Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
Rob Участник |
Вопрос по ELISA. Был взят Стандард коммерческий и титровался для сравнения с белком, который я бы хотел в дальнейшем использовать, как Стандрад. Коммерческий Стандард показал хорошие значения OD, в то время как белок-образце, концентрацию, которого я привел к стандарду, не показал титрования. В чем могут быть ошибки? Спасибо ng/mL Стандард Образец 1000 2.710033333 2.335733333 500 2.644633333 2.312733333 250 2.173333333 2.349583333 125 1.445733333 2.458033333 62.5 0.775333333 2.614033333 31.3 0.397833333 2.243033333 15.6 0.187133333 1.612733333 0 -0.000266667 |
MMM Постоянный участник |
|
Rob Участник |
Может образец надо начинать титровать с меньшей концентрации, скажем, с 500ng/mL? Т.к. его область насыщения ниже и потому надо делать более сильное разведение? |
MMM Постоянный участник |
Разводить лучше взяв 5(10 )мкл и развести до 50(100),а потом из полученного раствора взять 5 (10)мкл и развести до 2500(5000), хотя в вашем случае это не могло дать ошибку на порядок, как следует из ИФА. Антиген в стандарте и в образце идентичного происхождения? |
Rob Участник |
Стандарт - Иммуноглобулин Коммерческий белок - Fc секретируемый белок. |
MMM Постоянный участник |
Мол. вес какой у этого белка? В каком виде поставляется белок? Вы как нибудь проверяли его концентрацию или только руководствовались сопроводительными документами? И чем у вас лунки сенсибилизированы, а то я не очень понимаю схему вашего ИФА. Сообщение было отредактировано MMM - 09.08.2017 09:19 |
vb Постоянный участник |
2. Если бы у вас и там и там был один и тот же белок, то я бы посоветовал просто сделать предварительно разведение образца в 16-20 раз. 3. Если бы у вас была какая-то экзотика, то еще можно было бы пофантазировать. Но IgG вполне доступен, не вижу причин искать себе проблем на ровном месте. |
Rob Участник |
Был куплен кит К нему прилагается Стандарт, который надо было протестировать с нашим имеющимся белком, чтобы в дальнейшем белок использовать для ИФА сделаного в лабе. Коммерческий белок имеет размер 73кДа...И имеются образцы аналогичного белка, но произведенного в лабе, концентрации которых нам и на узнавать в конечной цели. Т.к. наши белки и коммерческий имеют Fc, то мы решили, что Стандарт из кит, который идет для определения IgG, может нам подходить. Хотя, в описании кита говориться, что подходит для плазмы и сыворотки. А протокол самый стандартный. ПОкрытие плитки на ночь human IgG. Потом блокировка BSA. Далее, добавление стандарта и образцов...потом HRP, субстрат и остановка реакции. |
Rob Участник |
|
Rob Участник |
(vb @ 09.08.2017 11:53) 1. Использовать в ифа стандарт отличный по природе от аналита - очень плохая идея. Даже, если аналит есть фрагмент стандарта. Что собственно и показали ваши результаты. 2. Если бы у вас и там и там был один и тот же белок, то я бы посоветовал просто сделать предварительно разведение образца в 16-20 раз. 3. Если бы у вас была какая-то экзотика, то еще можно было бы пофантазировать. Но IgG вполне доступен, не вижу причин искать себе проблем на ровном месте. Можете объяснить почему не корректно использовать такие сравнения. В обоих случаях идет речь о молекуле Fc. Забыть про Стандарт из кита и использовать коммерческий белок, как Стандарт и от него отпределять концентрации неизвестных образцов? |
MMM Постоянный участник |
(Rob @ 09.08.2017 14:48) Был куплен кит Коммерческий белок имеет размер 73кДа.. Это два ключевых момента. 1)Кто вам сказал, что кит работает на Fc. Это как-нибудь проверялось или это информация полученная от техподдержки набора? Производитель нигде не пишет о локализации эпитопов распознаваемых используемыми в наборе моноклональными антителами. Он пишет что они узнают IgG человека и все. Представьте себе, что планшет сенсибилизирован антителами, которые распознают эпитоп на Fab фрагменте антител, а коньюгат с ПХ распознает эпитоп на Fc фрагменте, тогда если ваш образцовый белок не содержит эпитопа из Fab фрагмента он вообще не свяжется с антителами, которыми сенсебилизирован планшет, и коньюгату просто не с чем будет связываться. 2)Коммерческий белок имеет размер 73кДа Вот вот не размер он имеет, а массу молекулярную - в данном случае это имеет ключевое значение и уже объясняет ошибку в оценке концентрации в 2 раза. Вы никогда не задумывались над тем, что килограмм гексана содержит почти в пять раз меньшее число молекул, чем килограмм воды, потому что масса одной молекулы гексана почти в 5 раз больше массы молекулы воды. Это означает, что если вы возьмете свой образцовый белок 73кДа и IgG 150кДа в одинаковой массовой концентрации, то молекул образцового вещества в единице объема будет в два раза больше чем молекул IgG. А ИФА измеряет в итоге количество молекул фермента, а не его массу. --Концентрация белка подтверждалась на спектрофотометре. Ага! На вскидку можно перечислить 5(пять) СФ методов для определения концентрации белка, каким пользовались вы? Спектрфотометр был типа нанодропа? ---Поставляется в сухом виде. Очень хорошо! В этом самом сухом виде больше ничего нет? Может есть еще вспомогательные вещества: буфер(высушенный) или тригалоза, или сахароза, полимеры? |
Rob Участник |
Что еще может быть в сухом веществе белка не известно. Если этот белок начинает титроваться с меньшей концентрации, значит мне надо его разводить начинать, к примеру с 500ng/mL? И могу ли я его использовать тогда в качестве Стандарта для образцов, которые мы трансфекцируем? Точнее для тестирования клеточной среды с нашими образцами, которые сконструированы на основе этого коммерческого белка. |
Rob Участник |
|
vb Постоянный участник |
(Rob @ 09.08.2017 11:53) Можете объяснить почему не корректно использовать такие сравнения. В обоих случаях идет речь о молекуле Fc. Забыть про Стандарт из кита и использовать коммерческий белок, как Стандарт и от него отпределять концентрации неизвестных образцов? 1. Как объяснил ниже ммм у стандарта и аналита разные мол массы. То есть 1 молекула стандарта и 1 молекула аналита дадут одинаковый сигнал в ифа, а по массе-то они разные. Дальше сами. 2. Кроме очевидной разницы в массе у них будут разная скорость диффузии, разная аффинность, соотвнтственно разная кинетика свчзыания. Ифа по конечной точке можно оптимизировать, наверное, до каких-то допустимых погрешностей. Но лучше всего проверить методом параллельных линий. Если критерий параллельности при титровании не выполняется, то результаты невалидны. Иногда даже матрица (прочие компоненты образца) влияют на результат существенно. Тогда приходится стандарт делать близкий по составу к образцу. |
MMM Постоянный участник |
Это не в описании кита, а в описании IgG, которое приводится в водной части описания кита. Типа: Уважаемый клиент вы купили пылесос. Пыль - это ужасная вещь, которая скапливается в жилище людей и служит для размножения клещей, патогенных грибов и микрофлоры, может вызывать аллергическую реакцию и тд и тп(ЭТО О ПЫЛЕ, а вовсе не о принципе действия пылесоса.) --На нанодропе. Нанодроп это спектрофотометр. Им можно измерять концентрацию белка разными способами: Например 1)биуретовой реакцией, 2)Методом Лоури, 8)Методом Брэдфорд, 4)Методом с бицинхоиновой кислотой, 5)методом измерения абсорбции на 280нм. Какой метод использовали вы? Аминокислотная последовательность белка-образца известна? Сообщение было отредактировано MMM - 09.08.2017 16:33 |
MMM Постоянный участник |
Да вовсе не о ней(об одной молекуле Fc ) идет речь. То что Fc фрагмент является частью разных молекул еще не означает, что эти разные молекулы будут себя одинаково вести в отношении используемой вами тест-системы. Вот для примера взять те же IgG. Fc-фрагмент у них одинаковый, а вот антигены они связывать могут совершенно разные. У вас ваши Fc в образце, могут не связываться с нижними антителами, но зато могут например неспецифически связываться с белком (защиты например с BSA). Производитель же разрабатывал тест систему для анализа IgG человека в сыворотке крови и не рассчитывал на то, что вы евонным "мелкоскопом будете гвозди забивать". Сообщение было отредактировано MMM - 09.08.2017 16:48 |
Rob Участник |
(vb @ 09.08.2017 17:31) Но лучше всего проверить методом параллельных линий. Если критерий параллельности при титровании не выполняется, то результаты невалидны. Иногда даже матрица (прочие компоненты образца) влияют на результат существенно. Тогда приходится стандарт делать близкий по составу к образцу. В чем суть метода параллельных линий? |
Rob Участник |
(MMM @ 09.08.2017 17:32) --На нанодропе. Нанодроп это спектрофотометр. Им можно измерять концентрацию белка разными способами: Например 1)биуретовой реакцией, 2)Методом Лоури, 8)Методом Брэдфорд, 4)Методом с бицинхоиновой кислотой, 5)методом измерения абсорбции на 280нм. Какой метод использовали вы? Аминокислотная последовательность белка-образца известна? Измеряли методом измерения абсорбции на 280нм, с учетом Масс коефф. |
Rob Участник |
Если масса Стандарта 150кДа, а белка 73кДа, то коеффициент разведения должен был бы быть 2...Но мои данные показывают гараздо больший разрыв. |
vb Постоянный участник |
(Rob @ 09.08.2017 18:13) Я в его математике не очень разбирался. Но по сути это разновидность дисперсионного анализа. Реализован во многих программах для анализа ифа. В принципе, описан в европейской фармакопее. |
vb Постоянный участник |
(Rob @ 09.08.2017 18:19) Если Стандарт и Образец были бы приведены к единой концентрации в молях, то сравнивать возможно их? Если масса Стандарта 150кДа, а белка 73кДа, то коеффициент разведения должен был бы быть 2...Но мои данные показывают гараздо больший разрыв. Ну я же вам объяснял, что дело не только в молекулярной массе. Вы вообще читаете, что вам пишут? |
MMM Постоянный участник |
Измеряли методом измерения абсорбции на 280нм, с учетом Масс коефф Масс. коефф. с какого потолка брали? Сообщение было отредактировано MMM - 09.08.2017 21:36 |
Rob Участник |
(MMM @ 09.08.2017 22:34) Посмотрел на |
MMM Постоянный участник |
(Rob @ 09.08.2017 21:19) Вы работаете с закрытой системой вы не знаете как работают антитела в коммерческом наборе. Производитель не может гарантировать вам, что если у него в инструкции написано заправлять автомобиль бензином октановым числом 95, а вы заправили его керосином, что автомобиль будет работать корректно. Но это не мешает вам изгаляться над купленным за ваши деньги автомобилем как угодно. Поэтому вы можете сравнивать размеры носорога и бегемота, но может оказаться, что к размерам слона это не имеет никакого отношения. Представьте что у вас, например есть фотографии девушки вы показываете их компьютерной программе и учите прграмму узнавать эту девушку. В результате вам удается научиь программу эту девушку узнавать. Потом вы берете и делаете гибрид из двух фотографий юноши и девушки или даже например кошки и девушки и хотите что бы компьютерная программа узнала в этой химере девушку. Вы ставите себя в похожую ситуацию. |
MMM Постоянный участник |
(Rob @ 09.08.2017 23:27) Где здесь конкретно? Какой базой данных или инструментом из указанного списка вы воспользовались, что бы узнать связь значения поглощения на 280нм с концентрацией белка? |
Rob Участник |
|
MMM Постоянный участник |
Сколько в вашем белке аминокислот 650-670? и сколько у него фенилаланинов, гистидинов, тирозинов и триптофанов? Да, и кстати вы белок перед измерением разводили или так, типа "5мг/мл" и капали на нанодроп? |
Rob Участник |
Состав посмотрю в лабе. |
Rob Участник |
Как быть? Можно использовать этот белок, как Стандарт для аналогов, произведенных в лабе? |
MMM Постоянный участник |
(Rob @ 11.08.2017 02:14) Ага! "Не правильно ты дядя Федор, бутерброд ешь"<c> Разводить надо концентрированные растворы. В сильно концентрированных растворах концентрация занижается причем, чем концентрированнее раствор, тем больше это занижение. В общем , я думаю гипотеза, "неправильно померил концентрацию" себя оправдала. Ошибка не учета мол.масс белков плюс занижение истинной концентрации при замере на CФ и вот вам результат. |
Rob Участник |
|
Rob Участник |
(MMM @ 11.08.2017 10:13) Ага! "Не правильно ты дядя Федор, бутерброд ешь"<c> Разводить надо концентрированные растворы. В сильно концентрированных растворах концентрация занижается причем, чем концентрированнее раствор, тем больше это занижение. В общем , я думаю гипотеза, "неправильно померил концентрацию" себя оправдала. Ошибка не учета мол.масс белков плюс занижение истинной концентрации при замере на CФ и вот вам результат. И вопрос все еще остается...Можно ли Стандарт из кита использовать для замера концентрации белков, производимых в лабе? Или лучше использовать коммерческий белок с известной концентрацией, аналог которого мы и пытаемся произвести? |
MMM Постоянный участник |
|
Rob Участник |
Корректно ли делать Элайзу в лабе, и за стандарт брать этот белок? Мне подали идею использовать, как стандарт BSA....не знаю уже Кит был нужен всего лишь для сравнения его Стандарта с коммерческим белоком, который мы собираемся использовать в качестве Стандарта для Элайзы сделанной в лабе. |
MMM Постоянный участник |
Нет, ваша оплошность не в этом. Что с того, что он Fc? -- Корректно ли делать Элайзу в лабе, и за стандарт брать этот белок? Нет, некорректно. За стандарт в ИФА всегда берется тот аналит, на который получена данная система ИФА. То есть стандартом для ИФА набора на ваш белок должен быть ваш чистый белок. |
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |