molbiol.ru -> Выделение ДНК из малых количеств материала

> Все форумы > Тематические форумы > Молекулярная и клеточная биология

Zbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ

Правила FAQ* Поиск* Участники* Календарь* Избранные темы* Форум Форумов*

Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ]

Форум:

* Выделение ДНК из малых количеств материала

Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.

XXL
Постоянный участник

07.04.2014 22:21

URL #1

Необходимо выделить ДНК и ПЦРить из мелких насекомых (1 мм размер). Само имаго должно остаться в коллекции, можно брать лапку, антенну. Как выделять? Какими наборами?

distemper
Постоянный участник

08.04.2014 03:11

URL #2

А вы попробуйте ту самую лапу или нтенну прямо в ПЦР кинуть и проциклить-может тогда вопросы отпадут сами-собой

Поблагодарили (1): XXL

XXL
Постоянный участник

08.04.2014 07:18

URL #3

(distemper @ 08.04.2014 04:11)

А может как то обработать предварительно, материал архивный, сухой, хитин всё таки....

distemper
Постоянный участник

08.04.2014 07:43

URL #4

ну носиком запаяным обработать

растолочь его помельче

XXL
Постоянный участник

08.04.2014 08:20

URL #5

(distemper @ 08.04.2014 08:43)

ну носиком запаяным обработать

растолочь его помельче

И сразу днк освободится от прочего мусора, что то маловероятно

distemper
Постоянный участник

08.04.2014 08:33

URL #6

ДНК освободится, но таки да, не от мусора. она освободится и станет доступной для фермента. если вам не библиотеку делать а просто фрагмент амплифицировать то этого будет вполне достаточно.
хотя может сейчас Ъ подтянется и все разЪяснит

Поблагодарили (1): XXL

Epsilon

Новосибирск

07.05.2014 12:38

URL #7

Не уверен, что Вам поможет, но мы недавно делали лизис клеток HEK293T на 96-ячеечных платах, там как раз мало материала и потери ДНК при переосаждении нежелательны. Мы делали так: убирали с клеток среду, сразу заливали лизирующий буфер: 10 mM Tris-HCl pH 8.0, 10 mM EDTA pH 8, 0.35% Igepal CA630, 0.35% Tween 20, 0.4 mg/ml proteinase K. Инкубировали 3 часа при 65 град. С. Полученный лизат использовали напрямую в ПЦР в разведении 1:30-1:40.

Думаю, в случае насекомых ключевым моментом будет гомогенизировать ткань. Попробуйте растирать пестиком в 1,5 мл пробирке, ну, или оплавленным носом, я слышал, люди растирают

Из целых насекомых мы когда-то давно выделяли ДНК для ПЦР с использованием высаливания белков.

Поблагодарили (1): XXL

Statin
Постоянный участник

07.05.2014 14:18

URL #8

(distemper @ 08.04.2014 08:43)

ну носиком запаяным обработать

растолочь его помельче

Ну а потом можно попробовать QIAamp DNA Micro Kit (Qiagen, Germany).

guest: ммм
IP-штамп: frwHRv5zEzGDY
гость

07.05.2014 14:20

URL #9

Вы ставили ПЦР с Протеиназой К? Она у вас Taq не сжирала?

Statin
Постоянный участник

07.05.2014 14:37

URL #10

(guest: ммм @ 07.05.2014 15:20)

Вы ставили ПЦР с Протеиназой К? Она у вас Taq не сжирала?

А действительно??

berm
Участник

07.05.2014 20:44

URL #11

Странно

где же Ъ

XXL
Постоянный участник

07.05.2014 23:05

URL #12

Спасибо, попробуем носиком растереть. Я скажу больше - насекомое 1 мм нужно оставить в коллекции, а для ПЦР можно тока ножку оторвать под бинокуляром. Думаю, растирать надо прямо в пробирке 0.2 мм

Epsilon

Новосибирск

08.05.2014 05:37

URL #13

(guest: ммм @ 07.05.2014 15:20)

Вы ставили ПЦР с Протеиназой К? Она у вас Taq не сжирала?

Да, ставили ПЦР напрямую с лизата, содержащего активную протеиназу К. Причём, как показала оптимизация, лучшие результаты ПЦР получались при существенном разведении лизата в ПЦР до 1:30-1:40, что в нашем случае соответствовало добавлению 6-8 нг геномной ДНК на одну ПЦР реакцию в 12,5 мкл. В то же время попытки прогреть лизат для инактивации протеиназы К приводили только к снижению эффективности последующей ПЦР.

Таким образом, на практике протеиназа К в указанных условиях проблемой не является.

guest: ммм
IP-штамп: frQlBxj4iQSg.
гость

08.05.2014 11:00

URL #14

400мкг на мл после разведения в 40 раз дадут 10мкг, а 50-100 это рабочая концентрация для супа из белков, а не для одинокого Taq'a. Я счас не занимался специальным поиском, но сдается мне что инактивация протеиназы нагреванием до 100^o вещь весьма и весьма обратимая. Так что то? что нагрев не помог не удивительно. А вот то что у вас ПЦР прошел я думаю может быть связано только с тем, что у вас протеиназа самоедством инактивировалась. Для колличественных оценок я бы поостерегся таким методом пользоваться.

Epsilon

Новосибирск

08.05.2014 11:24

URL #15

(guest: ммм @ 08.05.2014 12:00)

Для колличественных оценок я бы поостерегся таким методом пользоваться.

guest: ммм, да, разумеется, речь идёт о качественном, а не количественном анализе. А моя фраза, что протеиназа К не является проблемой, пожалуй, слишком грубо сформулирована. Правильнее сказать, что по факту обычная ПЦР идёт, но количественных данных о сохранности Taq-полимеразы у нас нет.

Вообще, конечно, интересно, каким образом модифицировать метод, чтобы он подошёл для использования с реал-тайм ПЦР?..

Преимущество описанного метода ПЦР напрямую с лизата только в дешивизне, низких потерях ДНК и возможности обрабатывать параллельно 96 образцов. Это я к тому, что если Вы знаете лучший метод выделения ДНК, я буду очень рад узнать о нём

watchesbiz
Постоянный участник

03.12.2021 17:07

URL #16

http://replicarolexwatches.simpsite.nl/
https://www.smore.com/rj7kh-best-replica-watches
https://www.athleticsnation.com/users/Replicarolexwatches
https://pastebin.pl/view/ab0e458a
https://mix.com/watcheshutukcom
https://www.woddal.com/post/359216_tiny-acc...nybody-039.html
https://share.naturalnews.com/posts/3904099
https://demo.wowonder.com/post/214429_the-i...-producers.html
https://rapichat.com/post/5369_our-purpose-...ible-there.html
https://dashburst.com/replicarolexwatches/1
https://sway.office.com/KifcQvn36MK821G8
https://flipboard.com/@replicarolex24
https://getpocket.com/redirect?url=https%3A...eshut.uk.com%2F
https://www.openstreetmap.org/user/Hints%20...20Rolex%20Watch

watchesonline89
Постоянный участник

28.12.2022 10:50

URL #17

https://omegawatches89.mystrikingly.com/
https://www.deviantart.com/omegawatches89/j...pular-930508248
https://eatsleepride.com/c/383270
https://fortunetelleroracle.com/fashion/ama...s-online-737627
https://www.intensedebate.com/people/omegawatches89
https://fortunetelleroracle.com/fashion-acc...-popular-737613
https://anotepad.com/notes/ykiydhnj
https://medium.com/@omegawatches89/amazing-...ne-b4863ed55af0
https://omegawatches90.mystrikingly.com/
https://62e8ce2ae5d50.site123.me/blog/repli...ve-items-online
https://62e8da780bf7c.site123.me/
https://padlet.com/omegawatches89/9ibenzfwbcer7k71
https://omegawatches89.simplesite.com/452939012
https://62e8da780bf7c.site123.me/blog/excit...-replica-online
https://62e8ce2ae5d50.site123.me/blog/advan...replica-watches

Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.

Имя:

Отправка сообщений использует JavaScript операции. В вашем броузере не
установлено/отключено выполнение JavaScript программ. Используйте Netscape Navigator
или Internet Explorer (не ранее 3 версии); убедитесь, что выполнение JavaScript
программ разрешено в настройках вашего броузера.