Rambler's Top100
Лёгкая версия форума* Виртуальная клавиатура  English  
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы
Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Междисциплинарный биологический онлайн-журналZbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ


Темы за 24 часа  [ Вход* | Регистрация* ]  
   



Форум: 
 

* Современные решения для трансфекции клеток -- deleted by Дядя ФАКСер --
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.


 
Добавить сообщение в темуСоздать новую тему
Участник оффлайн! Дядя ФАКСер
Постоянный участник
Nothern Maccaronia, Ticinum



 прочитанное сообщение 26.10.2017 23:13     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail  ICQ
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #1 множественное цитирование

Современные решения для трансфекции клеток

Оригинал статьи - http://helicon.ru/support/methodological/s...fektsii-kletok/

Основой для любых генно-инженерных манипуляций с клетками человека и животных является трансфекция – процесс введения в клетки чужеродной нуклеиновой кислоты. В зависимости от поставленной задачи в клетку можно вводить плазмидную ДНК, малые интерферирующие РНК (siRNA), микроРНК (miRNA), малые РНК, образующие шпильки (shRNA), а также белки.
Трансфекцию используют в экспериментах по нокаутированию и регуляции экспрессии генов, для введения в клетку генов активаторов и репрессоров транскрипции, нуклеаз, флуоресцентных белков и т.д.
Важными характеристиками трансфекции является её эффективность (% клеток, в которые проник трансфекционный материал) и жизнеспособность клеток после трансфекции.

Основные методы трансфекции клеток:

Лентивирусная трансфекция. Нужная последовательность ДНК встраивается в геном лентивируса, который проникает в клетку благодаря взаимодействиюповерхностных вирусных белков с цитоплазматической мембраной
Электропорация. Под действием электрического поля в мембране клеток образуются поры, через которые может проникнуть чужеродная нуклеиновая кислота/белок
Трансфекция с помощью катионных липидных частиц. Отрицательно заряженная ДНК/РНК взаимодействует с положительно заряженными липидными частицами, которые проникают через мембрану клеток путём гидрофобных взаимодействий с мембраной.

Компания Life technologies является одним из крупнейших поставщиков реагентов и приборов для трансфекции. Самыми популярными продуктами являются электропоратор Neon® и реагенты Lipofectamine® для трансфекции с помощью катионных липидных частиц.
С протоколами работы с реагентами Lipofectamine® и электропоратором Neon® можно подробно ознакомиться на сайте компании Life Technologies.

Трансфекция с помощью катионных липидов Lipofectamine®
Реагенты Lipofectamine® существуют на рынке уже более 25 лет и используются в ведущих лабораториях многих стран мира.

Принцип трансфекции с помощью реагентов Lipofectamine®:

Липидные частицы Lipofectamine® состоят из положительно заряженной «головки» и двух гидрофобных «хвостов». С помощью головки частицы взаимодействуют с фосфатными группами нуклеиновых кислот, в то время как хвосты обеспечивают прохождение ДНК/РНК через клеточную мембрану по принципу эндоцитоза (Рис.1).

Рис. 1 Схема трансфекции с помощью реагентов Lipofectamine®
картинка: 1_Lipofectamine_Principals_smallSize.png

Возможные недостатки различных методик трансфекции:
Низкая эффективность
Невысокая воспроизводимость результатов
Цитотоксичность
Трудоёмкость

Преимущества трансфекции с помощью катионных липидов Lipofectamine®:
Уникально высокая эффективность трансфекции
Применимость к широкому спектру эукариотических клеток
Высокая воспроизводимость результатов
Отсутствие цитотоксичности
Простота в использовании

Более того, некоторые клеточные линии трансфецируются исключительно с помощью катионных липидных частиц (ход трансфекции представлен на Рис. 2).
При выборе подходящего трансфекционного агента необходимо учитывать вид трансфекционного материала. Существуют универсальные реагенты (Lipofectamine® 2000 и 3000), которые подходят как для ДНК, так и для РНК. Новейшие реагенты разработаны специально для трансфекции клеток малыми интерферирующими (siRNA) и микроРНК (miRNA) (Lipofectamine® RNAiMAX) или мРНК (Lipofectamine® MessengerMAX™).
Кроме того, большое значение имеет тип трансфецируемых клеток. Стволовые клетки и клетки первичных культур, как правило, более требовательны к трансфекционным агентам, чем стабильные клеточные линии. Рекомендации по применению реагентов для конкретных клеточных линий можно найти по ссылке

Рис. 2 Ход эксперимента по трансфекции клеток с помощью Lipofectamine®
картинка: 2_Lipofectamine_workflow_diagram_resized.png

Lipofectamine®
картинка: 3_Lipofectamine_generic.jpg
Самый первый из появившихся на рынке катионно-липидный реагент для трансфекции ДНК в эукариотические клетки. Высокое качество трансфекции подтверждается десятками тысяч цитирований, начиная с выпуска продукта в 1993 году. Совместно с реагентом PLUS™ Lipofectamine® успешно трансфецирует такие клетки как BHK-21, NIH 3T3, COS-1, фибробласты, кератиноциты, HT-29, MRC-5 и SK-BR3.

Lipofectamine® LTX
картинка: 4_Lipofectamine__LTX.jpg
Самый эффективный трансфекционный реагент для работы с трудно-трансфецируемыми, чувствительными клетками и первичными клеточными культурами. Преимущество перед другими реагентами заключается в уникально высоком показателе жизнеспособности клеток после трансфекции (>90%). Эффективность трансфекции можно дополнительно повысить, используя Lipofectamine® LTX в комбинации с реагентом PLUS™.

Lipofectamine® 2000
картинка: 5_Lipofectamine__2000.jpg
Усовершенствованная версия реагента Lipofectamine® подходит для большинства клеточных линий. Широко применяется в качестве универсального трансфецирующего реагента (подходит для плазмидной ДНК, а также для экспериментов по нокдауну генов с помощью малых интерферирующих РНК (siRNA) и плазмид, кодирующих микроРНК (miRNA) и малые РНК, образующих шпильки (shRNA)). Подходит для котрансфекции ДНК и siRNA. Характеризуется наивысшим уровнем экспрессии рекомбинантного белка в трансфецированных клетках. Эффективно работает в присутствии сыворотки, что снимает необходимость смены среды после трансфекции. Эффективность трансфекции для некоторых клеточных линий достигает 99%.

NEW! Lipofectamine® 3000
картинка: 6_Lipofectamine__3000.jpg
Применение самых современных нанотехнологий позволило создать реагент, значительно превосходящий по эффективности реагент Lipofectamine® 2000. Более продуктивная трансфекция была показана для 50 клеточных линий из 63 (для большинства трудно поддающихся трансфекции клеток эффективность трансфекции увеличилась в 10 раз!). Высокая производительность трансфекции позволяет снизить количество реактива и, таким образом, уменьшить потенциальную токсичность для клеток. Lipofectamine® 3000 рекомендуется использовать при работе с системами TALEN и CRISPR как самый надежный и эффективный из существующих трансфекционных реагентов.

Lipofectamine® RNAiMAX
картинка: 7_Lipofectamine__RNAiMAX.jpg
Наилучшим образом подходит для экспериментов по нокдауну генов с помощью РНК-интерференции, так как разработан специально для введения в клетки синтетических малых интерферирующих РНК (siRNA) и микроРНК (miRNA). Катионные липиды данного реагента обладают специфичностью к малым РНК. Благодаря крайне низкой цитотоксичности реагента в широком диапазоне концентраций, возможна оптимизация протокола для решения конкретных задач. Повышенная эффективность трансфекции позволяет использовать более низкие концентрации РНК и увеличивает вероятность успешного нокдауна гена.

NEW! Lipofectamine® MessengerMAX ™
картинка: 8_Lipofectamine__MessengerMax.jpg
Инновационный реагент разработан специально для внедрения в клетки матричной РНК (мРНК). Преимущество трансфекции мРНК заключается в более быстрой экспрессии белков, отсутствии риска интеграции трансфецируемого материала в геном и независимость эффективности трансфекции от стадии клеточного цикла. Для некоторых задач мРНК является оптимальным трансфекционным материалом. Например, введение в клетку мРНК нуклеаз CRISPR увеличивает эффективность разрезания ДНК более чем в 10 раз. Реагент обладает высокой эффективностью при трансфекции нейронов и широкого спектра первичных клеточных линий.


Реагент PLUS™
картинка: 9_________PLUS_.jpg
Реагент используется совместно с катионными липидами Lipofectamine® для повышения эффективности трансфекции. Добавления реагента PLUS™ позволяет в 2 раза снизить количество трансфецируемой нуклеиновой кислоты и липидов. Кроме того, использование реагента расширяет спектр эффективно трансфецируемых клеточных линий (например, значительно увеличивается эффективность трансфекции клеток BHK-21 и NIH 3T3).


Трансфекция с помощью электропоратора Neon®

Электропорация является одним из наиболее распространённых методов трансфекции благодаря своей высокой эффективности.

Рис. 3 Принцип электропорации
картинка: 9_NEON_transfection.png

Клетки и трансфецируемый материал помещаются в проводящую среду, к которой на несколько микросекунд прикладывается высоковольтное электрическое поле. В результате в мембране клетки образуются поры, достаточного диаметра для прохождения сквозь них нуклеиновых кислот и белков. Поры остаются открытыми около 30 с. За это время трансфекционный материал проникает в клетку.

Ключевые параметры электропорации:
Сила импульса
Длительность импульса
Количество импульсов

Недостатки трансфекции с помощью традиционных электропораторов:
Низкая выживаемость клеток из-за интенсивного электролиза в трансфекционной камере, приводящая к перепадам pH и выбросу токсичных ионов металлов и хлора
Необходимость оптимизации протокола для каждого типа клеток

Электропоратор Neon™ компании Life technologies (Рис.4) разработан с учётом всех недостатков метода электропорации.
картинка: 10_neon.jpg

Трансфекционная камера Neon™ (Рис. 5)
картинка: 11_NEON_transfection_camera.png

представляет собой тонкий капилляр с маленькой поверхностью электродов. Камера такой конфигурации обладает электрическим сопротивлением, в 200 раз большим, чем традиционная кювета, что минимизирует электролиз и значительно повышает выживаемость клеток. Кроме того, образующееся в капилляре однородное электрическое поле без краевых эффектов формирует в клетках одинаковые по размеру поры, благодаря чему достигается максимальная эффективность трансфекции.
Преимущества трансфекции с помощью прибора Neon®:
Высокая эффективность (до 90% во многих клетках, включая трудно-трансфецируемые, стволовые клетки и клетки первичных культур)
Возможность доставки в клетки как ДНК и РНК, так и белков
Возможность варьирования количества клеток в широком диапазоне (от 2 х 104 до 6 х 106 на реакцию)
Единый набор реагентов для трансфекции всех типов клеток
Возможность оптимизации условий эксперимента с помощью изменения параметров электропорации
Простота в использовании
Капилляр Neon™ одновременно является и трансфекционной камерой, и наконечником дозатора Neon™, что сокращает протокол электропорации до трёх простых шагов:
картинка: 12_Neon_Procedure.png

Специально для прибора Neon® разработано большое количество протоколов, оптимизированных для трансфекции разных типов клеток.


скачать файл Modern_solutions_for_cell_transfection___Helicon.pdf
размер: 427.25к
кол-во скачиваний: 188


   *
« Предыдущая тема · Мусорница · Следующая тема »
Добавить сообщение в темуСоздать новую тему

Rambler   molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов              

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Ваш форум  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама  ·  Дата и время: 29.03.24 16:37
Bridged By IpbWiki: Integration Of Invision Power Board and MediaWiki © GlobalSoft