиУби когда-нибудь проводили? Если да, был бы крайне благодарен за некоторую техническую информацию.

Lex
Постоянный участник

13.03.2002 23:07

URL #4

Hi,
a vot ya kak raz nedavno nachal smotret' 26S i, na samom dele, bol'she interesuyus' Hdm2, Rad6, p14ARF i pr. pathways i ikh degradation via ubiquitin.
In vitro i in vivo Ub- assay ya delal, v tom chisle IP/Western/anti-Ub.
Antitela, razumeetsya, est', da sam ya poka daleko ot RU.
Esli est' voprosy ili predlozheniya - pishite.

Solo

14.03.2002 11:45

URL #5

Я прошу прощения, если мои вопросы покажутся глупыми (с протеасомами судьба столкннула меня недавно- многово не знаю):
(i)как можно точно дифференцировать- 20S или 26S валит белок?
(ii)насколько 20S субстратспецифична, Ub и ATP зависима(в статьях пишут по-разному)?
(iii)стоит ли удалять весь PEST герион или достаточно промутировать несколько позоций (если предполагается PEST индуцированная деградация)?
спасибо
[ 14-03-2002: Сообщение отредактировано: Solo ]

Murat
Постоянный участник
RU

14.03.2002 14:07

URL #6

2Lex
Приветствую! Тут меня коллеги с шефом стращают, что они делали когда-то ИП с антиУби, но ничего путного не получилось (в смысле, все выпадало крайне неспецифически). А я как раз сегодня начинаю первый пробный опыт, поэтому есть целый ряд вопросов, в частности: 1) какое разведение и каких антител (производитель, аффинно-очищенные или нет) Вы использовали; 2) как идет преципитпция в присутствии/отсутствии сефарозы А; 3) можно ли использовать для предупреждения неспецифического связывания 1% тритон X-100 и/или 150 мМ NaCl 4) есть ли какие-нибудь "подводные камни" в этой методе? Буду исключительно признателен за любой совет/информацию!
2Solo
я постараюсь глянуть сегодня в литературу и поговорить с теми, кто тут у нас плотнее занимался 20S и 26S. Про ПЕСТ-регион, увы, сразу могу сказать - у меня самого и у коллег знания сугубо теоретические =(, поэтому вряд ли смогу присоветовать что-либо практически ценное. Удачи!

Lex
Постоянный участник

14.03.2002 21:54

URL #7

For Murat
v chastnosti, ya smotrel ubiquitinilation of p53, sootvetstvenno
ispol'zoval Ab1 p53 monoclonal, from Oncogene (1:200 for Western, 1:100 for IP+15 mkl of protein-A-agarose slury),
antiubiquitine (Upstate Biotech., dilution 1:500 for Western, 1:200 for IP), a eschyo luchshe from DAKO (1:1200, Western), no oni overpriced (tipa 1000$).
Naschet nespezifiki - esli ispol'zuete IP s monoclonal dlya vashego substrate-protein, to, razumeetsya, Western delaete s drugoi species (rabbit), khotya vse ravno naidete band ot tyazheloi tsepochki vashikh antitel, chto ispol'zovali dlya IP, poetomu sdelaite libo gradient gele (ya delel 5-16% na minigel BIORAD), libo - rastyanite % v oblasti vashego substrate-protein.
2) bez sepharozy A (kstati, ya ispol'zoval agarozu A-protein-coupled, imenno iz za men'shei binding capacity i, sledovatel'no, nespizifiki) ya ne delal, da i interesno, a kak vy vyudite vashi IP-complexes?
3) nespizifika v osnovnom idet ot vashikh antitel. Ya bral purified ones, IP delal v PBS s 1% тритон X-100 (NaCl tam uzhe est') overnight, at +4C. Glavnoe - pellets promoite raz 5, khuzhe ne budet.
Luchshe vsego sdelat' 2 tipa experimenta:
1) IP ubiquitin, Western - your Ab k protein-substrate
2) naoborot, IP with your protein-substrate antibody, Western with ubiquitin Ab
Ya mog razlichit' monoqbiquitinated forms and poly, khotya v drugikh sluchayakh, kogdas belok uzhe degradiruet cherez 26S, poluchaete smear of polyubiquitineted and/or poliubiquitinated/degraded products
Podvodnye kamni... ne znayu, vse upiraetsya v ob'ekt issledovaniya.
Kstati, eschyo pomagaet immunofluorescence (eto esli s antitelami tugo ili oni po kakim-to prichinam ne rabotayut) - delaete colocalizaziyu Ub s vashim protein.
Good luck

Lex
Постоянный участник

14.03.2002 22:34

URL #8

For Solo:
(i)как можно точно дифференцировать- 20S или 26S валит белок?
Tochno nel'zya (poka). Kak pravilo lyudi izmeryayut' peptidaznuyu aktivnost'. Dlya 20S est' spezificheskyi substrat.
Berut peptid (Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC, AMC=7-amino-4-methylcoumarin) i vmeste svashim lizatom (ili substrate protein) i sootvetstvuyuschimi fermentami izmeryaete skorost' vysvobozhdeniya AMC, delaete eto v 96-well microtiter plate,v SDS, nabiraete statistiku (smotrite Stein R. et al, Biochemistry, 35, p3899 ili Hoffman L. JBC
1992, 267 p 22362). Zatem izmeryaete obschuyu aktivnost' (20S i 26S) (kazhetsya, Boston Biochem predlagaet kity)i vychetaete iz nee 20S activity.
Spezifiucheskikh substratov dlya 26S (versus 20S) poka ne naideno. Antitel tozhe net (I mean - specific ones)

(ii)насколько 20S субстратспецифична, Ub и ATP зависима(в статьях пишут по-разному)?
20S is not-ATP-dependent
(Ciechanover A., 1994, Cell 79:13)
20S is poly-ubiquitin-dependent (tak kak s mono - belki zhivut khorosho, no stoit nasveshat' zepochku do 3-4 i 20S
nachinaet svoyu deyatel'nost', khotya - est' eschyo UCH vsyakie i PA28 activator)
v kachestve negativnogo kontrolya luchshe ispol'zovat' vashi obraztsy/kletki, obrabotannye s epoxomicin (eto irreversible proteasome inhibitor), khotya vse lyubyat ispol'zovat' MG-132
(iii)стоит ли удалять весь PEST герион или достаточно промутировать несколько позоций (если предполагается PEST индуцированная деградация)?
ne znayu. to est' znayu, chto nuzhno proverit', tak kak prostoi teoriei zdes' ne oboitis'.
спасибо

Solo

14.03.2002 23:42

URL #9

for Lex:
большое спасибо за подробный ответ.
<<20S is not-ATP-dependent
тогда возвращаюсь к вопросу-(i)как можно точно дифференцировать- 20S или 26S валит белок?
если сперва провести ATP-диплишен, не бедет ли после этого наличие протеазной активности говорить о действии именно 20S?
<<20S is poly-ubiquitin-dependent
??? а Olivier Coux, et al., Annu. Rev. Biochem. 1996.65: 801-47/ пишет, что 20-ка Уби-субстраты не трогает... или вот на этой диаграмме http://www.proteasome.com/publications/Fer...ll/diagram1.htm
еще раз спасибо и если я заблуждаюсь- прошу меня поправить и не смеятся над чайником в этой кухне...
PS: можно высказать предположение- вы случайно не Михаил В. Чернов из группы Старка?
[ 14-03-2002: Сообщение отредактировано: Solo ]

Lex
Постоянный участник

15.03.2002 01:41

URL #10

A vot ya ne mogu skazat' ATP-dependent li 26S. Tak kak nikto v chistom vide ikh vydelit' ne smog, dazhe t
purity from manufecturers gde-to 65%, na chto oni sami i ukazyvayut (ibo nalipayut na nikh vsyakie fermenty i pr.).
Tak vot nachet kak razdelit' 20S i 26S, ya tut dumal-dumal i prishel k vyvodu, chto edinstvennyi i prostoi put' - eto spezifichno blokirovat' ikh spezificheskimi ingibitorami. See Calbiochem catalog, there are specific 26S and 20S inhibitors.
Nu a zatem - libo pomerit' obschuyu aktivnost' (+/- inhibitors), libo s antitelami k substratu kakomu-libo.
Po povoduUB-dependent, kazhetsya v J.Immunol. 152 p 3884, Dick LR 1991 Biochemistry 30, p.2725..
khotya - mogu oshibat'sya. Ya posmotryu i esli chto uznayu - soobschu.
Menya, v prinzipe, bol'she seichas Rad6 (on zhe Ubch2) voplnuet, nu i postol'ku-poskol'ku E1, E3 (including Mdm2 Ub-ligase activity) i 26S.
A naschet predpolozheniya - net, ne Chernov ya, ne Mikhail. Ya iz MCF (otkuda kletki MCF7 poshli).

Murat
Постоянный участник
RU

15.03.2002 15:13

URL #11

2Lex
Спасибо огромное за советы! Вчера отпреципитировал пробы с антиУби, сегодня посмотрю, что получилось

2Solo
Сорри за задержку с ответом на мэйл, постараюсь завтра или в вскр.
Удачи всем!

Mala636
Постоянный участник
Lahore, Punjab, Pakistan

30.09.2022 16:33

URL #12

Ufa1688
Постоянный участник

06.10.2022 16:31

URL #13

The DPRK is watching ufabet เข้า สู่ระบบ the US posing a serious threat ufa1688auto to the stability of the situation ufabet on the Korean peninsula ufa1688 and in its vicinity by redeploying UFA1688 the carrier task force in the ราคาบอล waters off the Korean สล็อตออนไลน์ peninsula,” read a statement from ลิงค์รับทรัพย์ the North Korean Foreign Ministry แฮนดิแคป posted on the state-run Korean บอลสเต็บ Central News Agency.

guest: 123vega
IP-штамп: frXqkB4MpP2jQ
гость

12.11.2022 12:46

URL #14

A long, beautiful stretch SUPERSLOT เครดิตฟรี of sand in Australia's สล็อต โร มา เว็บตรง tropical far north, Wangetti Beach, was Toyah ทดลองเล่นสล็อตโรม่า Cordingley's favourite beach. It is also where she died, in what ROMA SLOT has been called a "frenzied and brutal and sadistic" attack. SLOT JOKER The 24-year-old had gone to the SLOTXO beach to walk her dog on 21 October 2018, as she เครดิต ฟรี กด รับ เอง 50 บาท had done countless times before, but never came home. The PG SLOT ซื้อฟรีสปิน next morning her father found her "messed up" body half buried in sand dunes. Her JOKER ROMA เว็บตรง beloved dog was tied up nearby, unharmed. Four PG SLOT ทางเข้า years on, Australian authorities are appealing for the public's help in an international hunt to find the man they believe killed Toyah - Rajwinder Singh.

Ufa1688
Постоянный участник

14.03.2023 09:55

URL #15

Nunes da Silva’s app aff1688 experience with the police nigoal123 may point to a wider issue 123goal Metropolitan Police data shows ปั่นสล็อต that between 2010 and 2021เกมสล็อต only two police officers out of a total สูตรสล็อต of 573 accused were charged ทาง เข้า ufabet with rape or sexual ufabet vip assault after a public ทาง เข้า ufabet มือ ถือ complaint was brought แฮนดิแคป คือ against them.

Abu Road Escorts
IP-штамп: frQrtJ1xVpdzY
гость

16.03.2023 07:23

URL #16

Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.

Имя:

Отправка сообщений использует JavaScript операции. В вашем броузере не
установлено/отключено выполнение JavaScript программ. Используйте Netscape Navigator
или Internet Explorer (не ранее 3 версии); убедитесь, что выполнение JavaScript
программ разрешено в настройках вашего броузера.