Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
Дядя ФАКСер Постоянный участник Nothern Maccaronia, Ticinum |
Оригинал статьи - Основой для любых генно-инженерных манипуляций с клетками человека и животных является трансфекция – процесс введения в клетки чужеродной нуклеиновой кислоты. В зависимости от поставленной задачи в клетку можно вводить плазмидную ДНК, малые интерферирующие РНК (siRNA), микроРНК (miRNA), малые РНК, образующие шпильки (shRNA), а также белки. Трансфекцию используют в экспериментах по нокаутированию и регуляции экспрессии генов, для введения в клетку генов активаторов и репрессоров транскрипции, нуклеаз, флуоресцентных белков и т.д. Важными характеристиками трансфекции является её эффективность (% клеток, в которые проник трансфекционный материал) и жизнеспособность клеток после трансфекции. Основные методы трансфекции клеток: Лентивирусная трансфекция. Нужная последовательность ДНК встраивается в геном лентивируса, который проникает в клетку благодаря взаимодействиюповерхностных вирусных белков с цитоплазматической мембраной Электропорация. Под действием электрического поля в мембране клеток образуются поры, через которые может проникнуть чужеродная нуклеиновая кислота/белок Трансфекция с помощью катионных липидных частиц. Отрицательно заряженная ДНК/РНК взаимодействует с положительно заряженными липидными частицами, которые проникают через мембрану клеток путём гидрофобных взаимодействий с мембраной. Компания Life technologies является одним из крупнейших поставщиков реагентов и приборов для трансфекции. Самыми популярными продуктами являются электропоратор Neon® и реагенты Lipofectamine® для трансфекции с помощью катионных липидных частиц. С протоколами работы с реагентами Lipofectamine® и электропоратором Neon® можно подробно ознакомиться на сайте компании Life Technologies. Трансфекция с помощью катионных липидов Lipofectamine® Реагенты Lipofectamine® существуют на рынке уже более 25 лет и используются в ведущих лабораториях многих стран мира. Принцип трансфекции с помощью реагентов Lipofectamine®: Липидные частицы Lipofectamine® состоят из положительно заряженной «головки» и двух гидрофобных «хвостов». С помощью головки частицы взаимодействуют с фосфатными группами нуклеиновых кислот, в то время как хвосты обеспечивают прохождение ДНК/РНК через клеточную мембрану по принципу эндоцитоза (Рис.1). Рис. 1 Схема трансфекции с помощью реагентов Lipofectamine® Возможные недостатки различных методик трансфекции: Низкая эффективность Невысокая воспроизводимость результатов Цитотоксичность Трудоёмкость Преимущества трансфекции с помощью катионных липидов Lipofectamine®: Уникально высокая эффективность трансфекции Применимость к широкому спектру эукариотических клеток Высокая воспроизводимость результатов Отсутствие цитотоксичности Простота в использовании Более того, некоторые клеточные линии трансфецируются исключительно с помощью катионных липидных частиц (ход трансфекции представлен на Рис. 2). При выборе подходящего трансфекционного агента необходимо учитывать вид трансфекционного материала. Существуют универсальные реагенты (Lipofectamine® 2000 и 3000), которые подходят как для ДНК, так и для РНК. Новейшие реагенты разработаны специально для трансфекции клеток малыми интерферирующими (siRNA) и микроРНК (miRNA) (Lipofectamine® RNAiMAX) или мРНК (Lipofectamine® MessengerMAX™). Кроме того, большое значение имеет тип трансфецируемых клеток. Стволовые клетки и клетки первичных культур, как правило, более требовательны к трансфекционным агентам, чем стабильные клеточные линии. Рекомендации по применению реагентов для конкретных клеточных линий можно найти по Рис. 2 Ход эксперимента по трансфекции клеток с помощью Lipofectamine® Самый первый из появившихся на рынке катионно-липидный реагент для трансфекции ДНК в эукариотические клетки. Высокое качество трансфекции подтверждается десятками тысяч цитирований, начиная с выпуска продукта в 1993 году. Совместно с реагентом PLUS™ Lipofectamine® успешно трансфецирует такие клетки как BHK-21, NIH 3T3, COS-1, фибробласты, кератиноциты, HT-29, MRC-5 и SK-BR3. Самый эффективный трансфекционный реагент для работы с трудно-трансфецируемыми, чувствительными клетками и первичными клеточными культурами. Преимущество перед другими реагентами заключается в уникально высоком показателе жизнеспособности клеток после трансфекции (>90%). Эффективность трансфекции можно дополнительно повысить, используя Lipofectamine® LTX в комбинации с реагентом PLUS™. Усовершенствованная версия реагента Lipofectamine® подходит для большинства клеточных линий. Широко применяется в качестве универсального трансфецирующего реагента (подходит для плазмидной ДНК, а также для экспериментов по нокдауну генов с помощью малых интерферирующих РНК (siRNA) и плазмид, кодирующих микроРНК (miRNA) и малые РНК, образующих шпильки (shRNA)). Подходит для котрансфекции ДНК и siRNA. Характеризуется наивысшим уровнем экспрессии рекомбинантного белка в трансфецированных клетках. Эффективно работает в присутствии сыворотки, что снимает необходимость смены среды после трансфекции. Эффективность трансфекции для некоторых клеточных линий достигает 99%. NEW! Применение самых современных нанотехнологий позволило создать реагент, значительно превосходящий по эффективности реагент Lipofectamine® 2000. Более продуктивная трансфекция была показана для 50 клеточных линий из 63 (для большинства трудно поддающихся трансфекции клеток эффективность трансфекции увеличилась в 10 раз!). Высокая производительность трансфекции позволяет снизить количество реактива и, таким образом, уменьшить потенциальную токсичность для клеток. Lipofectamine® 3000 рекомендуется использовать при работе с системами TALEN и CRISPR как самый надежный и эффективный из существующих трансфекционных реагентов. Наилучшим образом подходит для экспериментов по нокдауну генов с помощью РНК-интерференции, так как разработан специально для введения в клетки синтетических малых интерферирующих РНК (siRNA) и микроРНК (miRNA). Катионные липиды данного реагента обладают специфичностью к малым РНК. Благодаря крайне низкой цитотоксичности реагента в широком диапазоне концентраций, возможна оптимизация протокола для решения конкретных задач. Повышенная эффективность трансфекции позволяет использовать более низкие концентрации РНК и увеличивает вероятность успешного нокдауна гена. NEW! Инновационный реагент разработан специально для внедрения в клетки матричной РНК (мРНК). Преимущество трансфекции мРНК заключается в более быстрой экспрессии белков, отсутствии риска интеграции трансфецируемого материала в геном и независимость эффективности трансфекции от стадии клеточного цикла. Для некоторых задач мРНК является оптимальным трансфекционным материалом. Например, введение в клетку мРНК нуклеаз CRISPR увеличивает эффективность разрезания ДНК более чем в 10 раз. Реагент обладает высокой эффективностью при трансфекции нейронов и широкого спектра первичных клеточных линий. Реагент используется совместно с катионными липидами Lipofectamine® для повышения эффективности трансфекции. Добавления реагента PLUS™ позволяет в 2 раза снизить количество трансфецируемой нуклеиновой кислоты и липидов. Кроме того, использование реагента расширяет спектр эффективно трансфецируемых клеточных линий (например, значительно увеличивается эффективность трансфекции клеток BHK-21 и NIH 3T3). Трансфекция с помощью электропоратора Электропорация является одним из наиболее распространённых методов трансфекции благодаря своей высокой эффективности. Рис. 3 Принцип электропорации Клетки и трансфецируемый материал помещаются в проводящую среду, к которой на несколько микросекунд прикладывается высоковольтное электрическое поле. В результате в мембране клетки образуются поры, достаточного диаметра для прохождения сквозь них нуклеиновых кислот и белков. Поры остаются открытыми около 30 с. За это время трансфекционный материал проникает в клетку. Ключевые параметры электропорации: Сила импульса Длительность импульса Количество импульсов Недостатки трансфекции с помощью традиционных электропораторов: Низкая выживаемость клеток из-за интенсивного электролиза в трансфекционной камере, приводящая к перепадам pH и выбросу токсичных ионов металлов и хлора Необходимость оптимизации протокола для каждого типа клеток Электропоратор Neon™ компании Life technologies (Рис.4) разработан с учётом всех недостатков метода электропорации. Трансфекционная камера Neon™ (Рис. 5) представляет собой тонкий капилляр с маленькой поверхностью электродов. Камера такой конфигурации обладает электрическим сопротивлением, в 200 раз большим, чем традиционная кювета, что минимизирует электролиз и значительно повышает выживаемость клеток. Кроме того, образующееся в капилляре однородное электрическое поле без краевых эффектов формирует в клетках одинаковые по размеру поры, благодаря чему достигается максимальная эффективность трансфекции. Преимущества трансфекции с помощью прибора Neon®: Высокая эффективность (до 90% во многих клетках, включая трудно-трансфецируемые, стволовые клетки и клетки первичных культур) Возможность доставки в клетки как ДНК и РНК, так и белков Возможность варьирования количества клеток в широком диапазоне (от 2 х 104 до 6 х 106 на реакцию) Единый набор реагентов для трансфекции всех типов клеток Возможность оптимизации условий эксперимента с помощью изменения параметров электропорации Простота в использовании Капилляр Neon™ одновременно является и трансфекционной камерой, и наконечником дозатора Neon™, что сокращает протокол электропорации до трёх простых шагов: Специально для прибора Neon® разработано большое количество протоколов, оптимизированных для трансфекции разных типов клеток.
|
« Предыдущая тема · Мусорница · Следующая тема » |