 * |   |
|
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда |  Zbio-wikiNG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: |
|
Правила
* Задачка -- что сей сон значит? --
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.
   |
 ВераПостоянный участник  |
 16.07.2013 14:17
У меня вопрос, уже не имеющий практического смысла. Но меня на нем заклинило чисто теоретически - я уже несколько месяцев голову ломаю, как такое может быть. Если у кого-то есть идеи - поделитесь, пожалуйста. Делала стандартный конструкт для экспрессии белка в E.coli. Вектор из серии рЕТ, вставка под два разных сайта рестрикции (т.е. проблем с ориентацией быть не должно), все стандартно и примитивно. Лигирование идет хорошо, делаю ПЦР с клонов. Имеется 4 праймера: T7for, T7rev, соответственно вставка-for и вставка-rev. Для того, чтоб одним махом определиться и с вектором, и со вставкой - беру пару T7for - вставка-rev. И не вижу ничего от слова "совсем". Перебрав кучу клонов. Все выбрасываю, проверяю вектор, вставку, лигазу и все что еще можно проверить, переделываю лигирование - все аналогично. Нету. В третий раз чисто для разнообразия беру пару вставка-for и T7rev. Нахожу много клонов. Почти все. Возвращаюсь к первому варианту - продукта НЕТ! Думаю, что что-то неладно с олигами. Для того, чтоб выяснить, какой олиг протух, T7for или реверс-вставка - делаю пару T7for-T7rev. Вставка есть. В смысле, продукт нужной длины. Делаю пару вставка-for и вставка-rev. Сильно подозревая, что протух праймер вставка-реверс. Не тут-то было! Вставка на месте и нужной длины! Передаю все это в руки хоть более молодой, но более опытной в плане клонирования сотруднице. Она тоже сгоряча первый опыт выбрасывает в раковину, но потом, умница, сдает на сиквенс. Невзирая на. И получает идеальный продукт, в котором есть нужный вектор, вставка и все места для праймеров. Всех четырех. После чего мы на все забиваем, делаем индукцию, белок прет со страшной силой, белок нужный, на нем уже померено все, что хотели померить... В общем, задачу решили. В практическом смысле: имеется продуцент и индуцируется нужный белок. Но пара T7for - вставка-rev по-прежнему дает пустой ПЦР. ВСЕГДА. Вроде уже природа этого явления практического значения не имеет. Но заклинило. У кого-нибудь были подобные истории? Могут быть этому какие-то не слишком антинаучные объяснения, отличные от формулировок "карма", "барабашка", или, как говаривал один мой покойный коллега: "оно ж живое!" 
|
|
Tom1 Постоянный участник |
16.07.2013 16:52
|
|
R.J. Dio Постоянный участник |
16.07.2013 17:04
|
|
distemper Постоянный участник |
17.07.2013 07:59
(R.J. Dio @ 16.07.2013 15:04)  вариант такой- вы проверьте на работоспособность эти праймеры в паре, возможно, они "бомбят", то есть дают праймер-димер. Поскольку Т7-rev сам по себе слабенький и говеный по структуре, затруднить ПЦР с ним много ума не надо. Просто посмотрите на залипание глазками, вдруг криминал какой увидите. К тому же, ПЦР с клонов труднее, чем с чистой плазмиды, так что поставьте, не поленитесь, с плазмиды вашей рабочей все мыслимые варианты, убедитесь, что данная конкретная пара не работаетдобавить практически нечего. были те же грабли, вот один в один, в итоге клоны скринировал Т7-Т7 праймерами, белка вагон, хоть на маркеры пускай  Сообщение было отредактировано distemper - 17.07.2013 07:59 |
|
R.J. Dio Постоянный участник |
17.07.2013 11:12
|
|
watchesbiz Постоянный участник |
 06.12.2021 16:58
|
|
watchesonline89 Постоянный участник |
28.12.2022 12:02
|
| « Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |
 |
· Викимарт - все интернет-магазины в одном месте · Доска объявлений Board.com.ua ·
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---
Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Powered by Invision Power Board(Trial) v2.0.0 © 2024 IPS, Inc.