molbiol.ru -> про пробы

> Все форумы > Тематические форумы > Молекулярная и клеточная биология

Zbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ

Правила FAQ* Поиск* Участники* Календарь* Избранные темы* Форум Форумов*

Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ]

Форум:

* про пробы

Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.

Olezhek
Постоянный участник
Tsukuba, Japan/КФУ, РФ

21.11.2002 09:40

URL #1

Друзья!
у меня с прошлонедельного Нозерна остались РНК пробы меченные DIG. Но на этой неделе мне уже нужно делать Cаузерн блот. Вопрос вот в чем, в мануале Roche как-то скромно умалчивают о том с какой эффективностью эти пробы можно гибридизировть с геномной ДНК и какие при этому будут отличия в самой процедуре (мечение и детекция), можно л ииспользовать те же Амершамовские мембраны и т.п.
посоветуйте, пожалуйста!

petr
Постоянный участник

21.11.2002 15:45

URL #2

Думаю, что если Вы уверены, что РНК не развалилась, то можно. Вообще РНКовые пробы даже лучше связываются с ДНКовыми, чем ДНКовые. Я,правда, работаю с ДНКовой пробй - ее прекрасно пользую по многй раз. Прям с буфером кипячу, немного она остывает, и заливаю в мешок. Вот РНКу кипятить не (!)надо (ну нагреете так, чтоб денатурировать ее - не помню, кажется около 60оС). Мембрану N+ не (!!!) пользуйте - будет мерзкий фон. Пользуйтесь обычной N. Кстати, коньюгат тоже можно повторно пользовать (раз 5 точно, больше - антитела немного садятся).

Olezhek
Постоянный участник
Tsukuba, Japan/КФУ, РФ

21.11.2002 16:10

URL #3

petr, cпасибо большое, а у меня как раз N+ амершамовская..

)

petr
Постоянный участник

21.11.2002 18:30

URL #4

Если Вы во времени не так ограничены, то ну ее! Я ставлю обычный (пассивный) перенос на ночь, все нормально работает. А для мембран, думаю что машинка, что не машинка (пусть меня кто поправит, если не так)

Alice
Участник

21.11.2002 22:59

URL #5

А как насчет радиоактивной ДНК пробы для новерна? Насколько она reusable? Наверняка должно работать.

Veshka
Постоянный участник
Москва

21.11.2002 23:13

URL #6

Не надо грязи про N+

Это смотря какой фирмы. и сколько ей лет

. Если Миллипор или Zeta-Probe, то всё супер. Амершам и првда бякистая...

Olezhek
Постоянный участник
Tsukuba, Japan/КФУ, РФ

22.11.2002 06:33

URL #7

да лет-то немного, но вот Амершамность ее не изменить уже

а вот можно использовать ДНКу размером так 30-50кb?
у меня этот, "ген интереса" максимум килобаз так 5...

petr
Постоянный участник

22.11.2002 11:11

URL #8

Я имел в виду Амершам ессно.
to Olizhek: (??) так 5 или 30-50kb? Если 5 - то точно перенесете пассивно, если 30-50 - надо дольше переносить (я с такими не работал - не знаю)
To Alice: Если фосфор (или чем Вы там метите) не развалился, то очень даже должно работать. Хотя для Нозерна Вам нужна высокая активность зонда. после каждой гибридизации Вы его теряете немного. В случае если у Вас уровень экспрессии невысокий, то можете и не вытянуть полосу (это Вам не ПЦР продукты гибридизовать).

Alice
Участник

22.11.2002 17:38

URL #9

Да, фосфором. Естественно, я имела в виду, пока метка еще горячая. Я так поняла, Вы пробу кипятите прямо в гибридизационном буфере когда повторно используете и ей ничего не делается? Не пробовала новерн с DIG-пробами. Это лучше, чем радиоактивные?

petr
Постоянный участник

22.11.2002 17:53

URL #10

Да, кипячу прямо в гибридизационном буфере (Rosche^вском), и ему ничего не делается. И зонду тоже. И пользую зонд по несколько раз (около 10 точно, но я ПЦР-пр гибридизую, а для нозерна конечно хорошо бы свеженький зонд иметь). Насколько Dig лучше радиоактивных - я специально не сравнивал. Я хочу это как раз в ближайшее время проверить. Rosche пишет, что на порядок чувствительнее (но у меня вот подозрения закрались).

Alice
Участник

22.11.2002 18:01

URL #11

Меня честно говоря достала эта работа с меткой, все эти shields и треск Гайгера. поэтому если dig еще и чувствительней... не надо регулярно горячую пробу готовить. причем ДНКовая у Вас - т.е. не валится как РНК

Olezhek
Постоянный участник
Tsukuba, Japan/КФУ, РФ

24.11.2002 08:04

URL #12

to petr. это у меня gene of interest около 5 kb всего дожен быть в геномном варианте,
в таком случае размер геномной ДНК для электрофореза какой минимальный должен быть? ну вот не получается у меня вытащить ее балшую..все больше 50 kb не извлекается

Olezhek
Постоянный участник
Tsukuba, Japan/КФУ, РФ

24.11.2002 08:06

URL #13

я имею ввиду еще "НЕнарезанный" ресктриктазами вариант

watchesonline89
Постоянный участник

09.12.2022 09:10

URL #14

https://omegawatches89.mystrikingly.com/
https://www.deviantart.com/omegawatches89/j...pular-930508248
https://eatsleepride.com/c/383270
https://fortunetelleroracle.com/fashion/ama...s-online-737627
https://www.intensedebate.com/people/omegawatches89
https://fortunetelleroracle.com/fashion-acc...-popular-737613
https://anotepad.com/notes/ykiydhnj
https://medium.com/@omegawatches89/amazing-...ne-b4863ed55af0
https://omegawatches90.mystrikingly.com/
https://62e8ce2ae5d50.site123.me/blog/repli...ve-items-online
https://62e8da780bf7c.site123.me/
https://padlet.com/omegawatches89/9ibenzfwbcer7k71
https://omegawatches89.simplesite.com/452939012
https://62e8da780bf7c.site123.me/blog/excit...-replica-online
https://62e8ce2ae5d50.site123.me/blog/advan...replica-watches

Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.

Имя:

Отправка сообщений использует JavaScript операции. В вашем броузере не
установлено/отключено выполнение JavaScript программ. Используйте Netscape Navigator
или Internet Explorer (не ранее 3 версии); убедитесь, что выполнение JavaScript
программ разрешено в настройках вашего броузера.