Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
Panaev Постоянный участник |
|
Tom1 Постоянный участник |
|
Panaev Постоянный участник |
|
Bear Постоянный участник Москва |
|
MMM Постоянный участник |
|
Bear Постоянный участник Москва |
(MMM @ 11.07.2018 11:21) Ок. Каюсь. А где ещё есть группы? |
plurgene Постоянный участник |
|
Bear Постоянный участник Москва |
|
NMR-guy Постоянный участник временной жизни |
В перспективе, если речь идёт не о селективном нокауте, а о направленной вставке в таргетный разрыв, можно ожидать тоже повышенной эффективности интеграции, но у процесса направленной интеграции эффективность повышать глупо, гораздо умнее - повышать в те самые 10 раз специфичность, когда вставка вставляется РОВНО в 1 место. Если раньше над этим бились месяцы и годами, то сейчас это станет вполне возможно делать с гораздо меньшего числа попыток, поскольку теперь единственность точки разрыва можно гарантировать, если это нужно. |
ship Постоянный участник Moscow |
(Panaev @ 10.07.2018 11:21) Вопрос такой - насколько эта технология эффективна для получения эукариотических продуцентов больших белковых комплексов. Например, вирусоподобных частиц? А где связь между CRISPR и получением продуцентов? что вы конкретно имеете в виду? и вообще не стоит CRISPR рассматривать как чтото доступное лишь избранным)) одна плазмидка и вот вы уже геномный инженер.
|
Vadim Sharov Постоянный участник Россия |
С другой стороны Европейский суд приравнял CRISPR-продукты к ГМО. «по решению высшей судебной инстанции ЕС, на организмы, модифицированные с помощью CRISPR/Cas9 и других подобных технологий, будет распространяться директива ЕС 2001 года, устанавливающая жесткие ограничения по безопасности и предварительному одобрению регуляторными органами для ГМ-продуктов. Суд, в частности, постановил, что исключения из директивы распространяются только на методы мутагенеза, безопасность которых доказана многолетней практикой — и CRISPR к таким методам пока не относится». . Исследователи показали, что использование системы CRISPR/Cas в клетках млекопитающих с достаточно высокой вероятностью приводит к возникновению больших делеций и даже геномных перестроек в результате работы клеточных систем репарации. В отличие от предыдущих опасений о том, что система вносит нецелевые мутации, в данном случае указанные перестройки были обнаружены именно в том месте, куда был направлен CRISPR. Работа с выводами ученых опубликована в Nature Biotechnology, а в редакционной заметке Nature можно ознакомиться с комментариями специалистов по этому поводу. (https://nplus1.ru/news/2018/07/18/CRISPR-on-targets) Стоит отметить, что кроме исследований идет явна борьба оптимистов против пессимистов. Так проКРИСП лобби смогло отозвать критическую статью. Ссылки по ссылке: |
Panaev Постоянный участник |
(ship @ 11.07.2018 13:09) Вернемся к теме. Хочу, например, быстро и с гарантированным успехом получить линию CHO, продуцирующую вирусоподобные частицы. Ну, допустим, у вируса основной иммуноген - это четвертичный конформационный эпитоп и способ гликозилирования также влияет на иммуногенность. То есть нужно делать вирусоподобные частицы и всякие дрожжи и коли не пойдут. Вот от сюда и вопрос. |
zzz5 Участник |
(Panaev @ 03.03.2020 11:30) Вернемся к теме. Хочу, например, быстро и с гарантированным успехом получить линию CHO, продуцирующую вирусоподобные частицы. Ну, допустим, у вируса основной иммуноген - это четвертичный конформационный эпитоп и способ гликозилирования также влияет на иммуногенность. То есть нужно делать вирусоподобные частицы и всякие дрожжи и коли не пойдут. Вот от сюда и вопрос. с Китайскими Хамячками в Мире никто давно не работает дурная линия |
Panaev Постоянный участник |
(zzz5 @ 03.03.2020 11:37) Ок, возможно, я отстал от жизни. Посоветуйте, пожалуйста, суспензионную линию, удобную для трансформации и которую можно гарантировано аттестовать как линию-продуцент для производства лекарственных препаратов? |
zzz5 Участник |
(Panaev @ 03.03.2020 11:44) Ок, возможно, я отстал от жизни. Посоветуйте, пожалуйста, суспензионную линию, удобную для трансформации и которую можно гарантировано аттестовать как линию-продуцент для производства лекарственных препаратов? Хелена Лав |
zzz5 Участник |
(Panaev @ 03.03.2020 11:44) Ок, возможно, я отстал от жизни. Посоветуйте, пожалуйста, суспензионную линию, удобную для трансформации и которую можно гарантировано аттестовать как линию-продуцент для производства лекарственных препаратов? HeLa |
zzz5 Участник |
(Panaev @ 03.03.2020 11:44) Ок, возможно, я отстал от жизни. Посоветуйте, пожалуйста, суспензионную линию, удобную для трансформации и которую можно гарантировано аттестовать как линию-продуцент для производства лекарственных препаратов? |
zzz5 Участник |
(Panaev @ 03.03.2020 11:30) Вернемся к теме. Хочу, например, быстро и с гарантированным успехом получить линию CHO, продуцирующую вирусоподобные частицы. Ну, допустим, у вируса основной иммуноген - это четвертичный конформационный эпитоп и способ гликозилирования также влияет на иммуногенность. То есть нужно делать вирусоподобные частицы и всякие дрожжи и коли не пойдут. Вот от сюда и вопрос. панаев ты кагданить работал с Китайским Хамячком он на 13 пассаже уже раковый |
zzz5 Участник |
(Vadim Sharov @ 28.07.2018 14:26) С одной стороны, Совет по этике Великобритании признал генетическую модификацию младенцев этически приемлемой. Оптимизма у просветителей через край «Родители вскоре могут получить возможность редактировать гены детей до их рождения, изменяя их ДНК таким образом, который повлияет на их здоровье и усилит их чувства, силу или даже интеллект». С другой стороны Европейский суд приравнял CRISPR-продукты к ГМО. «по решению высшей судебной инстанции ЕС, на организмы, модифицированные с помощью CRISPR/Cas9 и других подобных технологий, будет распространяться директива ЕС 2001 года, устанавливающая жесткие ограничения по безопасности и предварительному одобрению регуляторными органами для ГМ-продуктов. Суд, в частности, постановил, что исключения из директивы распространяются только на методы мутагенеза, безопасность которых доказана многолетней практикой — и CRISPR к таким методам пока не относится». . Исследователи показали, что использование системы CRISPR/Cas в клетках млекопитающих с достаточно высокой вероятностью приводит к возникновению больших делеций и даже геномных перестроек в результате работы клеточных систем репарации. В отличие от предыдущих опасений о том, что система вносит нецелевые мутации, в данном случае указанные перестройки были обнаружены именно в том месте, куда был направлен CRISPR. Работа с выводами ученых опубликована в Nature Biotechnology, а в редакционной заметке Nature можно ознакомиться с комментариями специалистов по этому поводу. (https://nplus1.ru/news/2018/07/18/CRISPR-on-targets) Стоит отметить, что кроме исследований идет явна борьба оптимистов против пессимистов. Так проКРИСП лобби смогло отозвать критическую статью. Ссылки по ссылке: |
zzz5 Участник |
(Panaev @ 10.07.2018 14:21) Вопрос такой - насколько эта технология эффективна для получения эукариотических продуцентов больших белковых комплексов. Например, вирусоподобных частиц? Совещание состоялось в Москве через шесть недель после того, как научный журнал Nature опубликовал статью с критикой деятельности российского биолога Дениса Ребрикова, который анонсировал эксперимент по программированию человеческих генов, отмечает агентство. |
zzz5 Участник |
(Panaev @ 10.07.2018 14:21) Вопрос такой - насколько эта технология эффективна для получения эукариотических продуцентов больших белковых комплексов. Например, вирусоподобных частиц? Ведущие российские генетики и чиновники здравоохранения тайно встречались с предполагаемой старшей дочерью президента Владимира Путина, эндокринологом Марией Воронцовой, чтобы высказать ей аргументы за и против редактирования ДНК, сообщает Bloomberg со ссылкой на три источника, присутствовавших... Читать ещё |
zzz5 Участник |
(NMR-guy @ 11.07.2018 12:12) Этот инструмент в десятки раз ускоряет протоколы направленного нокаута генов, поскольку повышает специфичность таргетинга раз в 1000 (по сравнению с библиотечными цинковыми пальцами), а эффективность (количество успешных нокаутных клонодающих клеток) раз в 10, с единиц процентов до десятков процентов. В перспективе, если речь идёт не о селективном нокауте, а о направленной вставке в таргетный разрыв, можно ожидать тоже повышенной эффективности интеграции, но у процесса направленной интеграции эффективность повышать глупо, гораздо умнее - повышать в те самые 10 раз специфичность, когда вставка вставляется РОВНО в 1 место. Если раньше над этим бились месяцы и годами, то сейчас это станет вполне возможно делать с гораздо меньшего числа попыток, поскольку теперь единственность точки разрыва можно гарантировать, если это нужно. геич свижо придание да верится с трудом |
zzz5 Участник |
(NMR-guy @ 11.07.2018 12:12) Этот инструмент в десятки раз ускоряет протоколы направленного нокаута генов, поскольку повышает специфичность таргетинга раз в 1000 (по сравнению с библиотечными цинковыми пальцами), а эффективность (количество успешных нокаутных клонодающих клеток) раз в 10, с единиц процентов до десятков процентов. В перспективе, если речь идёт не о селективном нокауте, а о направленной вставке в таргетный разрыв, можно ожидать тоже повышенной эффективности интеграции, но у процесса направленной интеграции эффективность повышать глупо, гораздо умнее - повышать в те самые 10 раз специфичность, когда вставка вставляется РОВНО в 1 место. Если раньше над этим бились месяцы и годами, то сейчас это станет вполне возможно делать с гораздо меньшего числа попыток, поскольку теперь единственность точки разрыва можно гарантировать, если это нужно. геич у нас пцр на коррнавирус отправляют из Москвы в Новрсиб |
zzz5 Участник |
(NMR-guy @ 11.07.2018 12:12) Этот инструмент в десятки раз ускоряет протоколы направленного нокаута генов, поскольку повышает специфичность таргетинга раз в 1000 (по сравнению с библиотечными цинковыми пальцами), а эффективность (количество успешных нокаутных клонодающих клеток) раз в 10, с единиц процентов до десятков процентов. В перспективе, если речь идёт не о селективном нокауте, а о направленной вставке в таргетный разрыв, можно ожидать тоже повышенной эффективности интеграции, но у процесса направленной интеграции эффективность повышать глупо, гораздо умнее - повышать в те самые 10 раз специфичность, когда вставка вставляется РОВНО в 1 место. Если раньше над этим бились месяцы и годами, то сейчас это станет вполне возможно делать с гораздо меньшего числа попыток, поскольку теперь единственность точки разрыва можно гарантировать, если это нужно. геич ваамщето зависит из какой жопы ручонки растут |
zzz5 Участник |
|
zzz5 Участник |
(zzz5 @ 03.03.2020 13:11) |
zzz5 Участник |
(zzz5 @ 03.03.2020 13:19) лысый дениска махает кеглями |
zzz5 Участник |
(zzz5 @ 03.03.2020 13:19) |
zzz5 Участник |
(zzz5 @ 03.03.2020 13:19) |
zzz5 Участник |
(zzz5 @ 03.03.2020 13:22) |
zzz5 Участник |
(zzz5 @ 03.03.2020 12:22) Совещание состоялось в Москве через шесть недель после того, как научный журнал Nature опубликовал статью с критикой деятельности российского биолога Дениса Ребрикова, который анонсировал эксперимент по программированию человеческих генов, отмечает агентство. |
guest: 123 IP-штамп: frbVX8mAyKHGA гость |
а разве HeLa уже разрешили? Тем более она и ретро контаминирована |
zzz5 Участник |
а разве HeLa уже разрешили? Тем более она и ретро контаминирована [/quote] Тем более она и ретро контаминирована [/quote] ваамщето хнлена лрв умноола от карциномы шейки мантеи HPV18 |
zzz5 Участник |
(guest: 123 @ 03.03.2020 14:04) |
zzz5 Участник |
(guest: 123 @ 03.03.2020 14:04) если только прсмертно |
zzz5 Участник |
(guest: 123 @ 03.03.2020 14:04) как позитивный контроль на HPV18 да |
zzz5 Участник |
(zzz5 @ 03.03.2020 14:17) международно |
zzz5 Участник |
(guest: 123 @ 03.03.2020 14:04) |
zzz5 Участник |
(guest: 123 @ 03.03.2020 14:04) Introduction In 1951, Gey et al. isolated the cancer tissue from Henrietta Lacks, a woman with cervical cancer, and established the HeLa cell line in vitro, which was the first human-derived immortalized cell line [1]. In the next sixty plus years, HeLa became the most wildly used cell line in biomedical research, and produced results for more than 70,000 publications (searched from PubMed). |
zzz5 Участник |
(guest: 123 @ 03.03.2020 14:04) 123 нихера не понял сама Генриетта Лакс ретроконтаминирована или HeLa |
zzz5 Участник |
(guest: 123 @ 03.03.2020 14:04) от многих сексов много печалей |
zzz5 Участник |
(guest: 123 @ 03.03.2020 14:04) Introduction In 1951, Gey et al. isolated the cancer tissue from Henrietta Lacks, a woman with cervical cancer, and established the HeLa cell line in vitro, which was the first human-derived immortalized cell line [1]. In the next sixty plus years, HeLa became the most wildly used cell line in biomedical research, and produced results for more than 70,000 publications (searched from PubMed). Since the establishment, the HeLa cells had undergone multiple generations of propagations. HeLa cells have derived more than 300 progeny strains utilized in many fields of life sciences. The HeLa-S3 cell line was separated from HeLa-CCL2 in 1955 [2], and the HeLa-Kyoto was isolated in 1980s by Narumiya of Kyoto University, Japan. HeLa-S3 can grow as suspension cultures, and is widely used in the field of cytology. The morphology of HeLa-Kyoto is more favorable for imaging, and there are massive progeny cell lines derived from it that are transfected with different fluorescent proteins. However, the most widely used and distributed HeLa cells are HeLa-CCL2 which is considered to be the direct progeny of the original HeLa cells. Although it has long been observed by cell biologists that HeLa cells are quite abnormal and heterogeneous, containing high aneuploidy and variable chromosomal organizations, the whole genome landscapes of HeLa cells were only described recently after NGS (next-generation sequencing) became prevailing in 2013 [3, 4]. These studies have established accurately the aneuploidy and genomic heterogeneity of the HeLa cells and shown that HeLa was in average hypertriploid (3n+), which is consistent with early G-Banding karyotype results [5]. These works revealed complex genomic landscapes of HeLa that displayed up to 30+ chromosome-level large fragment translocations, including over 2000+ fragments (>50 bp) translocations [3]. To understand the genomic and transcriptomic variability caused by culture conditions, Frattini et al. [6] compared 4 different HeLa-CCL2 strains that were cultured in 4 different laboratories. Alarmingly, the results suggested that the same experiment performed on the HeLa cells cultured in different labs could lead to distinct conclusions and irreproducible results. Similar observations were made in some breast cancer cell lines [7]. Tumor heterogeneity refers to the fact that different cancer cells display signifiant differences in phenotype, methylation status, transcriptome, and particularly genome. Intratumor heterogeneity results from chromosomal instability [8–10], which can lead to somatic mutations, ranging from single nucleotide variations (SNVs) to chromosome structure changes, such as copy number variations (CNVs) and even to larger changes at the entire chromosome level. Intratumoral heterogeneity consists of both spatial heterogeneity and temporal heterogeneity. In the study of the primary kidney tumor, Gerlinger et al. [9] constructed a phylogenetic tree of tumors and pointed out that targeted treatment based on primary tumor biopsy results may not be effective in treating metastases. All in all, tumors display a complex dynamic ecosystem. The internal tumor heterogeneity, consisting of a large number of mutations and chromosomal changes, initiates and promotes cancer evolutionary processes. Conventional high-throughput (HTP) sequencing already has a tremendous impact on the field of biomedical research. In this method, it is necessary to obtain enough DNA or RNA from a large number (typically millions) of cells for sequencing, and the sequencing results are the averaged representation of all these cells. However, due to cellular heterogeneity, particularly for cancer cells, there might be significant genetic differences in these cells. Moreover, low-abundance changes would be easily lost in the overall averaged characterization. As for the whole genome single-cell DNA sequencing (scDNA-seq), the priority and difficulty was to develop the whole genome amplification (WGA) technology owing to the fact that the amount of intracellular DNA is extremely small (only one copy of DNA for haploids and two copies for diploids; a human diploid cell typically contains 6 pg of genomic DNA). The WGA technology has undergone quite a few technological changes: first appeared in chronological order was a WGA method based on polymerase chain reaction (PCR) in 1992, such as primer extension pre-amplification PCR (PEP-PCR) [11] and degenerate oligonucleotide primed PCR, (DOP-PCR) [12]; but PCR-based methods suffer from enormous exponentially amplified regions that can cause non-linear amplification bias. WGA based on constant temperature reaction, such as multiple displacement amplification (MDA) could largely overcome non-linear amplification bias [13]. Later in 2012, the other development with WGA was multiple annealing and looping-based amplification Cycles (MALBAC) [14]. He et al. [15] assessed the performance of MDA and MALBAC for β-thalassemia genotyping and single-nucleotide polymorphism (SNP) / CNVs detection. When performing CNVs detection at the single cell level, they found that MALBAC has better stability than MDA. To compensate for the limitations of conventional NGS sequencing, single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) technology has been developed during the past 10 years [16]. Faithful single-cell sequencing could reveal the degree of variation among individual cells. Tang et al. has taken the lead on the development of HTP scRNA-seq in 2009 [16] based on previous single-cell microarray techniques [17, 18]. In 2012, SMART-Seq (Switching mechanism at 5’ end of the RNA transcript sequencing) [19] came out and became a robust method for full-length mRNA sequencing. An updated version of this technique, SMART-Seq2, was published in 2014 [20]. Later, Tang [21] modified SMART-Seq2 with the introduction of a specific reverse transcription primer, which was a 25 nt oligo (dT) primer anchored with an 8 nt (nucleotide) cell-specific barcode and 8 nt unique molecular identifiers (UMIs) [22–25]. This protocol detected the 3’end of mRNA and made it more high-throughput, accurate and cost effective. Current researches on the extremely heterogeneous HeLa cells have set the landscapes of HeLa cell karyotyping, genomic and transcriptomic diversities on the bulk sequencing level. Studies on HTP whole genome sequencing of HeLa cell lines at single-cell level have never been published to our knowledge. In this work, we performed scDNA-seq and scRNA-seq on 20 and 720 HeLa-CCL2 cells, respectively. We aimed to test the idea if we can construct a heteroploidy map by CNVs detection performed by scDNA-seq and build subtype classification of HeLa-CCL2 cells by different gene expression through scRNA-seq. Go to: Materials and methods 2.1 Ethic statement |
zzz5 Участник |
(guest: 123 @ 03.03.2020 14:04) ксли нет прямой ссылки на Генриетту Лакс то не запрещано |
zzz5 Участник |
(zzz5 @ 03.03.2020 15:31) вопрос о сохранности личных данных |
Asterix Постоянный участник |
From:William J. Bellini, Ph.D. Molecular Analyses. RNA extracts were prepared from 100 μl of each specimen (or culture supernatant) withthe automated NucliSens extraction system (bioMérieux). Oligonucleotide primers used for amplification and sequencing of the SARS-related coronavirus were designed from alignments of open reading frame 1b of the coronavirus polymerase gene sequences obtained from GenBank, including human coronaviruses 229E and OC43 (accessionnumbers X69721 and AF124989, respectively), canine coronavirus (AF124986), felineinfectious peritonitis virus (AF124987), porcine transmissible gastroenteritis virus(Z34093), porcine epidemic diarrhea virus (NC _003436), bovine coronavirus(NC_003045), porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus (AF124988),sialodacryoadenitis virus (AF124990), mouse hepatitis virus (NC_001846), turkeycoronavirus (AF124991), and avian infectious bronchitis virus (NC_001451). Primer pair (Broadly Reactive) IN-2 (+) 5'GGGTTGGGACTATCCTAAGTGTGA 3' and IN-4 (–) 5'TAACACACAACICCATCATCA 3' Previously designed to conserved regions of open reading frame 1b to achieve broad reactivity with the genus coronavirus. These primers were used to amplify DNA from SARS isolates, and the amplicon sequences obtained were used to design specific primers. SARS-specific primers: Cor-p-F2 (+) 5'CTAACATGCTTAGGATAATGG 3', Cor-p-F3 (+) 5'GCCTCTCTTGTTCTTGCTCGC 3', and Cor-p-R1 (–) 5'CAGGTAAGCGTAAAACTCATC 3', Used in turn to test patient specimens. Primers used for specific amplification of humanmetapneumovirus have been described previously. Well-characterized primer sets for other respiratory virus pathogens (unpublished data), including human respiratory syncytial virus, parainfluenza viruses 1, 2, and 3, influenzaviruses A and B, adenovirus, and picornavirus (rhinovirus and enterovirus), were also used to test clinical specimens in this study (primers available on request). All specimens were tested for humanglyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase to confirm RNA integrity and control for RT-PCR inhibition.One primer for each set was 5'-end-labeled with fluorescent dye 6-carboxyfluorescein (6-FAM) to facilitate GeneScan analysis. One-step amplification reactions were performed with the Access RT-PCR System (Promega) as previously described. Positive and negative RT-PCR controls, containing standardized viral RNA extracts, and nuclease-free water were included in each run. Amplified 6-FAM-labeled products were analyzed by capillary electrophoresis on an ABI 3100 Prism Genetic Analyzer with GeneScan software (version 3.1.2). Specimens were considered positive for SARS-associated coronavirus if the amplification products were within 1 nucleotide of the expected product size (368 nucleotides for Cor-p-F2 or Cor-p-R1 and 348 nucleotides for Cor-p-F3or Cor-p-R1) for both specific primer sets, as confirmed by a second PCR reaction from another aliquot of RNA extract in a separate laboratory. Where DNA yield was sufficient, the amplified products were also sequenced to verify the authenticity of the amplified product. |
zzz5 Участник |
(Asterix @ 03.03.2020 16:19) SARS-CoV Specific RT-PCR Primers From:William J. Bellini, Ph.D. Molecular Analyses. RNA extracts were prepared from 100 μl of each specimen (or culture supernatant) withthe automated NucliSens extraction system (bioMérieux). Oligonucleotide primers used for amplification and sequencing of the SARS-related coronavirus were designed from alignments of open reading frame 1b of the coronavirus polymerase gene sequences obtained from GenBank, including human coronaviruses 229E and OC43 (accessionnumbers X69721 and AF124989, respectively), canine coronavirus (AF124986), felineinfectious peritonitis virus (AF124987), porcine transmissible gastroenteritis virus(Z34093), porcine epidemic diarrhea virus (NC _003436), bovine coronavirus(NC_003045), porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus (AF124988),sialodacryoadenitis virus (AF124990), mouse hepatitis virus (NC_001846), turkeycoronavirus (AF124991), and avian infectious bronchitis virus (NC_001451). Primer pair (Broadly Reactive) IN-2 (+) 5'GGGTTGGGACTATCCTAAGTGTGA 3' and IN-4 (–) 5'TAACACACAACICCATCATCA 3' Previously designed to conserved regions of open reading frame 1b to achieve broad reactivity with the genus coronavirus. These primers were used to amplify DNA from SARS isolates, and the amplicon sequences obtained were used to design specific primers. SARS-specific primers: Cor-p-F2 (+) 5'CTAACATGCTTAGGATAATGG 3', Cor-p-F3 (+) 5'GCCTCTCTTGTTCTTGCTCGC 3', and Cor-p-R1 (–) 5'CAGGTAAGCGTAAAACTCATC 3', Used in turn to test patient specimens. Primers used for specific amplification of humanmetapneumovirus have been described previously. Well-characterized primer sets for other respiratory virus pathogens (unpublished data), including human respiratory syncytial virus, parainfluenza viruses 1, 2, and 3, influenzaviruses A and B, adenovirus, and picornavirus (rhinovirus and enterovirus), were also used to test clinical specimens in this study (primers available on request). All specimens were tested for humanglyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase to confirm RNA integrity and control for RT-PCR inhibition.One primer for each set was 5'-end-labeled with fluorescent dye 6-carboxyfluorescein (6-FAM) to facilitate GeneScan analysis. One-step amplification reactions were performed with the Access RT-PCR System (Promega) as previously described. Positive and negative RT-PCR controls, containing standardized viral RNA extracts, and nuclease-free water were included in each run. Amplified 6-FAM-labeled products were analyzed by capillary electrophoresis on an ABI 3100 Prism Genetic Analyzer with GeneScan software (version 3.1.2). Specimens were considered positive for SARS-associated coronavirus if the amplification products were within 1 nucleotide of the expected product size (368 nucleotides for Cor-p-F2 or Cor-p-R1 and 348 nucleotides for Cor-p-F3or Cor-p-R1) for both specific primer sets, as confirmed by a second PCR reaction from another aliquot of RNA extract in a separate laboratory. Where DNA yield was sufficient, the amplified products were also sequenced to verify the authenticity of the amplified product. плотнтник тыж обещал 100 ПакМанов |
zzz5 Участник |
(Asterix @ 03.03.2020 16:19) SARS-CoV Specific RT-PCR Primers From:William J. Bellini, Ph.D. Molecular Analyses. RNA extracts were prepared from 100 μl of each specimen (or culture supernatant) withthe automated NucliSens extraction system (bioMérieux). Oligonucleotide primers used for amplification and sequencing of the SARS-related coronavirus were designed from alignments of open reading frame 1b of the coronavirus polymerase gene sequences obtained from GenBank, including human coronaviruses 229E and OC43 (accessionnumbers X69721 and AF124989, respectively), canine coronavirus (AF124986), felineinfectious peritonitis virus (AF124987), porcine transmissible gastroenteritis virus(Z34093), porcine epidemic diarrhea virus (NC _003436), bovine coronavirus(NC_003045), porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus (AF124988),sialodacryoadenitis virus (AF124990), mouse hepatitis virus (NC_001846), turkeycoronavirus (AF124991), and avian infectious bronchitis virus (NC_001451). Primer pair (Broadly Reactive) IN-2 (+) 5'GGGTTGGGACTATCCTAAGTGTGA 3' and IN-4 (–) 5'TAACACACAACICCATCATCA 3' Previously designed to conserved regions of open reading frame 1b to achieve broad reactivity with the genus coronavirus. These primers were used to amplify DNA from SARS isolates, and the amplicon sequences obtained were used to design specific primers. SARS-specific primers: Cor-p-F2 (+) 5'CTAACATGCTTAGGATAATGG 3', Cor-p-F3 (+) 5'GCCTCTCTTGTTCTTGCTCGC 3', and Cor-p-R1 (–) 5'CAGGTAAGCGTAAAACTCATC 3', Used in turn to test patient specimens. Primers used for specific amplification of humanmetapneumovirus have been described previously. Well-characterized primer sets for other respiratory virus pathogens (unpublished data), including human respiratory syncytial virus, parainfluenza viruses 1, 2, and 3, influenzaviruses A and B, adenovirus, and picornavirus (rhinovirus and enterovirus), were also used to test clinical specimens in this study (primers available on request). All specimens were tested for humanglyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase to confirm RNA integrity and control for RT-PCR inhibition.One primer for each set was 5'-end-labeled with fluorescent dye 6-carboxyfluorescein (6-FAM) to facilitate GeneScan analysis. One-step amplification reactions were performed with the Access RT-PCR System (Promega) as previously described. Positive and negative RT-PCR controls, containing standardized viral RNA extracts, and nuclease-free water were included in each run. Amplified 6-FAM-labeled products were analyzed by capillary electrophoresis on an ABI 3100 Prism Genetic Analyzer with GeneScan software (version 3.1.2). Specimens were considered positive for SARS-associated coronavirus if the amplification products were within 1 nucleotide of the expected product size (368 nucleotides for Cor-p-F2 or Cor-p-R1 and 348 nucleotides for Cor-p-F3or Cor-p-R1) for both specific primer sets, as confirmed by a second PCR reaction from another aliquot of RNA extract in a separate laboratory. Where DNA yield was sufficient, the amplified products were also sequenced to verify the authenticity of the amplified product. |
Asterix Постоянный участник |
Published: 24 February 2020 Comparative genetic analysis of the novel coronavirus (2019-nCoV/SARS-CoV-2) receptor ACE2 in different populations |
zzz5 Участник |
(Asterix @ 03.03.2020 16:51) hmm , genetic bioweapon is getting more close to reality. Just look at those data... Wow.... Published: 24 February 2020 Comparative genetic analysis of the novel coronavirus (2019-nCoV/SARS-CoV-2) receptor ACE2 in different populations плотник посмотрю попозже леплю пелмени ты еще подруку |
zzz5 Участник |
(Asterix @ 03.03.2020 16:51) hmm , genetic bioweapon is getting more close to reality. Just look at those data... Wow.... Published: 24 February 2020 Comparative genetic analysis of the novel coronavirus (2019-nCoV/SARS-CoV-2) receptor ACE2 in different populations я убью тебя стрелочник итак пелмнени не клееятся а ты под руку со своим биотерроризмом |
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |