Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
Solo |
Ищу коллег по объекту исследования -протеасома. Есть у кого(в России): антитела к 26S Proteasome (а именно 19S части)? антитела к убиквитину? налаженная система убиквитинилирования белков in vitro? опыт мутаций по PEST регионам? Буду очень признателен за любую информацию. |
Murat Постоянный участник RU |
Несколько встречных вопросов: Вы откуда сами будете? (В том смысле, что думаю было бы интересно связаться и контактировать) В каком разрезе Вас интересует протеосома и все связанное с Уби? Дабы не замусоривать Форум личными сообщениями, милости прошу в мыло, заранее извиняясь за возможные задержки с ответами - цейтнот, увы =(. Удачи! |
Murat Постоянный участник RU |
|
Lex Постоянный участник |
a vot ya kak raz nedavno nachal smotret' 26S i, na samom dele, bol'she interesuyus' Hdm2, Rad6, p14ARF i pr. pathways i ikh degradation via ubiquitin. In vitro i in vivo Ub- assay ya delal, v tom chisle IP/Western/anti-Ub. Antitela, razumeetsya, est', da sam ya poka daleko ot RU. Esli est' voprosy ili predlozheniya - pishite. |
Solo |
(i)как можно точно дифференцировать- 20S или 26S валит белок? (ii)насколько 20S субстратспецифична, Ub и ATP зависима(в статьях пишут по-разному)? (iii)стоит ли удалять весь PEST герион или достаточно промутировать несколько позоций (если предполагается PEST индуцированная деградация)? спасибо [ 14-03-2002: Сообщение отредактировано: Solo ] |
Murat Постоянный участник RU |
Приветствую! Тут меня коллеги с шефом стращают, что они делали когда-то ИП с антиУби, но ничего путного не получилось (в смысле, все выпадало крайне неспецифически). А я как раз сегодня начинаю первый пробный опыт, поэтому есть целый ряд вопросов, в частности: 1) какое разведение и каких антител (производитель, аффинно-очищенные или нет) Вы использовали; 2) как идет преципитпция в присутствии/отсутствии сефарозы А; 3) можно ли использовать для предупреждения неспецифического связывания 1% тритон X-100 и/или 150 мМ NaCl 4) есть ли какие-нибудь "подводные камни" в этой методе? Буду исключительно признателен за любой совет/информацию! 2Solo я постараюсь глянуть сегодня в литературу и поговорить с теми, кто тут у нас плотнее занимался 20S и 26S. Про ПЕСТ-регион, увы, сразу могу сказать - у меня самого и у коллег знания сугубо теоретические =(, поэтому вряд ли смогу присоветовать что-либо практически ценное. Удачи! |
Lex Постоянный участник |
v chastnosti, ya smotrel ubiquitinilation of p53, sootvetstvenno ispol'zoval Ab1 p53 monoclonal, from Oncogene (1:200 for Western, 1:100 for IP+15 mkl of protein-A-agarose slury), antiubiquitine (Upstate Biotech., dilution 1:500 for Western, 1:200 for IP), a eschyo luchshe from DAKO (1:1200, Western), no oni overpriced (tipa 1000$). Naschet nespezifiki - esli ispol'zuete IP s monoclonal dlya vashego substrate-protein, to, razumeetsya, Western delaete s drugoi species (rabbit), khotya vse ravno naidete band ot tyazheloi tsepochki vashikh antitel, chto ispol'zovali dlya IP, poetomu sdelaite libo gradient gele (ya delel 5-16% na minigel BIORAD), libo - rastyanite % v oblasti vashego substrate-protein. 2) bez sepharozy A (kstati, ya ispol'zoval agarozu A-protein-coupled, imenno iz za men'shei binding capacity i, sledovatel'no, nespizifiki) ya ne delal, da i interesno, a kak vy vyudite vashi IP-complexes? 3) nespizifika v osnovnom idet ot vashikh antitel. Ya bral purified ones, IP delal v PBS s 1% тритон X-100 (NaCl tam uzhe est') overnight, at +4C. Glavnoe - pellets promoite raz 5, khuzhe ne budet. Luchshe vsego sdelat' 2 tipa experimenta: 1) IP ubiquitin, Western - your Ab k protein-substrate 2) naoborot, IP with your protein-substrate antibody, Western with ubiquitin Ab Ya mog razlichit' monoqbiquitinated forms and poly, khotya v drugikh sluchayakh, kogdas belok uzhe degradiruet cherez 26S, poluchaete smear of polyubiquitineted and/or poliubiquitinated/degraded products Podvodnye kamni... ne znayu, vse upiraetsya v ob'ekt issledovaniya. Kstati, eschyo pomagaet immunofluorescence (eto esli s antitelami tugo ili oni po kakim-to prichinam ne rabotayut) - delaete colocalizaziyu Ub s vashim protein. Good luck |
Lex Постоянный участник |
(i)как можно точно дифференцировать- 20S или 26S валит белок? Tochno nel'zya (poka). Kak pravilo lyudi izmeryayut' peptidaznuyu aktivnost'. Dlya 20S est' spezificheskyi substrat. Berut peptid (Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC, AMC=7-amino-4-methylcoumarin) i vmeste svashim lizatom (ili substrate protein) i sootvetstvuyuschimi fermentami izmeryaete skorost' vysvobozhdeniya AMC, delaete eto v 96-well microtiter plate,v SDS, nabiraete statistiku (smotrite Stein R. et al, Biochemistry, 35, p3899 ili Hoffman L. JBC 1992, 267 p 22362). Zatem izmeryaete obschuyu aktivnost' (20S i 26S) (kazhetsya, Boston Biochem predlagaet kity)i vychetaete iz nee 20S activity. Spezifiucheskikh substratov dlya 26S (versus 20S) poka ne naideno. Antitel tozhe net (I mean - specific ones) (ii)насколько 20S субстратспецифична, Ub и ATP зависима(в статьях пишут по-разному)? 20S is not-ATP-dependent (Ciechanover A., 1994, Cell 79:13) 20S is poly-ubiquitin-dependent (tak kak s mono - belki zhivut khorosho, no stoit nasveshat' zepochku do 3-4 i 20S nachinaet svoyu deyatel'nost', khotya - est' eschyo UCH vsyakie i PA28 activator) v kachestve negativnogo kontrolya luchshe ispol'zovat' vashi obraztsy/kletki, obrabotannye s epoxomicin (eto irreversible proteasome inhibitor), khotya vse lyubyat ispol'zovat' MG-132 (iii)стоит ли удалять весь PEST герион или достаточно промутировать несколько позоций (если предполагается PEST индуцированная деградация)? ne znayu. to est' znayu, chto nuzhno proverit', tak kak prostoi teoriei zdes' ne oboitis'. спасибо |
Solo |
большое спасибо за подробный ответ. <<20S is not-ATP-dependent тогда возвращаюсь к вопросу-(i)как можно точно дифференцировать- 20S или 26S валит белок? если сперва провести ATP-диплишен, не бедет ли после этого наличие протеазной активности говорить о действии именно 20S? <<20S is poly-ubiquitin-dependent ??? а Olivier Coux, et al., Annu. Rev. Biochem. 1996.65: 801-47/ пишет, что 20-ка Уби-субстраты не трогает... или вот на этой диаграмме http://www.proteasome.com/publications/Fer...ll/diagram1.htm еще раз спасибо и если я заблуждаюсь- прошу меня поправить и не смеятся над чайником в этой кухне... PS: можно высказать предположение- вы случайно не Михаил В. Чернов из группы Старка? [ 14-03-2002: Сообщение отредактировано: Solo ] |
Lex Постоянный участник |
purity from manufecturers gde-to 65%, na chto oni sami i ukazyvayut (ibo nalipayut na nikh vsyakie fermenty i pr.). Tak vot nachet kak razdelit' 20S i 26S, ya tut dumal-dumal i prishel k vyvodu, chto edinstvennyi i prostoi put' - eto spezifichno blokirovat' ikh spezificheskimi ingibitorami. See Calbiochem catalog, there are specific 26S and 20S inhibitors. Nu a zatem - libo pomerit' obschuyu aktivnost' (+/- inhibitors), libo s antitelami k substratu kakomu-libo. Po povoduUB-dependent, kazhetsya v J.Immunol. 152 p 3884, Dick LR 1991 Biochemistry 30, p.2725.. khotya - mogu oshibat'sya. Ya posmotryu i esli chto uznayu - soobschu. Menya, v prinzipe, bol'she seichas Rad6 (on zhe Ubch2) voplnuet, nu i postol'ku-poskol'ku E1, E3 (including Mdm2 Ub-ligase activity) i 26S. A naschet predpolozheniya - net, ne Chernov ya, ne Mikhail. Ya iz MCF (otkuda kletki MCF7 poshli). |
Murat Постоянный участник RU |
Спасибо огромное за советы! Вчера отпреципитировал пробы с антиУби, сегодня посмотрю, что получилось 2Solo Сорри за задержку с ответом на мэйл, постараюсь завтра или в вскр. Удачи всем! |
Ufa1688 Постоянный участник |
|
guest: 123vega IP-штамп: frXqkB4MpP2jQ гость |
|
Ufa1688 Постоянный участник |
|
Abu Road Escorts IP-штамп: frQrtJ1xVpdzY гость |
Website Our Linkes |
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |