Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
Дядя ФАКСер moderator Nothern Maccaronia, Ticinum |
|
diesell Москва |
Выложите еще раз, пожалуйста. |
Дядя ФАКСер moderator Nothern Maccaronia, Ticinum |
|
guest: Василий IP-штамп: fr7T68farXORs гость |
Насколько я понял, основная величина есть индекс пролиферации PI, который считается как отношение суммы событий в каждом поколении к сумме исходных родительских клеток (что есть остаток от деления числа событий в каждом поколении на 2 в степени, соответствующей номеру поколения). НО возникает вопрос: в случае стимуляции лифоцитов антиген презентирующими клетками с костимуляционными молекулами, в пролиферацию уходят далеко не все лимфоциты, часть из них будет молчать, и будут сидеть в 1 пике наиболее интенсивно окрашенных CFSE. Отсюда возникает вопрос: считать надо вообще все клетки, меченые CFSE, или желательно вытащить активированные клетки? В принципе это не сложно с помощью антиCD25 А результаты будут совсем разными: (CFSE-FITC, CD45-VioBlue, CD25-APC) Как правильнее поступить?
|
Дядя ФАКСер moderator Nothern Maccaronia, Ticinum |
Менее точный способ - сделать мультигейт (на гистограмме) по каждому из пиков и считать PI. Кстати, подход с гейтингом по CD25 не особо хорош - после нескольких делений активационные маркеры частенько уходят в даун. P.S. На дотплот CD45 vs CFSE и CD25 vs CFSE (gated on CD45+) можно взглянуть? P.P.S. Кстати, последовательность логический гейтов на вышеприведенном примере не совсем корректна. Следовалобы,сначала, сделать гейт по скаттером. а потом, уже из него - сабсеттинг и отсечку CFSE- и "хвостов". |
Guest IP-штамп: fr7T68farXORs гость |
По поводу FlowJo я знаю, вот только в данный момент нет средств приобрести данный софт, поэтому по мультигейтам буду считать. У меня проблема не столько в точности вычисления, сколько с определением тех клеток, которые надо считать По поводу эксперимента: сейчас все материалы и обсуждения по поводу обычного пролиферативного теста ( выделенные CD4+CD25- эффекторные клетки и CD3- антиген-презентирующие, орбработанные антибиотиком чтоб не росли) Почему я решил сначала гейтировать CFSE-положительные события- потому как клетки, не меченые CFSE, дают нормальную такую кляксу на сайд/скаттер плоте, и мешают выделить пролиферирующие клетки. Хотя, по идее, при обратном порядке гейтирования результат чисто логически должен быть тот же... Вот плоты с гейтированием с сайд/скаттера. Видоно, что в гейте P2 помимо немеченных CFSE антиген-презентирующих клеток есть еще и часть меченных эффекторных, не прошедших ни одного деления. Значительная часть "молчащих" клеток сидит и в гейте P1, вот и думаю как их убрать(если вообще надо это делать) |
Guest IP-штамп: frY1HAkYEwTNk гость |
как я боролся с покоящимися клетками, гейтировав по CD45/CD25 И вот вся схема поэтапного гейтирования ( здесь не изображен только 1 этап, когда я выбирал только FITC-положительный сигнал) Самое веселое- это то, что изначальная популяция эффекторных клеток была отсепарирована на магнитных частицах как CD4+CD25-, однако в каждой популяции кол-во CD25hi росло. Т.е. если условно разбить на субпопуляции по CD25neg, CD25dim и CD25hi, на последней гистограмме изображены распределения по CFSE для CD25hi(розовый график) CD25dim (оранжевый) и их сумма для всех CD25+ (синий) Можно предположить, что CD25hi это какие-нить индуцированные из эффекторных Т-регуляторы, которые стремятся подавить пролиферацию активированных CD4-клеток (по крайней мере я собираюсь проверить это предположение, проверив культуру по foxp3) и мне кажется логичным считать именно CD25dim Однако исходный вопрос все еще остается открытым: как мне считать PI? ))))) Какие еще активационные маркеры стоит посмотреть? HLA-DR, CD45RO, CD127? Или забить и считать все CD4+? Кто оценивал пролиферацию лимфоцитов вообще? |
Дядя ФАКСер moderator Nothern Maccaronia, Ticinum |
Foxp3 добавить бы (для точного отлова Treg). И Ki-67 - дабы поймать клетки в S-G2. и т.д. Собственно,как раз активация-пролиферация T клеток-это то, чем я занимаюсь последние лет 8. Какие у Вас ограничения по цветам (аппаратные,т.е.- что за цитометр)? |
Дядя ФАКСер moderator Nothern Maccaronia, Ticinum |
|
Guest IP-штамп: fr7T68farXORs гость |
Еще такой вопрос по поводу компенсации FITC/PE в случае CFSE: теоретически это возможно, на практике мне удается с трудом, м.б. слишком много добавляю CFSE? хотя клетки вроде не сильно дохнут и по прошествии 6 дней культивации без смены среды. Foxp3 на неделе планирую посмотреть, как культура подрастет, но на руках у меня только anti-Foxp3-PE Так же хочу узнать по поводу PECy5 канала, можно ли в теории скомпенировать его По поводу CD25hi - меня смутило то, что 25hi-популяция реально выглядит как обособленная, у нее даже другие пики на гистограмме по FITC- немного сдвинутые вправо. Поэтому среди всех 25+ клеток (синяя гистограмма) даже просто посчитать кол-во генераций очень трудно. |
Дядя ФАКСер moderator Nothern Maccaronia, Ticinum |
2) PE-Cy5- без проблем (если тандем качественный). Не вижу никаких траблорв тут, ибо у Кванта полна матриа компенсаций. Вот с PE-Cy7 и PE-Cy5.5 в паре с PE были бы траблы ( жффективность энергопереноса у сих тандемов= хреновая, как уже неоднократно писал во многих темах, и они забивают PE-канал и по дурному лезут в красный) 3) Стимуляция сильная, бывает. Плюс, как понимаю- культура не особо синхронизированная. А пики сдвинуты в развертке FITC vs APC- ну так, компенсировать ручками, поиграться тоже. |
Guest IP-штамп: frY1HAkYEwTNk гость |
Vioblue-CD45, APC-CD4, PE-CD25 А Foxp3-PE не удается четко скомпенсировать, при увеличении напряжения на канале каша получается- из первого пика самых ярких по CFSE пробивается сигнал в канал PE, буду уменьшать кол-во добавляемого CFSE >>как понимаю- культура не особо синхронизированная не могли бы вы пояснить что вы имели ввиду, я пока что нуб в клеточных технологиях |
Guest IP-штамп: frDgDej8ywMnQ гость |
|
« Предыдущая тема · Клеточные технологии · Следующая тема » |