Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
metrim Постоянный участник Москва |
Поставили ПЦР из одной матрицы (бактерия) по 3 повторности на 2 разных региона. Один фрагмент должен был получаться 1200, другой - 1500. Реакцию проводил на еврогеновском мастермиксе. Праймеры по 20 буковок примерно. В случае с фрагме00нтом на 1200 накосячили и внесли по ошибке два раза один из праймеров После ПЦР поставили форез на 1% агарозе с ТАЕ с еврогеновским же ладером. Результат на прилагающейся картинке. Вроде как реакция прошла хорошо, смущают только дополнительные полосы и "облака", на глаз их было виднее. Правильно ли я понимаю, что в районе 350 у меня какой то артефакт, получившийся из за лишних праймеров? Почему получился такой гомогенный (судя по полосе) продукт? Во фронте в обоих вариантах какие то "облачка", которые логично было бы списать на какой то "низкомолекулярный мусор", однако они удивительным образом "отстают" в вариантах друг от друга ровно на то же расстояние, что и целевой продукт. Не являются ли эти облачка одноцепочечной ДНК, недостроенной в ходе стадии финальной элонгации? Картинки: pcr_question.jpg — (291.46к) |
distemper Постоянный участник |
если планируется читать-клонировать режьте из геля и все дела если просто плюс-минус смотрите (в смысле есть-нет заразы) то и вообще побоку. нужный фрагмент в мажоре и аллах с ним. ну амплифицируется ересь какая-то да фиг с ней. если каждый артефакт разбирать пцр-форезный так жизни не хватит. и нет, это не одноцепочка. она не на много легче идет как показывает практика
|
-Ъ- Постоянный участник Москва |
Спешу успокоить - у Вас все хорошо, практически идеально. Даже праймеры видны, правда первая пара слегка димеризовалась, возможно, из-за избытка одного из праймеров, как вы писали... Но, возможно, эти праймеры димеризуются и без избытка, такие "родились". В остальном - все прекрасно. В чем проблема? Врядь ли Евроген продает мастермиксы без "хот-старта"..
|
metrim Постоянный участник Москва |
форез хоть и не первый, но просто в данном случае наконец попробовали поэксперементировать с ПЦР программой, потому и стал присматриваться пристальнее и хотелось разобраться "что же там есть". Раньше просто смотрел наличие полосок продукта , а тут итрансиллюминатор видимо получше светит (312нм) , потому все и видно получше. С "облачками" внизу это меня конечно прглючило, смутило, что они на том же расстоянии что и продукты. Сейчас посмотрел на праймеры, они у первой пары просто чуть короче нежели у второй |
sceptique Постоянный участник временной жизни |
Скорее всего нет. Чтобы это проверить прогоните через этот ПЦР пустую чистую воду в качестве шаблона вместо бактериальной ДНК. В случае если это неспецифическая помойка с бактерий - оно исчезнет вслед продукту. Если праймерные чудеса - останется и у воды. Отрицательный контроль типа. > Почему получился такой гомогенный (судя по полосе) продукт? Он таким и должен быть, это же бактериальная геномка. Почти идеальный шаблон для ПЦР. Чище и гомогеннее результат бывает - только от вирусных линейных ДНК и линеаризованных плазмид. > Во фронте в обоих вариантах какие то "облачка", которые логично было бы списать на какой то "низкомолекулярный мусор", однако они удивительным образом "отстают" в вариантах друг от друга ровно на то же расстояние, что и целевой продукт. Не являются ли эти облачка одноцепочечной ДНК, недостроенной в ходе стадии финальной элонгации? Такое может быть только когда продукт имеет протяженные повторы и самокомплиментарен, слипаясь небольшим процентом в "сковородки". На этапе финальной элонгации такие не появляются. Но если Вам интересно - вырежьте это облачко из геля, выделите и почистите ДНК китом для выделения из агарозных гелей в МИНИМАЛЬНЫЙ ОБЪЁМ. И с этого объёма повторите ПЦР. Если получится Ваш специфический продукт опять жирной гомогенной линией - то вероятно это действительно одноцепочечная сковородка в виде облачка мигрировала. А может - контаминация ампликоном... Вам тут правильно советуют - хотите проверить что-то - вырезайте из геля, чистите от агарозы и этидия и анализируйте и пользуйтесь дальше.
|
X34 Участник |
(-Ъ- @ 06.07.2017 11:41) уж извините но евроген та еще тухлятина, колонки тянут процентов 25 от заявленной емкости, ферменты не тянут даже в сравнении с ферментасом (царство ему небесное), в общем ВТО и по молбиолу бьет судя по всему.
|
Panaev Постоянный участник |
|
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(X34 @ 06.07.2017 16:23) уж извините но евроген та еще тухлятина, колонки тянут процентов 25 от заявленной емкости, ферменты не тянут даже в сравнении с ферментасом (царство ему небесное), в общем ВТО и по молбиолу бьет судя по всему. Ок, тогда мы идем к вам, антиглобалистам.
|
X34 Участник |
|
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(X34 @ 07.07.2017 03:13) а мы не то чтобы антиглобалисты. ферменты свои доморощеные почти все, колонки покупаем кулями у зиморесерча, растворы к ним могут даже студенты-аспиранты ЕГЭшные приготовить Ну вот, я и предлагаю свои колоночки для теста. Ресурса там больше чем нужно, примерно в 2-3 раза. Крышек правда на них нет и из-за этого некоторые свои чувствительные места воротят, пардон. Кстати, растворы тоже участвуют в этом деле - в статьях и патентах одно, а на самом деле требуется серьезная оптимизация. А доморощенные ферменты - это очень плохо. В хозяйстве нужно иметь лучшие образцы. Я понимаю, опправлять надо в Сибирь? Пишите в личку. |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(metrim @ 06.07.2017 15:24) Большое спасибо за ответы! форез хоть и не первый, но просто в данном случае наконец попробовали поэксперементировать с ПЦР программой, потому и стал присматриваться пристальнее и хотелось разобраться "что же там есть". Раньше просто смотрел наличие полосок продукта , а тут итрансиллюминатор видимо получше светит (312нм) , потому все и видно получше. С "облачками" внизу это меня конечно прглючило, смутило, что они на том же расстоянии что и продукты. Сейчас посмотрел на праймеры, они у первой пары просто чуть короче нежели у второй Если хотите разглядывать все детали что там происходит "внизу", с праймерами, димерами праймеров и др. низкомолекулярной неспецификой, плавно переходите на 2% агарозу и подходящий по размерам маркер ММ. |
LMP Постоянный участник |
|
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(LMP @ 07.07.2017 14:06) не х34, а ХЗ 4. |
R-J-Dio Постоянный участник |
|
metrim Постоянный участник Москва |
(R-J-Dio @ 07.07.2017 20:26) А заодно можете убедительно расказать: сможет ли Евроген нормально прочесть эти полосочки. Сейчас как раз в больших размышлениях о куда на секвенирование отдавать образцы. Сдавал ранее в Синтол, так там из нормальных таких полосочек как на картинках - выдавали 70, а то и 80% брака. Отдавал им образцы после ПЦР, с детектированной на форезе полосой, заказывал очистку и т.д., а в итоге - одни запоротые прочтения присылали.... |
LMOG |
(metrim @ 07.07.2017 23:24) А заодно можете убедительно расказать: сможет ли Евроген нормально прочесть эти полосочки. Сейчас как раз в больших размышлениях о куда на секвенирование отдавать образцы. Сдавал ранее в Синтол, так там из нормальных таких полосочек как на картинках - выдавали 70, а то и 80% брака. Отдавал им образцы после ПЦР, с детектированной на форезе полосой, заказывал очистку и т.д., а в итоге - одни запоротые прочтения присылали.... Полтараусу отдайте. Синтол - мягко говоряя не очень надежная контора. Ну а после ПЦР полосы самим надо чистить. Но судя по посту для вас форез и пцр - уже достижение. |
dk Постоянный участник Россия |
|
R-J-Dio Постоянный участник |
(metrim @ 07.07.2017 23:24) А заодно можете убедительно расказать: сможет ли Евроген нормально прочесть эти полосочки. Сейчас как раз в больших размышлениях о куда на секвенирование отдавать образцы. Сдавал ранее в Синтол, так там из нормальных таких полосочек как на картинках - выдавали 70, а то и 80% брака. Отдавал им образцы после ПЦР, с детектированной на форезе полосой, заказывал очистку и т.д., а в итоге - одни запоротые прочтения присылали.... убедительно... здесь не шоу-рум. Отдавайте- все будет нормально. Хотите- как есть, хотите- сами чистите из геля. Не понравится- поменяете контору. Обычно раз пришедшие приходят навсегда |
sceptique Постоянный участник временной жизни |
(R-J-Dio @ 08.07.2017 15:37) убедительно... здесь не шоу-рум. Отдавайте- все будет нормально. Хотите- как есть, хотите- сами чистите из геля. Не понравится- поменяете контору. Обычно раз пришедшие приходят навсегда Забавный набор ничего не значащих фраз из маркетологии... Главный секрет хороших результатов прогонов через секвенатор - секвенирующий ПЦР с шаблона строго на стороне секвенирующих, а не заказчиков + обезсоленный и полностью очищенный от всего раствор, идеально - выделять шаблон для отдачи секвеноидам препаративным ПААГ из геля, очищать китом в минимальный объём смыва с силики, после чего определять содержание ДНК и доводить его ровно до середины диапазона концентраций шаблона, который они принимают на сиквенс. Сообщение было отредактировано sceptique - 10.07.2017 15:39 |
R-J-Dio Постоянный участник |
|
MMM Постоянный участник |
|
R-J-Dio Постоянный участник |
ни к черту |
petr Постоянный участник |
(metrim @ 07.07.2017 20:24) А заодно можете убедительно расказать: сможет ли Евроген нормально прочесть эти полосочки. Сейчас как раз в больших размышлениях о куда на секвенирование отдавать образцы. Сдавал ранее в Синтол, так там из нормальных таких полосочек как на картинках - выдавали 70, а то и 80% брака. Отдавал им образцы после ПЦР, с детектированной на форезе полосой, заказывал очистку и т.д., а в итоге - одни запоротые прочтения присылали.... Оно конечно дополнительный геморрой, но, если есть возможность, заклонируйте полоску в Т-вектор, если ПЦРили обычной полимеразой без 3->5 экзо- активности (если с таковой, то нашить А, и все равно клонировать в Т-вектор), и отдайте его на сиквенс. Результаты Вам понравятся. |
petr Постоянный участник |
(metrim @ 05.07.2017 23:40) Уважаемые коллеги, помогите разобраться с результатами ПЦР и последующего фореза. Поставили ПЦР из одной матрицы (бактерия) по 3 повторности на 2 разных региона. Один фрагмент должен был получаться 1200, другой - 1500. Реакцию проводил на еврогеновском мастермиксе. Праймеры по 20 буковок примерно. В случае с фрагме00нтом на 1200 накосячили и внесли по ошибке два раза один из праймеров После ПЦР поставили форез на 1% агарозе с ТАЕ с еврогеновским же ладером. Результат на прилагающейся картинке. Вроде как реакция прошла хорошо, смущают только дополнительные полосы и "облака", на глаз их было виднее. Правильно ли я понимаю, что в районе 350 у меня какой то артефакт, получившийся из за лишних праймеров? Почему получился такой гомогенный (судя по полосе) продукт? Во фронте в обоих вариантах какие то "облачка", которые логично было бы списать на какой то "низкомолекулярный мусор", однако они удивительным образом "отстают" в вариантах друг от друга ровно на то же расстояние, что и целевой продукт. Не являются ли эти облачка одноцепочечной ДНК, недостроенной в ходе стадии финальной элонгации? Забейте на облачка, у Вас замечательный ПЦР. |
R-J-Dio Постоянный участник |
(petr @ 12.07.2017 07:58) Оно конечно дополнительный геморрой, но, если есть возможность, заклонируйте полоску в Т-вектор, если ПЦРили обычной полимеразой без 3->5 экзо- активности (если с таковой, то нашить А, и все равно клонировать в Т-вектор), и отдайте его на сиквенс. Результаты Вам понравятся. разумеется, так и надо. Так все и просят- отбоя нет |
Carbon Copy Постоянный участник So close no matter how far |
(metrim @ 05.07.2017 23:40) ...Вроде как реакция прошла хорошо, смущают только дополнительные полосы и "облака", на глаз их было виднее. Облака, белогривые лошадки. Достаёт этот российский научный фольклор подчас. Когда же перестанут всякие смешные термины изобретать? Не облака, а димеры, не шаблон, а матрица, не зонд а проба. Трудно вас понять иногда, о чём вы вообще говорите. |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(Carbon Copy @ 12.07.2017 17:24) Облака, белогривые лошадки. Достаёт этот российский научный фольклор подчас. Когда же перестанут всякие смешные термины изобретать? Не облака, а димеры, не шаблон, а матрица, не зонд а проба. Трудно вас понять иногда, о чём вы вообще говорите. Это чтоб у врагов мозги расплавились. Последний раз повторяю: по-русски не проба, а зонд, а по-немецки - sonde. |
LMP Постоянный участник |
|
R-J-Dio Постоянный участник |
Но где это «где-то» не знает никто тут" |
ship Постоянный участник Moscow |
|
Carbon Copy Постоянный участник So close no matter how far |
(-Ъ- @ 12.07.2017 16:17) Это чтоб у врагов мозги расплавились. Последний раз повторяю: по-русски не проба, а зонд, а по-немецки - sonde. Ну и что? А в Зимбабве как пробы называют? И что мне зимбабвийский теперь учить? И не надо мне ничего в последний раз повторять. Последний - вообще нехорошее слово, типа завтра - всё, пздц и ничего больше не будет, ни проб, ни зондов. |
R-J-Dio Постоянный участник |
|
ship Постоянный участник Moscow |
(R-J-Dio @ 13.07.2017 08:54) Лучше ПЦР мешать на святой воде. Гарантировано не будет димеров, шмера и неспецифики, матрица будет амплифицироваться, а зонды гибридизоваться с мишенью. |
R-J-Dio Постоянный участник |
(ship @ 13.07.2017 13:01) Лучше ПЦР мешать на святой воде. Гарантировано не будет димеров, шмера и неспецифики, матрица будет амплифицироваться, а зонды гибридизоваться с мишенью. у меня стоко нету.... |
LMP Постоянный участник |
(ship @ 13.07.2017 10:01) Лучше ПЦР мешать на святой воде. Гарантировано не будет димеров, шмера и неспецифики, матрица будет амплифицироваться, а зонды гибридизоваться с мишенью. Water PCR-grade, nuclease free, consecrated, from Nazareth /Quality garanted from Above/ |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(Carbon Copy @ 13.07.2017 02:43) Ну и что? А в Зимбабве как пробы называют? И что мне зимбабвийский теперь учить? И не надо мне ничего в последний раз повторять. Последний - вообще нехорошее слово, типа завтра - всё, пздц и ничего больше не будет, ни проб, ни зондов. В Зимбабве как Мугабе скажет так и будет, а у нас в России все по-другому. Не буду я говорить анилин вместо отжига, так же как: затравка vs праймер, амплификатор vs термоциклер... мотоцикл. Русский язык, то бишь русский научный жаргон, не умирающий, чтобы так тупо принимать чужеродные слова! Испытания они должны проходить. Так что не надо ля-ля. Собери конфу и утверди научную терминологию, в конце концов. |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(LMP @ 13.07.2017 14:03) Неужели 10-кратный!? |
LMP Постоянный участник |
|
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(LMP @ 13.07.2017 14:38) Ах да... А я размечтался. |
ksm Постоянный участник |
|
metrim Постоянный участник Москва |
(ksm @ 13.07.2017 16:19) W205710 Aldrich Isoamyl alcohol grade: FG, Halal, Kosher |
sceptique Постоянный участник временной жизни |
(Carbon Copy @ 12.07.2017 17:24) Облака, белогривые лошадки. Достаёт этот российский научный фольклор подчас. Когда же перестанут всякие смешные термины изобретать? Не облака, а димеры, не шаблон, а матрица, не зонд а проба. Трудно вас понять иногда, о чём вы вообще говорите. Вы учить детей в школу идите. Там же Вам скажут, как переводится на русский слово PCR template/DNA template (Matrix has you?). (Carbon Copy @ 13.07.2017 02:43) Последний - вообще нехорошее слово, типа завтра - всё, пздц и ничего больше не будет, ни проб, ни зондов. Редкая здравая мысль о конце, поздравляю. Кому-что, как известно, но помирать придётся всем, потому нужно не бояться этого, а готовиться. И явно не исключением слова "последний" из языка, что есть чистое безумие, как и template матрицей переводить. Сообщение было отредактировано sceptique - 20.07.2017 01:30 |
ship Постоянный участник Moscow |
(sceptique @ 19.07.2017 23:25) И явно не исключением слова "последний" из языка, что есть чистое безумие, как и template матрицей переводить. Слово template переводится с английского языка как: шаблон, образец, модель, лекало (pattern, sample) матрица (matrix) трафарет (stencil) эталон (standard) И тут формально ты прав. Но меня интересует почему ты выбрал для себя"шаблон", а на например не "лекало" или "трафарет"? Но помимо формального перевода есть такая вещь как устоявшиеся термины, и даже в википедии используют слово матрица. Можешь привести пример употребелняи "шаблона" в нормальной русскоязычной литературе? |
sceptique Постоянный участник временной жизни |
Словарь выбрал для меня. |
ship Постоянный участник Moscow |
(sceptique @ 20.07.2017 17:57) Бредятина. На вопрос лучше ответь прямо. А не увиливай. Где-нибудь в литературе видел такой перевод? |
sceptique Постоянный участник временной жизни |
|
Carbon Copy Постоянный участник So close no matter how far |
(sceptique @ 19.07.2017 23:25) Вы учить детей в школу идите. Там же Вам скажут, как переводится на русский слово PCR template/DNA template (Matrix has you?). Да, смертные мы. И этим от вас, ботов, отличаемся. И русский язык мы учили не по словарям и учебникам, а от мамы с папой. И ты это, на Matrix батон не кроши, а то выглядит как пчёлы против мёда.
Редкая здравая мысль о конце, поздравляю. Кому-что, как известно, но помирать придётся всем, потому нужно не бояться этого, а готовиться. И явно не исключением слова "последний" из языка, что есть чистое безумие, как и template матрицей переводить. |
sceptique Постоянный участник временной жизни |
А в школе - ,простите, букварь+учебник+словарь. Как и в изучении английского в старших классах. Есть еще слова "рыба" для замены слова "шаблон", но в биологии это может совсем всех запутать, откуда взялась рыбья ДНК в реакции, когда выделяли человечью. А между "рыбами" и "матрицами" - тот самый "шаблон", правильный и понятный всем. |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(sceptique @ 21.07.2017 20:37) Я от мамы с папой слово "матрица" класса до 7-го не слышал, не всем так везет - узнавать про ДНК и матрицы дома до школы от родителей. А в школе - ,простите, букварь+учебник+словарь. Как и в изучении английского в старших классах. Есть еще слова "рыба" для замены слова "шаблон", но в биологии это может совсем всех запутать, откуда взялась рыбья ДНК в реакции, когда выделяли человечью. А между "рыбами" и "матрицами" - тот самый "шаблон", правильный и понятный всем. На молбиоле только двое, скептик с ядреным парнем , пользуются шаблоном... Но банить "их" за это не стоит. |
sceptique Постоянный участник временной жизни |
|
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |