Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
Eastern Wanderer Казань |
Мне необходимо ввести метку в ДНК (думаю С) для проведения анализа ЭПР. есть нативная ДНК человека. подскажите, пожалуйста, процедуру введения метки. возможно метить другим элементом или соединением. в статье одной применяли azide-alkyne. |
guest: ммм IP-штамп: frQlBxj4iQSg. гость |
Вы хотите ввести радиоактивную, изотопную(например с нечетным числом протонов С13, спиновую, флуоресцентную или наконец любую хоть какую химическую метку? |
Eastern Wanderer Казань |
(guest: ммм @ 18.02.2013 14:48) Вас интересует конкретная последовательность ДНК или ДНК вообще? Вы хотите ввести радиоактивную, изотопную(например с нечетным числом протонов С13, спиновую, флуоресцентную или наконец любую хоть какую химическую метку? для ЭПР анализа необходимо ввести в ДНК металл с неспаренными электронами либо нитроксильный радикал. Лучше последнее, но конкретно методику пока не могу найти (пошаговое описание с количеством веществ и условиями) |
Eastern Wanderer Казань |
(Eastern Wanderer @ 18.02.2013 16:29) для ЭПР анализа необходимо ввести в ДНК металл с неспаренными электронами либо нитроксильный радикал. Лучше последнее, но конкретно методику пока не могу найти (пошаговое описание с количеством веществ и условиями) интересует ДНК вообще, конкретная последовательность не принципиальна |
guest: ммм IP-штамп: frQlBxj4iQSg. гость |
ДНК берем любую. Для мечения нужно аминоалил dUTP и набор для ник трансляции И самое главное нитрозоароматика, химически активированная для взаимодействия с первичной аминогуппой(например паранитрозо фенилизотиоцианат или гидроксисукцинимидный эфир паранитрозобензойной кислоты. Соединения взяты от балды так, что не нужно бросаться их искать в каталогах). Вот где взять такое производное сказать не могу, но по идее они должны существовать для введения спиновых меток по аминогруппам лизина в белки. Алгоритм такой: берем любую ДНК хоть из спермы лосося, хоть из кишечной палочки. Включаем в нее аминалил dUTP с помощью кита(можно и без кита, там всего то ДНКаза и ДНК полимераза и набор dNTP(нуклеотид трифосфатов), но нужно будет подбирать концентрацию ДНКазы.) Как в протоколе к киту написано. Затем переводим ДНК в буфер для меченья. Опять возможны варианты: например с помощью силка колонок или диализом, или гельфилтрацией на сефадексе Г25 или обработкой фенол хлороформом и переосаждением спиртом и затем растворением в нужном буфере. Буфер для меченья - это буфер не содержащий первичных аминогрупп(например трис недопустим) и имеющий рН 8.5-9 можно использовать борат или карбонат. Следующий этап это добавление вышеуказанной модифицированной(активированной) метки. Метку обычно добавляют в многократном избытке по отношениию к аминогруппам аминоалила. При ник трансляции включается примерно 30-70% букв Т с аминоалил группами. Подержать метку с ДНКой 1-2ч на комнате и опять почистить ДНК(как перед переводом в буфер для меченья, можно даже просто спиртом переосадить.) все! |
Eastern Wanderer Казань |
(guest: ммм @ 18.02.2013 17:12) Тогда предлагаю следующий вариант. ДНК берем любую. Для мечения нужно аминоалил dUTP и набор для ник трансляции И самое главное нитрозоароматика, химически активированная для взаимодействия с первичной аминогуппой(например паранитрозо фенилизотиоцианат или гидроксисукцинимидный эфир паранитрозобензойной кислоты. Соединения взяты от балды так, что не нужно бросаться их искать в каталогах). Вот где взять такое производное сказать не могу, но по идее они должны существовать для введения спиновых меток по аминогруппам лизина в белки. Алгоритм такой: берем любую ДНК хоть из спермы лосося, хоть из кишечной палочки. Включаем в нее аминалил dUTP с помощью кита(можно и без кита, там всего то ДНКаза и ДНК полимераза и набор dNTP(нуклеотид трифосфатов), но нужно будет подбирать концентрацию ДНКазы.) Как в протоколе к киту написано. Затем переводим ДНК в буфер для меченья. Опять возможны варианты: например с помощью силка колонок или диализом, или гельфилтрацией на сефадексе Г25 или обработкой фенол хлороформом и переосаждением спиртом и затем растворением в нужном буфере. Буфер для меченья - это буфер не содержащий первичных аминогрупп(например трис недопустим) и имеющий рН 8.5-9 можно использовать борат или карбонат. Следующий этап это добавление вышеуказанной модифицированной(активированной) метки. Метку обычно добавляют в многократном избытке по отношениию к аминогруппам аминоалила. При ник трансляции включается примерно 30-70% букв Т с аминоалил группами. Подержать метку с ДНКой 1-2ч на комнате и опять почистить ДНК(как перед переводом в буфер для меченья, можно даже просто спиртом переосадить.) все! большое спасибо. все четко объяснили. |
guest: ммм IP-штамп: frQlBxj4iQSg. гость |
|
abdula Постоянный участник |
(guest: ммм @ 20.02.2013 22:52) Ну не совсем четко, ибо импровизировал немного. Я посмотрел наиболее популярные спиновые метки ориентированы на Ш-группы белков. Но это не беда. Полученные как описано раньше НХ2 -группы на ДНК можно превратить в Ш, с помощью еще одного метода модификации специальным реагентом Траутьа, только ДНК надо будет еще раз почистить от амино алил дУТП перед этим любым из выше предложенных методов. |
Asmadei |
|
nigoal123 IP-штамп: fr/1ZkUsuBQOE гость |
it sets the tone for |
guest: 123 IP-штамп: frJhOCvSv9ICE гость |
|
123goal 123goal Постоянный участник |
|
123goal 123goal Постоянный участник |
|
Ufa1688 Постоянный участник |
|
Ufa1688 Постоянный участник |
|
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |